CC BY
94
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 547. 458. 61
Д. Ш. Ягофаров, А. Ш. Закирова, А. В. Канарский,
Ю. Д. Сидоров
ЭНЗИМОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ КРАХМАЛА ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННОГО КАРТОФЕЛЯ
Ключевые слова: фермент, гидролиз, крахмал, кинетика, резистентность.
Исследован ферментативный гидролиз крахмала, выделенного из генетически модифицированного картофеля, с использованием комплекса гидролитических ферментов. Установлено, что энзиморезистентность крахмала, выделенного из генетически модифицированного картофеля, соответствует энзиморезистентности крахмала, выделенного из контрольного аналога.
Keywords: enzyme, hydrolysis, starch, kinetics, resistance.
Enzymatic hydrolysis of the starch, derived from genetically modified potato, has been researched by using of complex of hydrolytic enzymes. Established that enzyme resistance of the starch derived from genetically modified potato corresponds to enzyme resistance of the starch derived from control sample.
Актуальность
На рынке появляются новые источники крахмалосодержащего генетически модифицированного сырья - среди них чаще всего встречается генетически
модифицированный картофель. Генетическая модификация картофеля производится с целью борьбы с вредителями-жуками, повышая тем самым урожайность картофеля. Однако свойства крахмала, выделенного из модифицированного картофеля в общем остаются неизвестными. Прежде всего это энзиморезистентность крахмала, знания о которой необходимы для получения продуктов пищевого и технического назначения. Энзиморезистентность крахмала может характеризоваться кинетикой ферментативного гидролиза.
Ферментативный гидролиз, в общем, достаточно хорошо изучен, с получением простых сахаров, в частности, глюкозы. В технологии ферментативного гидролиза используется двух-и трехступенчатый гидролиз, однако, в работах, где рассматривается энзиморезистентность крахмала генетически модифицированного картофеля, последний практически не рассматривается [1,2,3,4].
Исследование действия ферментов на крахмал проводится с целью изучения структуры и состава крахмала.
Процесс гидролиза крахмала можно условно разбить на три стадии: клейстеризация крахмала, разжижение крахмального клейстера и его осахаривание. [1,2].
Цель настоящей работы - определение энзиморезистентности крахмала, выделенного из генетически модифицированного картофеля.
Для достижения цели решались следующие задачи:
- разжижение крахмала с использованием ферментного препарата а - амилаза и контроль содержания глюкозы;
- обработка крахмала ферментным препаратом пуллуланаза и контроль содержания глюкозы;
- ферментативный гидролиз крахмала ферментным препаратом глюкоамилаза с контролем образования глюкозы.
Экспериментальная часть
В исследованиях использовались крахмал, выделенный из контрольного картофеля Луговской и крахмал, выделенный из его генетически модифицированного аналога [5,6]. Образцы картофеля были представлены Центром «Биоинженерия» РАН г. Москва.
Для проведения ферментирования крахмала, выделенного из контрольного картофеля и его генетически модифицированного аналога, получали суспензию с концентрацией сухих веществ 6 %. Затем эту суспензию клейстеризовали при температуре 55-65 °С. Крахмальный клейстер нагревали до 90 °С и после термостатирования в течение 20 минут с целью разжижжения образованного клейстера вносили ферментный препарат термостабильной а-амилазы (SPEZYME FRED-L) с активностью 17.400 LU (разжижающих единиц) в расчете на 3.54 мг/г крахмала [7]. В процессе ферментирования выдерживали оптимальные условия рекомендуемые изготовителем для действия этого ферментного препарата (температура 90 °С, pH 5.0 - 6.5) [7]. В этих условиях а- амилаза катализирует разрыв а-1,4
- глюкозидных связей в крахмале с образованием низкомолекулярных разветвленных олигосахаридов (декстринов) и небольшого количества глюкозы и мальтозы [7,8]. Контроль степени гидролиза осуществляли по изменению концентрации глюкозы и значения вязкости.
После двухчасовой обработки а-амилазой гидролизат охлаждали до 60 оС и устанавливали значение pH 4 - 4.5. Эти условия являются оптимальными для действия ферментного препарата пуллуланаза (OPTIMAX L-1000). [7,8] Этот препарат с активностью 1000 ASPU (кислотно-устойчивых пуллуланазных единиц) вводился в исследуемый раствор в расчете на 5.9 мг/г крахмала. Раствор выдерживали при температуре 60 °С в течение 2 часов при интенсивном перемешивании.
Ферментный препарат пуллуланаза способен в отличие от а-амилазы неупорядоченно гидролизовать альфа - 1,6- глюкозидные связи амилопектина крахмала и декстринов, при совместном действии на крахмал с а-амилазой.
Затем в исследуемый раствор крахмала вводили ферментный препарат глюкоамилаза (DISTILLASE L400+) с активностью 350 GAU (глюкоамилазных единиц) в расчете на 5.65 мг/г крахмала . Контролировали кислотность среды (pH 4 - 4.5) и непрерывно перемешивали до образования максимального количества глюкозы.
Основным показателем, характеризующим степень гидролиза, является концентрация глюкозы. Применяются три основные методы определения количества глюкозы: редуктометрические (основанные на восстановительных свойствах ациклической формы глюкозы), колориметрические (среди них можно выделить ферментативный и неферментативный ), а также поляриметрические и электрохимические методы [9,10]. Наибольшее распространение получили колориметрические методы, которые позволяют определять уровень этого вещества с достаточно высокой точностью и специфичностью. Оценивают концентрацию продуктов реакции, образующихся в результате взаимодействия реагента с глюкозой. Оценку проводят по развитию окраски в видимом спектре, или по помутнению раствора - при ультрафиолетовых длинах волн.
Для определения содержания глюкозы колориметрически - ферментативным УФ методом использовали набор ферментов фирмы R - Biopharm Roche. Набор включает в себя фермент гексокиназу, в качестве хромогена используется глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа. Рекомендуемая длина волны для колориметрирования 365 нм и кювета с длиной оптического пути 0.5 см. В качестве калибратора использовали стандартную глюкозу, предложенную фирмой.
Принцип измерения основан на том, что фермент гексокиназа катализирует фосфорилирование глюкозы аденозинтрифосфатом. Фермент глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа окисляет глюкозо-6-фосфат до 6 -фосфоглюконата с одновременным восстановлением никотинамидаденина в никотинамидаденинлинуклеотид фосфат, который определяется колориметрически [8,11].
Доля гидролизованного крахмала С ( г/100 г) определялась по содержанию глюкозы по формуле
с
С = — • 100,
М
где с - концентрация искомого вещества, г/л; М - навеска пробы, г/л.
В процессе гидролиза контролировалось также изменение вязкости раствора, путем измерения скорости истечения через капилляр.
Результаты и обсуждения
На рисунке 1 представлены результаты, отражающие влияние обработки крахмала, выделенного из контрольного картофеля и его генетически модифицированного аналога, а -амилазой на образование глюкозы.
время, мин
■ —контрольный крахмал-------крахмал ГМ
Рис. 1 - Зависимость концентрации глюкозы С от продолжительности гидролиза крахмала при обработке а-амилазой
Из представленных результатов видно, что концентрация глюкозы увеличивается пропорционально продолжительности гидролиза. По истечению двух часов, результаты экспериментов показали, что концентрация глюкозы достигает максимума и дальнейшее выдерживание раствора практически не приводит к ее увеличению. Значение максимума концентрации глюкозы крахмала, выделенного из контрольного картофеля соответствует 7.7 %, а крахмала, выделенного из модифицированного аналога - 8.14%. Существенных отличий в образовании глюкозы не наблюдается.
На рисунке 2 представлена зависимость концентрации глюкозы от продолжительности гидролиза после добавления фермента пуллуланаза.
Рис. 2 - Зависимость концентрации глюкозы С от продолжительности гидролиза крахмала при обработке пуллуланазой
Как видно из рисунка 2 при обработке крахмала пуллуланазой заметного роста количества глюкозы не наблюдается : у крахмала, выделенного из контрольного картофеля до 11%, а у трансгенного его аналога до 12.9%. Это связано со специфическим действием пуллуланазы на молекулы амилопектина и продолжением работы а - амилазы с субстратом при низких температурах.
На рисунке 3 представлена зависимость концентрации глюкозы от продолжительности гидролиза, после добавления ферментного препарата глюкоамилаза.
Рис. 3 - Зависимость концентрации глюкозы С от продолжительности гидролиза крахмала при обработке глюкоамилазой
Из представленных результатов видно, что в начальный период (до 5 часов), процесс гидролиза протекает наиболее интенсивно. По истечению 5 часов процесс ферментативного гидролиза снижает свою интенсивность, и степень увеличения концентрации глюкозы значительно уменьшается. По истечению 11 часов процесс стабилизируется и концентрация глюкозы практически не изменяется. Значение вязкости раствора также остается постоянным.
Значение концентрации глюкозы крахмала, выделенного из контрольного картофеля составило 71.2 %, а для крахмала, выделенного из генетически модифицированного его аналога - 74 %.
Выводы
Результаты проведенных экспериментов показали, что существенных отличий в кинетике ферментативного гидролиза крахмала в образовании глюкозы не наблюдается. Небольшое увеличенное количество глюкозы у крахмала, выделенного из трансгенного картофеля, по сравнению с контрольным аналогом можно объяснить разным гранулометрическим составом крахмала [12], следовательно энзиморезистентность крахмала, выделенного из генетически модифицированного картофеля и его контрольного аналога , идентичны.
Проведение ферментативного гидролиза картофельного крахмала в три стадии с промежуточной обработкой пуллуланазой позволяет получать гидролизат крахмала с содержанием глюкозы 71.2 % у контрольного картофеля и 74% глюкозы у крахмала, выделенного из генетически модифицированного аналога, в течение 11 часов.
Литература
1. Технология крахмала и крахмалопродуктов / Н.Н. Трегубов [и др.] ; общ. ред. Н.Н. Трегубова. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981.- 472 с.
2. Гулюк, Н.Г. Крахмал и крахмалопродукты /Н.Г. Гулюк, А.И. Жушман. - М.: Агропромиздат, 1985.240 с.
3. Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов / Б.Н.Степаненко.- М.: Высшая школа, 1978. -256 с.
4. Керр, Р.Ф. Химия и технология крахмала / Р.Ф. Керр.- М. : Пищепромиздат, 1956.-565 с.
5. Ягофаров, Д.Ш. Применение метода электродиализа для разделения амилозы и амилопектина картофельного крахмала / Д.Ш. Ягофаров, А.Ш. Закирова, А.В. Канарский, Ю.Д. Сидоров, М.А. Поливанов // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2010.-№11.-С.331-335.
6. Закирова, А.Ш. Сравнительная оценка эффективности разделения картофельного крахмала на амилозу и амилопектин химическими методами / А.Ш. Закирова, Д.Ш. Ягофаров, А.В. Канарский, Ю.Д. Сидоров // Вестник Казан. технол. ун-та.-2010.-№9.-С.621-625.
7. Официальный сайт производителя и продажи энзимов [Электронный ресурс] / Режим доступа : http: // www.genencor.com, свободный.
8. Колеснов, А.Ю. Биохимические системы в оценке качества продуктов питания
(ферментативный гидролиз)/ А.Ю. Колеснов. - М.: Пищевая промышленность, 2000.- 416 с.
9. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева. - М.: Агропромиздат, 1987. — 335 с.
10. Алексовский, В.Б. Физико - химические методы анализа. Практическое руководство: Учебное пособие для вузов / В.Б Алесковский .- Л.: Химия, 1988. - 376 с.
11. Гамаюрова, В.С. Ферменты. Лабораторный практикум / В.С. Гамаюрова, М.Е. Зиновьева. - Спб.: Проспект науки, 2011.- 256 с.
12. Ягофаров, Д.Ш. Исследование морфологических свойств картофельного крахмала / Д.Ш. Ягофаров, А.В. Канарский, Ю.Д. Сидоров // Вестник Казан. технол. ун-та.- 2011. - Т. 14. -№4.-С.193-201.
© Д. Ш. Ягофаров - асп. каф. пищевая инженерия малых предприятий КГТУ, ripper-kicker@mail.ru; А. Ш. Закирова - асп. той же кафедры, altinbagana@mail.ru; А. В. Канарский - д-р техн. наук, профессор той же кафедры, alb46@mail.ru; Ю. Д. Сидоров - канд. техн. наук, ст. препод. той же кафедры, sidud@mail.ru.
