Особенности кислотного и ферментативного гидролиза крахмала Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

14. ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ,№ 3-4, 1994

развития бактерий была выражена примерно одинаковыми кривыми, аналогичными кривым в КПБ.

Рис. 3

Через 8-10 ч после начала инкубации число клеток достигало максимума, 10 —5- 10 в 1 см , койечное значение pH 4,75-4,8. Процесс спорообразования клеток в культуре, растущей в трех видах консервов, имел те же стадии, что и процесс размножения. Наиболее интенсивное спорообразование происходило в конце логарифмической и начале стационарной фазы роста. Максимальное число спор в пюре было невысоким — 1-4% к общему числу клеток.

Развитие Вас. 51еаго1НегторЫ1и.$ в Супе-пюре мясоовощном с томатом отличалось специфическими особенностями. Рост числа клеток начинался после длительной^ до 15 ч, задержки и заканчивался быстро, через 4 ч. Максимальное число клеток было ниже, чем Зв других видах консервов, — 5,0-10 на 1 см . В популяции спорулировала незначительная часть клеток —- около 0,1%.

Таким образом, Суп-пюре мясоовощной с томатом — менее благоприятная среда для развития термофильных бацилл, чем другие виды консервов, что связано, по-видимому, с его повышенной кислотностью.

Изучали также возможность развития спор Вас. 51еаго1кегторШ1и5 во всех исследуемых консервах при 37, 20 и о С. В процессе хранения происходило постепенное отмирание спор, которое практически не зависело от вида консервов и штамма бактерий. При 37°С процесс отмирания происходил более интенсивно, чем при 20 и 5”С. Через 1,5 года хранения пюре при 20 и 5’С число жизнеспособных спор составляло 25-50 в 1 см , при 37°С

сохранились единичные споры. После трех лет хранения в пюре оставались единичнь’е жизнеспособные споры Вас. з1еаго1кегторЫ1ш, однако порчи консервов не было.

ВЫВОДЫ

1. Оптимальными стационарными условиями развития бактерий Вас. 51еаготегторЫ1и$ — возбудителей «плоского скисания» консервов — в КПБ являются температура 55-60°С и pH 8,5-8,7. Эти параметры рекомендованы для методики выявления термофильных бацилл в консервном производстве.

2. Процесс образования спор в клетках культуры Вас. $1еаго1НетторЫ1и5, растущей в КПБ, наиболее активен при 55-60°С. При 45, 65, 70°С спору-лирует незначительная часть клеток. Кривая спорообразования характеризуется четырьмя основными стадиями — лагфаза, экспоненциальная, стационарная, отмирания.

3. Развитие Вас. $1еаго1кегторкИиз в консервах для детского питания Суп-пюре овощной, Суп-пюре из печени с рисом, Г1юре из моркови с рисом при 55-60°С происходит аналогично развитию культуры в КПБ, вызывая их прокисание. Консервы Суп-пюре мясоовощной с томатом более устойчивы к этому виду порчи благодаря повышенной кислотности.

4. Температура хранения консервов при 20°С надежно предохраняет их от «плоского скисания», возникающего вследствие развития облигатно-тер-мофильных бацилл. Высокая кислотность консервов (pH 5,0) также предотвращает этот тип порчи.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мазохнна Н.Н., Найденова Л.П., Николаева С.А., Розанова Л.И. Анализ и оценка качества консервов по микробиологическим показателям. —-М.: Пищевая пром-сть, 1977. — 470 с.

2. Кизилова Л.А., Озерянская Е.И. Термофильные бактерии, вызывающие прокисание консервов для детского питания: Обзор. М., 1971. — 47 с.

3. Логинова Л.Г., Головачева Р.С., Головина И.Г., Егорова Л.А., Позмогова И.Н., Хохлова Ю.М., Цаплина И.А. Современные представления о термофилии микроорганизмов.— М.: Наука, 1973. — 274 с.

Лаборатория микробиологических исследований

Поступила 10.08.92

547.458.61:66.093.8

ОСОБЕННОСТИ КИСЛОТНОГО И ФЕРМЕНТАТИВНОГО

ГИДРОЛИЗА КРАХМАЛА

Н.А. ЖЕРЕБЦОВ, И.Д. РУАДЗЕ Воронежский технологический институт

Кислотный и ферментативный гидролиз крахмала — важнейшая технологическая операция на пищевых предприятиях, перерабатывающих крахмалосодержащее сырье. Но специфика производства заставляет отдавать предпочтение одному из

них: на крахмало-паточных заводах при получении патоки, пищевой и кристаллической глюкозы в основном используют кислотный гидролиз и менее распространены ферментативный и комбинированный (кислотно-ферментативный). Напротив, в производстве пива, спирта широкое применение получил ферментативный гидролиз крахмала.

/'

Це.

спещ

СТВО 1

Исі

СТЬЮ

В 20' кислс зовал ре. В щие і СГ{\ ческу И ПЄ|

опред

Прі

20%-

ризон

subtil

BH0C1-

виде ед. аи глкш ленн( осущі 4,7. С дазнь: . На крахм ствук ( кри! Вт

а

ионов При 1 рен да кажда ющий лизат< Н -ио ветви Мага получі 1,10. кювет

\

1994

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 3-4, 1994

15

; лет еспо-I пор-

иями ■ воз-— в

-8,7. 1 вы-про-

туры

зибо-

юру-

спо-

:нов-

ьная,

грвах

1-ПЮ-

исом

итию

нсер-

стои-

нной

20°С

шя»,

>-тер-

нсер-

эрчи.

С.А.,

JOB по пром-

бакте-►ГО пи-

, Его-мика кроор-

093.8

ении 13Ы в іенее іиро-ив, в

[ЄНИЄ

Цель работы — дать теоретическое объяснение специфике различий, определяющих выход и качество продукта обоих способов гидролиза.

Использовали кукурузный крахмал с влажностью 13%, содержанием золы 0,2 и протеина 0,8%. В 20%-ную суспензию крахмала вносили серную кислоту до pH 1,10 и 0,85; суспензию клейстери-зовали и гидролизовали при различной температуре. В процессе гидролиза определяли редуцирующие вещества РВ по глюкозе и степень гидролиза СГ (% от количества исходного крахмала), оптическую плотность гидролизата Д — по методу [ 1 ] и пересчитывали на 100 г сухих веществ СВ, определяемых рефрактометрически.

При ферментативном гидролизе использовали 20%-ную суспензию того же крахмала. Ее клейсте-ризовали, разжижали при 70°С а-амилазой Вас. subtilis. В подготовленный таким образом субстрат вносили глюкоамилазу Asp. awamori ВУД Т-2 в виде препарата глюкоаваморина ПЮх в расчете 2 ед. активности на 1 г крахмала (1 ед. активности глюкоамилазы соответствует 1 г крахмала, расщепленного за 1 мин при 30°С и pH 4,7). Гидролиз осуществляли при различной температуре и pH

4,7. Определяли количество глюкозы глюкозоокси-дазным методом и Д.

На рис. 1 представлена динамика гидролиза крахмала при pH 1,10 (кривые /, 3, 5, соответствующие температурам 100, 127, 135°С) и 0,85 ( кривые 2, 4, 6 соответственно). +

Видно, что температура и концентрация Н -

ионов играют важную роль в скорости гидролиза. При 100°С профиль кривых плавный, он характерен для реакции первого порядка. При 127 и 135°С каждая из кривых имеет экстремум, характеризующий максимальное содержание глюкозы в гидро-л^зате. Чем выше температура и концентрация Н -ионов, тем круче восходящая и нисходящая ветви кривых, тем ниже положение экстремума. Максимальная степень гидролиза крахмала была получена после 75 мин гидролиза при 127°С и pH 1,10. Зависимость Д (на 100 г СВ при длине кюветы I = 1 см) от температуры при pH 1,10

(кривая /) и от pH при 127°С (кривая 2) представлена на рис. 2.

Снижение РВ в гидролизате находится в корреляционной зависимости с Д гидролизата ^рис. 2): чем выше температура и концентрация Н -ионов, тем интенсивнее возрастает Д гидролизата. Ины-

Рис. 2

ми словами, на интенсивность распада глюкозы с образованием продуктов деструкции с хромафор-ными группами оказывают влияние как тепловая энергия, так и Н -ионы среды. По-видимому, образование глюкозы и ее разложение под действием этих жестких физико-химических факторов представляют собой сопряженные процессы: с увеличением концентрации глюкозы в гидролизате растет и скорость ее деструкции. В экстремумах на кривых скорость обоих процессов одинакова, затем скорость гидролиза уменьшается в соответствии с реакцией первого порядка, а скорость деструкции глюкозы становится выше скорости ее образования: при 135”С и pH 1,10 в экстремуме СГ — 86%; при той же температуре и pH 0,85 — 82%; при 127°С и pH 1,10 — 91,5%.

Методом математического планирования эксперимента [2] мы оптимизировали условия процесса кислотного гидролиза крахмала с целью получения максимального выхода глюкозы.

Оптимальными оказались условия при концентрации крахмала 20% и pH 1,10, температуре 130°С, продолжительности гидролиза 75 мин — СГ 91,5%. Этот режим гидролиза близок к описываемому кривой 3 на рис. 1. Зависимость СГ крахмала глюкоамилазой (концентрация 20%, дозировка 2 ед/г крахмала) от температуры гидролиза 50, 60, 65 и 50°С (нативный крахмал) представлена кривыми /, 2, 3 и 4 соответственно (рис. 3). Она существенно отличается от динамики кислотного

16

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ,№ 3-4, 1994

основание. Однако в одном и том жег растворе невозможно создавать одновременно высокие концентрации обоих компонентов, поскольку они нейтрализуют друг друга. При кислотном гидролизе крахмала катализ осуществляете^ односторонней электрофильной атакой ионов Н на атом кислорода а-1,4-глюкозидной связи в молекуле крахмала.

Механизм разрыва этой связи представлен на рис. 4 а. Атом кислорода обладает в ней большим отрицательным индукционным эффектом и имеет

-М+

Рис. 3

гидролиза. Если последний идет в жестких условиях и имеет четко выраженные экстремумы, то ферментативный гидролиз протекает в мягком режиме (pH 4,7|И относительно низкая температура), причем СГ дЬстигает определенного предела, выходящего на плато. Оптимальная температура максимального выхода глюкозы — 60*С; степень гидролиза крахмала при ней достигает 98,5%. При 65°С скорость гидролиза крахмала в начальный период выше, однако затем она снижается в связи с термической инактивацией фермента; при этой температуре СГ крахмала достигла лишь 80%. Существенно снижалась скорость гидролиза крахмала при 50°С. Ферментативный гидролиз крахмала более длительный, чем кислотный, однако его мягкий режим не приводит к разрушению глюкозы. Во всех трех температурных режимах Д гидролизата не увеличивалась.

При определении рационального режима ферментативного гидролиза крахмала воспользовались методом математического планирования эксперимента. Для СГ 98,5% (концентрация крахмала 20%, дозировка глюкоамилазы 2 ед/г крахмала, температура 60°С ) продолжительность гидролиза оказалась равной 48 ч.

Сопоставление рациональных режимов кислотного и ферментативного гидролиза крахмала свидетельствует, что жесткость кислотного гидролиза приводит к снижению выхода глюкозы в связи с ее разрушением; ферментативный гидролиз идет в мягком режиме, выход глюкозы выше, гидроли-зат более высокой степени чистоты, однако он более длителен и требует использования дорогостоящего препарата глюкоамилазы.

Какова причина столь разительного отличия режимов кислотного и ферментативного гидролиза крахмала? Любая реакция, идущая с разрывом ковалентных связей, предполагает участие двух противоположных по характеру электронных компонентов. Электроны разрываемой связи должны стягиваться к одному компоненту и уходить от другого. Реагенты, которые могли бы осуществить такую электронную перестройку, — это кислота и

—ФчН н й-1

... Г V

—0чн Ч /---- —^ у— НО—Н

ОН НО

с а с” н+И»

-\Н пЛ = > +(? н :

СО О н

- -С00' й*йи ЩІІІ I ^ 1111)1 Л л лил

н

С 00

4г1:

но

Км

соо

ГГГГШІ

Рис. 4а, 46

большую электронную плотность, чем атом углерода. Снижение плотности электронного облака у атома С] связано также с индукционным воздействием атома кислорода пиранозного кольца глюкозы. Это и является причиной электрофильной атаки ионом Н атома кислорода и разрыва связи С1—О; штриховые и пунктирные линии схемы говорят о перераспределении электронной плотности и об исчезновении перекрытия электронных орбит между С1 и О. О том, что действительно идет разрыв связи С1—О свидетельствуют опыты с НгО [3]. Аналогичный механизм может быть предложен и в случае расщепленияа-1,б-глюкозид-ной связи — второй связи в молекуле крахмала — амилопектиие.

Таким образом, причиной жестких условий кислотного гидролиза является односторонняя элект-рофильная атака ионов Н на глюкозидные связи в молекуле крахмала.

Ферментативный гидролиз идет по-иному. Нами установлено [4), что в механизме катализа глюко-амилазами важную роль играют две ионогенные группы — карбоксильная и имидазольная. Оптимум для действия глюкоамилаз равен pH 4,7. При

этом зн офильн лата-п] Ионе являете ния гл котора! том же лота, и милазы заряже опреде; реакциі oпpeдeJ но впеи га, кар( ко свяэ мала, н ствие и паре гл электр< группы карбокі функції этой па ны буд дазольн ния» к ментов

ТИВН0М1 0-СВЯЗЇ Исхо лазы н<] 4 б, где группа.! Отри , кислор

ДИМО, о

фильно лат-им фермеї подверг расщеп ролиза. 1,6-глю Изло лиза к[ даются при фе

1-4, 1994

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 3-4, 1994

17

астворе ие КОННИ ней-вролизе [ренней [ кисло-крахма-

мен на

[)ЛЬШИМ

И имеет

ТО,

м угле-|блака у воздей-,ца глю-ильной за связи 1 схемы плотно-гронных ьно идет пыты с ет быть

1ЮК03ИД-

мала —

этом значении pH группы находятся в виде нукле-офильно-электрофильной системы: ион карбокси-лата-протонированный имидазолий.

Ионогенная пара карбоксилат-имидазолий и является той идеальной системой для расщепления глюкозидных связей в молекуле крахмала, которая необходима для случая, когда в одном и том же растворе существуют одновременно и кислота, и основание. В белковой молекуле глюкоамилазы благодаря закреплению противоположно заряженных групп на поверхности глобулы на определенном расстоянии не происходит прямой реакции нейтрализации. Это, собственно, и предопределяет акт катализа. Находясь на различных, но вполне определенных расстояниях друг от друга, карбоксильная и имидазольная группы не только связываются с реагирующими группами крахмала, но и оказывают сильное поляризующее действие на связь О—О. В каталитически активной паре глюкоамилазы карбоксилат-имидазолий роль электрофильной (кислотной, протонодонорной) группы отводится имидазолию, в то время как карбоксилат-ион (основная группа) выполняет функцию нуклеофила. При совместном действии этой пары в глюкозидной связи крахмала электроны будут стягиваться к «точке закрепления» ими-дазольной группы и уходить от «точки закрепления» карбоксилат-иона. На основании экспериментов с НгО18 установлено, что и при ферментативном гидролизе разрыв осуществляется по С| — О-связи [3].

Исходя из этого, механизм действия глюкоамилазы на крахмал представили в виде схемы на рис. 4 б, где Н Им — протонированная имидазольная группа.

Отрицательный индукционный эффект атома .кислорода больше, чем атома Сь и является, видимо, основной причиной электрофильно-нуклео-фильной атаки С1—О-связи системой карбокси-лат—имидазолий. В отличие от кислотного при ферментативном, гидролизе глюкозидная связь подвергается двухсторонней атаке, что приводит к расщеплению этой связи в мягких условиях гидролиза. Аналогично можно описать и разрыв а-1,6-глюкозидной связи.

Изложенные представления о механизме гидролиза крахмала достаточно убедительно подтверждаются рассчитанной нами энергией активации при ферментативном и кислотном гидролизе. В

первом сдучае она оказалась равной 32,7 кДж-мол'ь~*;, во втором — 138,6 (pH 1,10) и 120,4 (pH 0,85). Двухсторонняя атака Ci—О-связи системой карбоксилат-имидазолий приводит к снижению энергии активации более чем в 3 раза по сравнению с кислотным гидролизом, это и является основной причиной мягких условий ферментативного гидролиза. При кислотном гидролизе крахмала величина энергии активации значительно ниже при более высокой концентрации ионов Н +. В этом случае происходит более глубокая деформация Ci—О-связи и легче ее последующий разрыв под действием тепловой энергии. Однако энергия активации при кислотном гидролизе крахмала достаточно близка к энергии активации разложения глюкозы [5J, что и обусловливает появление экстремумов (рис. 1) и увеличение Д (рис. 2) за счет деградации С—С-связей в глюкозе и появления хромафорных групп в результате сопряженных вторичных реакций конденсации и полимеризации промежуточных продуктов распада глюкозы.

Таким образом, односторонняя атака Н -ионами Ci—О-связи при кислотном гидролизе крахмала требует жестких условий гидролиза (высокой концентрации Н -ионов, высокой температуры), что приводит не только к образованию глюкозы, но и ее распаду. Двухсторонняя электрофильно-нукле-офильная атака глюкозидной связи под действием глюкоамилазы приводит к резкому снижению энергетического барьера для разрыва этой связи,обусловливает мягкий режим гидролиза крахмала, исключающий распад глюкозы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Силин П.М., Силина Н.П. Химический контроль свеклосахарного производства. — М.: Пищевая пром-сть, 1977.

2. Грачев Ю.П. Математические методы планирования экспериментов. — М.: Пищевая пром-сть, 1979.

3. Hiromi К., Katahashi К., Hamauzu Z. Kinetic studies on

flucamylase II: Kompretetion betroun two types of substrate oving a-1,4- and a-1,6-glucosidic linkage / / J. Biochem. — 1966. — 59. — № 4. — P. 11-16.

4. Жеребцов H.A. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности. — М.: Легкая и и пищевая пром-сть, 1984.

5. Сапронов А.Р., Колчева Р.А. Красящие вещества и их влияние на качество сахара. — М.: Пищевая пром-сть, 1975.

Кафедра микробиологии и биохимии

Поступила 21.03.94

ШИ кис-я элект-ie связи

iy. Нами } глюко-огенные Опти-

1,7. При