Обоснование применения белкового ингибитора для регулирования протеолиза соленых рыб Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

I. Панцирь крабов , ----------- ^

П. Огходы Слаковинн) |ш. Отходы (раковины ' --------------------- I и белковая часть) .

„'ОТХОДЫ - СОЛЯНО-

хсслый гидроаизат

Деминералкгация

1_______________________

Промывка водой [—Промывные воды!------

- —і— 1(на приготовление

р-ра неї)

Кислотный гидролиз __ Щелочной гидролиз

хитин

Высавдение предали та та___________

I Белково-минеральный і кормовой продукт

_________ ї________ ___________________

Дчзацетнларование Ц1%отвор щелочи \

Прок’чка видов

ОртЧа'

Промывные воды (на приготовление р-ОВЯаОН, промывку) -|

Поешпитат

Хитозан

Жидкая їаза| X

На приготовление растворов _______

Iе

айдкая фаза

На приготовление "] ра с творов________

Рис. 2

ВЫВОДЫ

1. Отходы, образующиеся при переработке мидии, гребешка, трубача, краба, креветок и криля могут быть использованы как источники белковых, минеральных веществ и хитина.

2 Предлагаемая схема (рис. 2) позволяет обеспечить комплексную безотходную технологию

переработки моллюсков и ракообразных: дости-

гается сокращение потерь сырья и использование отходов от разделки для выпуска кормовой и технической продукции.

Кафедра технологии .рыбных продуктов

Поступила 27.02.90

664.951.2:577.156

ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ БЕЛКОВОГО ИНГИБИТОРА ДЛЯ РЕГУЛИРОВАНИЯ ПРОТЕОЛИЗА СОЛЕНЫХ РЫБ

В. А. ПЕТРОВ, М. П. ЛАПАРДИН, Н. Б. ОСЕННЯЯ, Т. Н. СЛУЦКАЯ,

Н. А. ГЕРАСИМОВА, Н. И. МИЛЕНИНА, Т. Н. ВИНЯР

Владивостокский государственный медицинский институт Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии

Белковые ингибиторы протеаз из картофеля замедляют протеолиз, катализируемый трипсином, химотрипеином, карбоксипептидазами А и В, субтилизином, проназой, панкреатической эласта-зой [1, 2, 3, 4]. Достаточно широкое применение они находят в медицине и для научно-исследовательских целей. Изучение возможности использования ингибиторов протеаз в технологии рыбных продуктов привело к необходимости исследования протеолиза при различных концентрациях хлористого натрия, pH среды, а также степени воздействия ингибитора на биологическую ценность рыбной продукции.

Ингибитор протеаз из картофеля был получен нами в виде солевой пасты: содержание белка в пасте — 6, влаги — 70, хлористого натрия — 23,7%. Гель-хроматография на 0-75 показала, -что полученный белковый препарат гетепогенен и содержал два белковых компонента, неравноценных в количественном отношении. Сила ингибирующего действия по отношению к трипсину у минорного компонента не превышала 10% от основного. Это позволило с достаточным приближением изучать свойства полученного белкового препарата как гомогенного ингибитора, называемого в дальнейшем ингибитором протеолиза. Молекулярная масса ингибитора протаолиза, определенная с по-

мощью гель-хроматографии на С-75, сДйг и вила 48000.

Активность пептидгидролаз в присутствии и отсутствии ингибитора определялась модифицированным методом Ансона [5]. О скорости ферментативной реакции судили по накоплению продуктов гидролиза, растворимых в 5%-ном ГА'-Я Количество продуктов гидролиза определяли прямы* слсктрофотометрированием при 280 нм, методом Кьельдаля и нингидриновым методом [6].

Кинетические параметры гидролиза и «личину ингибиторной константы рассчитывали графическими методами Лаймуивера-Берка и Диксона [7].

Независимость степени торможения от времени инкубации с ферментом и снижение ингибирующего эффекта при разведении позволили изучить ингибитор протеолиза как обратимый ингибитор.

Ингибитор протеолиза тормозил активность трипсина по конкурентному типу торможения: К, = = 1,24- 10~'‘ М. В случае химотрипсина обратимое торможение происходило по смешанному типу с явным преобладанием конкурентной составляющей. Сила ингибирующего действия в этом случае была на порядок ниже: К,— 3,34 • 10-:| М. Ингибитор

протеолиза гидролизовался под действием пепсина млекопитающих Кинетические параметры гидролиза^

р

I

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 5, 1990

47

[L

1

V.:, 1,5.10

3-эко- концевых-_ NH-2 мин/мг белка

Км = 1,4Х

В

№Г*в

.1.' И" к к>*ММ. кС С2.:’: м

[Ч: i.L .!>U

£77 .56

ЮРА

ти II к ■jlll .к I ■!! Г» \:\ь і \\\г<\ ■ и

. л-.и- к

|||Д>‘ М I I VI V»; :м

і і і г V

К й

ц|д. ill

ні 0 • і у

ПІ! v iv -II

i'll і К- —

! :нж:й і г:>

,] !lh Г

jjlh i'i-J.II:

иГ і ftp

ЧІ М' її I . b.IKLIhj.j-

ХЮ~5 М, что составляет 15% от скорости гидролиза бычьего гемоглобина при практически равных величинах констант Михаэлиса.

Гидролизуемость ингибитора протеолиза под действием пепсина млекопитающих является положительным фактором для использования его в технологии пищевых продуктов.

Исследование влияния на активность ингибитора хлористого натрия проводили при pH 8,0, с использованием: в качестве субстрата — казеината

натрия, фермента — кристаллического трипсина. Реакцию проводили, как описано в литературе [6]. При соотношении субстрат:фермент:ингибитор 400:1:0,5 испытывалось влияние следующих концентраций хлористого натрия: 5, 10, 15, 20%.

Изучение действия различных применяемых в технологии обработки рыбы концентраций хлористого натрия показало, что присутствие в реакционной среде этой соли снижает активность трипсина, и при 20%-ной концентрации в системе остаточная активность фермента не превышает 50%. Влияние ингибитора протеолиза, исследованное при этих же концентрациях хлористого натрия, однозначно: он эффективно подавляет актив-

ность трипсина и в присутствии соли. Причем активность фермента как в присутствии ингибитора, так и в его отсутствии уменьшается пропорционально количеству хлористого натрия.

Таким образом, введение хлористого натрия в систему трипсин — ингибитор оказывает преимущественное действие на фермент, но не препятствует его связыванию с ингибитором. Следовательно, сочетание в реакционной среде определенных количеств ингибитора протеолиза и хлористого натрия позволяет значительно снизить активность протеаз, а это имеет практическое значение при решении задач торможения протеолиза в пищевых продуктах, технология приготовления которых предусматривает применение хлористого натрия.

Технология обработки рыбы допускает использование слабых органических кислот, таких как уксусная, лимонная и т. п. Поэтому проводилось определение рН-ст абильности ингибитора протеолиза путем выдерживания в буферных растворах, pH 2,35—8,0 (шаг 0,5) при соотношении ингибитор— раствор 1:10. После выдерживания 60 мин при температуре 20+2°С определяли активность ингибитора по отношению к трипсину. Изучение рН-стабильности показа.чо, что полученный нами ингибитор протеолиза полностью сохраняет анти-трипсиновую активності, при pH тузлука (6,5) и кислотоустойчив. При pH 7,3 происходит исчезновение антитринсиновой активности, возможно, за счет потери свободного заряда белков, что хорошо согласуется с данными, полученными для чистого ингибитора трипсина из картофеля [1].

Известно, что однотипные ферменты млекопитающих и рыб по своим свойствам значительно различаются друг от друга [8]. Поэтому следующим этапом исследования было изучение влияния ингибитора протеолиза на ферменты рыб. В этом случае источником ферментов и одновременно субстратом служили 13%-ные гомогенаты внутренностей и мышечной ткани сельди иваси (быстросозревающей при посоле) (в соотношении 1:40) или 13%-ные гомогенаті,: только мышечной ткани рыбы. Исследование проводили при pH 3,5; 6,0; 8,0 в среде фосфатно-цитратного буфера.

Как видно на рисунке, ингибитор протеолиза,

%, влияет на активность пептидгидролаз Мяб, мг/% внутренностей и мышечной ткани сельди иваси следующим образом: 1 активность пептидгидролаз внутренностей; 2 активность пептидгидролаз мышечной ткани: а — pH реакционной

среды 3,5, б — pH реакционной среды 6,0, в — pH реакционной среды 8,0, т. е. ингибитор протеолиза тормозит активность ферментов внутренностей сельди иваси при pH 6,0 и pH 8,0 (рис. бив) — в зоне действия трипсиноподобных ферментов. Таким образом, ингибитор протеолиза обладает

выраженным ингибирующим действием на се-риновые пептидгидролазы. В зоне действия кислых пептидгидролаз внутренностей (рис. а) существование ингибирующего эффекта проблематично. Увеличение концентрации ингибитора не приводит к увеличению ингибирующего эффекта, поэтому объяснить это можно как собственно ингибирующим эффектом, так и неепецифической сорбцией.

В случае ферментной системы мышечной ткани ингибирующий эффект как при pH 3,5, так и при pH 6,0 не обнаружен.

Полученные данные позволяют сделать заключение, что ингибитор протеолиза эффективно тормозит активность трипсиноподобных ферментов рыб в присутствии хлористого натрия. На основании результатов, приведенных на рисунке, можно установить необходимые и достаточные концентрации ингибитора протеолиза, которые составляют 0,06—0,3% к массе рыбы.

На следующем этапе работ необходимо было выяснить степень воздействия ингибитора протеолиза на эффективность белкового компонента готовой рыбной продукции. В связи е этим оценивалась белковая эффективность пресервов сельдь иваси с включением ингибитора протеолиза с помощью метода определения биологической ценности [9].

Биологическую ценность изучали на растущих крысах-самцах Виетар массой 40—42 г. Животные

1-й группы получали в качестве контроля казеин,

2-й и 3-й групп — соответственно рыбные пресервы без ингибитора и пресервы с ингибитором.

Во всех рационах было 5% подсолнечного масла, 10% маргарина, 2 мг витаминной и минеральной смеси, остальное — картофельный крахмал. Белковый компонент составлял 10% за счет рыбных пресервов. Продолжительность адаптационного периода — 4, обменного — 5, длительность содержания животных в опыте — 28 сут. В течение обменного периода собирали мочу, кал и за весь опыт учитывалось количество потребленного корма. Минерализацию субстратов производили концентрированной Н2504 с последующим определением цветной реакцией с реактивом Винклера. Содержание азота в минерализатах мочи, кала и корме определяли калориметрически на ФЭК-56 М.

Для определения усвояемости белка, биологической ценности и утилизации бе :ка использовали метод азотистого баланса. Расчеты проводились по общепринятым формулам.

Наибольшая прибавка массы тела (таблица) была у крыс на рационе с включением ингибитора протеолиза (3-я группа). Данный показатель во всех группах животных различался незначительно. Расчет балансовых показателей азота

Таблица

Группа Прибавка массы, г Привес на 1 г обеденного корма Усвояемость белка, % Биологическая ценность, % Утилизация белка, %

Казеин (контроль) 48,4+3,65 2,65 + 0,14 87,20+1,34 76,16+1,16 67,2.5+1,19

Пресервы без ингибитора 47,8+4,60 2,80 + 0,19 89,77 + 0,70 70,77+1,44 62,39 + 1,84

Пресервы с ингибитором 49,6 + 6,91 2,69±0,22 88,44+1,15 73,06+ 1,90 63,55 + 2,65

показал, что биологическая ценность и показатель утилизации белка в данной группе ниже, чем в контроле. Вместе с тем биологическая ценность и усвояемость белка по сравнению со 2-й группой, получавшей пресервы без ингибитора, соответственно на 3,5% и 1,8% выше.

Таким образом, использование ингибитора протеолиза способствует сохранению высокой белковой эффективности готовой рыбной продукции.

ВЫВОДЫ

Ингибитор протеолиза из картофеля является перспективным в технологии посола рыб, в частности при необходимости торможения протеоли-тических процессов. Для быстросозревающих рыб его эффективная рабочая концентрация — 0,06—

0.3. к массе рыбы. Применение ингибитора протеолиза в технологии рыбных продуктов способствует сохранению высокой белковой эффективности готовой продукции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мосолов В. В., М а л о в а Е. Л., Валуева Г А'., Шульмина А. И. Свойства ингибитора сериноиых протеиназ из картофеля// Биоорганич химия 1975

1,- № 10,- С. 1449—1457

2. Мосолов В. В., Шульмина А И., М а л о-

в а Е. А Выделение из клубней картофеля ингибитора трипсина и хпмотрппсина//Бнохимия—1974— 39. Вып 5

М о с о ,ч о в В В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеолиза: XXXVI Баховское

чтение М Наука, 1983.— 40 с.

Реви н а Т А., В а л у е в а Т. Н., Р о м а ш к и и Р. И.

Мосолов В В Низкомолекулярные ингибиторы из клубней картофеля//Биохимия.— 1987 52.— № 4.—

С '683 689

Каверз и е в a F. Д. Стандартный метод определения протеолити ческой активности для комплексных препаратов протеаз//Г1рикладная биохимия и микро-

биология 1971 —7.— Вып. 2.— С 225—228.

Д а в е н н Т , Г е р г е й Я. Аминокислоты, пептиды, белки М : Мир, 1976.— 364 с

Диксон М., Уэбб Э Ферменты М ' Мир, 1982 —-1117 с

R a m а к г i h п а М., Н u 1 t i n Н О , A a t а 1 I h М. Т

A comparison ol digtishahd hovin ehvmotripsin in

relation to protein hydrolysis//J Food Sci.— 1987 — 52 № 5.— P. 1198—1202

В ы с о и к nii В Г , Тут с л ь я п В А Методические проблемы исследования качества новых источников пищевых белков.— М., ВИИМИ, 1987 С 63

Кафедра гигиены питания Лаборатория технологии посола и копчения рыб

Поступила 28.01-89

ч;и

І

і:і'И

s.-; '■ і

4 ї 1,1

.'.У-1

вод1

кил

cxd

кап

ЩЄ,| И П|

на

paj

за1

ни:

зи

МЬІІ

боті

G

при

crq

тин

Не,|

НО.Л

бис

70^

TO'J

чеіі

боті

СЬір

бец

•4

І

ffll

меі

yid

вен

І

чеи и л и

ко^

Н»1

П0І

Iі

ко^

таї

60

на

пр<

ні

цеі

П

Я

ж