CC BY
191
Г
(3)
гель пол-;твует. В
(4)
и (4) ре-ной схе-[фферен-) К виду, разност-
(5)
(ля урав-
(б)
(7)
>й разно -радиусе ю време-{достиг-эвания. иями (3) шем [3]. ьтатов. юн коэф-лее близ-лъ изме-;ни.
I концен-г воздей-мена. По но значе-ка и вы-
держки в 1,1 раза выше, чем при диффузии с постоянными граничными условиями.
Полученные данные по нестационарной массопе-редаче при стоке растворителя и выдержке материала, совместно с данными по равновесию и кинетике мас-сопередачи в системе крупка подсолнечного жмы-ха-экстракционный бензин [4], легли в основу математической модели циклического экстрактора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Цебренко К.Н., Константинов Е.Н., Деревенко В.В. Моделирование и совершенствование процесса экстрагирования подсолнечного масла // Материалы Междунар. конф. молодых ученых «От
фундаментальной науки - к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии». Вып. 2. - Тверь: ТГТУ; Русская пповннпия. 2002. — 128 с.
2. Кафаров В.В. Основы массопередачи. - М.: Высш. школа, 1979.-439 с.
3. Аксельруд Г.А., Альтшуллер М.А. Введение в капиллярно-химическую технологию. - М.: Химия, 1983. - 264 с.
4. Цебренко К.Н. Константинов Е.Н. Равновесие в системе капиллярно-пористое тело-жидкость - основа исследования кинетики процесса экстрагирования // Науч. основы процессов, аппаратов и машин пищевых производств: Материалы Междунар. науч. конф. -
1/%.ЛГ'Т,\7- ОПАЛ '■унл ,,
1 ^ и.
Кафедра процессов и аппаратов пищевых производств
Поступила 29.05.03 г.
[543.7 + 543.8]543.544
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМА ТОГРА ФИЯ -ПЕРСПЕКТИВНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ И НЕОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
А.Ю. БУДУ НОВ А, М.А. ГОЛЬДБЕРГ, Г.А. КРАСИВСКИИ
В настоящее время значительную часть отечественного рынка занимает продукция, выпускаемая мелкими производителями, которые зачастую не в состоянии обеспечить надлежащий контроль технологических процессов. На фоне неблагоприятной экологической обстановки это делает задачу тщательной проверки качества продуктов пищевой промышленности первоочередной.
Среди многочисленных методов анализа пищевых продуктов одно из главных мест занимает хроматография. Метод, открытый нашим соотечественником М.С. Цветом в 1903 г., основан на различии в скоростях перемещения веществ в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз. Ему свойственна высокая информативность, обусловленная одновременностью разделения, идентификации и количественного определения компонентов смесей, а также способностью к сочетанию с другими физико-химическими методами. Наиболее широкое применение имеют колоночная (жидкостная и газовая) и тонкослойная хроматографии.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой планарную жидкостную хроматографию, в которой разделение смеси веществ осуществляется на открытом тонком слое сорбента или в пленках пористого полимерного материала. Метод ТСХ предложен в 1938 г. советскими учеными Н. А. Измайловым и М.С. Шрайбер. Широкое использование ТСХ в химическом анализе началось с 1956 г., и в настоящее время она заняла одно из ведущих мест в анализе сложных природных, химических, фармацевтических, медико-биологических, технологических и экологических объектов.
Основными преимуществами ТСХ перед другими хроматографическими,методами являются: :
простота и дешевизна аппаратурного оформления и расходных материалов;
низкий порог количественного обнаружения, обусловливающий малое количество вещества в наносимых пробах;
параллельное разделение нескольких образцов на одной пластине;
широкие возможности оптимизации разрешающей способности по целевым веществам за счет подбора условий хроматографического разделения;
легкость проведения хроматографирования и малый расход реактивов;
возможность повышения чувствительности и селективности обнаружения как с использованием различных проявляющих растворов, так и облучением УФ-светом;
пригодность для препаративного разделения компонентов пробы за счет того, что разделенные компоненты в виде пятен можно выделить и идентифицировать другими аналитическими методами;
отсутствие необходимости регенерации пластин; возможность хранить пластш-гу с разделенными образцами и детектировать интересующие вещества позлее.
Простота и экспрессность, высокая эффективность, наглядность результатов разделения делают ТСХ широко используемым и доступным методом массовых анализов практически всех классов веществ. При хорошей организации работ количественная оценка результатов оказывается болсс точной, чем в случае колоночной хроматографии. По данным руководителей отраслевых контрольно-аналитических центров, метод ТСХ применяют порядка 6 тыс. лабораторий, проводя до 10 млн. анализов в год. Почти 80% из них осуществляются в центрах санитарно-эпидемиологического надзора,
контрольно-аналитических лабораториях пищевых продуктов, ветеринарных лабораториях, лабораториях элеваторов зерна и комбикормовых заводов, центрах агрохимслужбы, на станциях защиты растений.
В России действуют утвержденные в установленном порядке государственные методики по контролю содержания микотоксинов (патулина, зеараленона, Т-2-токсина, охратоксина А, афлатоксинов, вомитокси-на), консервантов, витаминов, канцерогенных Л'-нит-роззминов и полидикличсских зромзтичсских углеводородов, ОСТаТОЧКЫХ КОЛКЧССТВ фосфор- К ХЛОрОрГаКИ-чес к их пестицидов, левомицетина, антибиотиков тет-рациклинового ряда, диэтилстильбэстрола в различных продуктах пищевой промышленности. Метод ТСХ позволяет осуществлять определение фракционного состава фосфолипидов и глицеридов; фенотизи-на, цианокса, омайта в меде; пищевых красителей; антиоксидантов; ферментов и энзимов; флавоноидов и каротинондов; аминокислот, пептидов и белков; углеводов; стероидов; терпенов и многих других органических и неорганических веществ.
Расширение областей применения, переход от каче-СТ КС I! I! О ХТ И полл'количественной оценки к количественному анализу требуют инструментализации ТСХ. Однако стоимость зарубежного оборудования, предназначенного главным образом для исследовательских программ, а не для рутинных анализов, очень высока. В России в результате реализации Государственного проекта «Прибор для тонкослойной хроматографии», специалистами ЗАО «Сорбполимер» (Краснодар) создано оборудование для массового использования, обеспечивающее проведение всех этапов количественной тонкослойной хроматографии.
Процесс проведения ТСХ-анализа является многостадийным (рисунок), и тщательность проведения каждой стадии влияет, хотя и в разной мере, на точность конечного результата.
| Подготовка пробы. | \
Выбор и подготовка пластины для ТСХ
Нанесение пробы \
Выбор и подгогйвкз-хррматофафімйской камеры
Элюирование
Удаление іяюсігга с пластины
і
Визуализация :фомаТогрпммы
/
| Обработка, проявляющими растворами 4 " і
По флюоресценции
т
1 Опрыскивание j \
Погружение
Облучение УФ светом
|____КУшчссгвснный расчет и аокухкитировашц: |
ЗАО «Сорбполимер» с 1992 г. специализируется на производстве материалов и оборудования для всех стадий ТСХ. Рассмотрим использование системы для ТСХ с денситометром Сорбфил и комплектом устройств и приборов на примере измерений массовой доли микотоксинов в пищевых продуктах и продовольственном сырье (методика М-МВИ-68-00). Как известно, микотоксины являются метаболитами некоторых ви-
дов грибов и представляют серьезную опасность для культурных растений и теплокровных.
Корректный количественный расчет возможен только при хорошем разделении веществ на пластине. Одним из главных условий этого является пробоподго-товка, т. е. удаление посторонних веществ так, чтобы анализируемое вещество можно было разделять с достаточно хорошей воспроизводимостью. Эта задача требует применения методов очистки и обогащения пробы - экстракции жидких и твердых проб, твердофазной экстракции, равновесного паро фазного анализа, гель-хроматографии, использования предколонок или пластин ТСХ с концентрационными зонами и др. Для анализа микотоксинов, согласно МУК 4.1.787-99, используется твердофазная экстракция с применением концентрирующих патронов Диапак. С другой стороны, успешное разделение напрямую зависит от правильного выбора пластины для ТСХ. Пластина состоит из инертной подложки, сорбционного слоя, инертного связующего и УФ-индикатора. Сорбционный слой делается из силикагеля, оксида алюминия, целлюлозы, силиката магния, ионообменных смол, полиамида, а также смесей этих и других сорбентов. Применение универсального сорбента - силикагеля позволяет использовать хроматографическую пластин}7 для решения большинства аналитических задач.
ЗАО «Сорбполимер» выпускает по собственной технологии пластины марки ЗогЬШ с сорбционным слоем из фракционированного силикагеля, закрепленного на подложке за счет силиказоля, который при нагревании превращается в силикагель. Выпускается несколько видов пластин, основные характеристики которых отражены в маркировке. Буквы П или АФ обозначают тип подложки (полимерная пленка или алюминиевая фольга). Буквы А или В отражают фракционный состав и толщину слоя сорбента. В аналитических пластинах (А) используется фракция 5-17 мкм при толщине слоя 110-120 мкм, в высокоэффективных пластинах (В) - фракция 8-12 мкм, толщина 90-100 мкм (высокоэффективные пластины для медико-генетических исследований имеют толщину слоя 160 мкм). Буквы УФ означают, что пластина содержит люминофор-индикатор ФЛ-530. Все пластины отличаются высокой механической прочностью, а полимерная подложка устойчива к нагреву до 1307С и практически ко всем используемым для ТСХ растворителям и реагентам.
Вопрос качества пластин для ТСХ всегда был одним из приоритетных в производственной деятельности ЗАО «Сорбполимер». Исследования, проведенные в декабре 2000 г., специалистами фирмы САМАв показали соответствие пластин БогЬШ требованиям, предъявляемым к пластинам фирмы Мегск. По результатам испытаний в 12 ведущих ведомственных лабораториях пластины БогЬШ рекомендованы для применения в аналитических лабораториях России. Многие действующие методики ТСХ-анализа, в том числе и
МИК01
Sorbfi
Cc
ЗВОЛЯї
стин I пе актив] туре І ак| катор< стого 1 года в с слоя,: зать о;
т
злюеі|
нижнє
реї
ТИЧЄС]
фекти: не пласті ДЛІ тен не 3-4 ш Уі^ фронті тивнос тьгм в сороці пликаї
НОЙ П]
штрих
МЬІХ П]
даст не сущест раечеті Вьіі злюирс
ШИНСТ]
прессо: фованв творит* позволз После мально не ДОПЗ денньк нение і ляющеі диалазо у величі Сле] личеств ньіх в п ниявепі рафиолі
микотоксинов, разработаны именно для пластин БогЪШ,
Соблюдение следующих общих рекомендаций позволяет максимально использовать возможности пластин 5огЬй1:
перед нанесением пробы пластины рекомендуется активировать выдержкой в термошкафу при температуре 100-110°С в течение 60 мин;
активированные пластины следует хранить в эксикаторе над слоем прокаленного силикагеля или хлористого кальция; активация пластин, хранившихся более 1 года, обязательна;
в случае появления сильных сколов сорбционного слоя, поврежденные края пластины необходимо обрезать острыми ножницами;
для обеспечения равномерного подъема фронта элюента перед элюированием следует срезать углы в нижней части пластины на 6-8 мм под углом 45°;
рекомендуемая высота подъема фронта ддя аналитических пластин не более 70-80 мм, для высокоэффективных - не более 60 мм;
не следует наносить пробы ближе 10 мм от края пластины;
для хорошего разделения диаметры стартовых пятен не должны превышать 5-6 мм для аналитических и 3-4 мм для высокоэффективных пластин.
Уменьшение размывания пробы вдоль движения фронта растворителя приводит к увеличению эффективности разделения. Бесконтактное нанесение сжатым воздухом совершенно исключает повреждение сорбционного слоя. Управление автоматическим аппликатором осуществляется с помощью компьютерной программы, в которой задаются длина и число штрихов (пятен), порядок отбора и количество наносимых проб. Применение автоматического аппликатора даст новый импульс развитию ТСХ в России, позволяя существенно повысить точность количественных расчетов.
Выбор типа хроматографической камеры и условий элюирования диктуется методикой анализа. В большинстве случаев применяются камеры, изготовленные прессованием из химически стойкого стекла с пришлифованной крышкой для уменьшения испарения растворителя. Наличие разделительного выступа на дне дозволяет фиксировать пластины и экономить элюент. После проведения элюирования необходимо максимально полно удалить с пластины растворитель, чтобы не допустить как размывания пятен, так и непредвиденных реакций с проявляющими веществами. Применение нагревательного устройства УСП-1М, позволяющего регулировать температуру поверхности в диапазоне 35-120°С с точностью ±3°С, значительно увеличивает скорость и полноту удаления.
Следующим этапом, существенно влияющим на количественную ТСХ, является визуализация разделенных в процессе элюирования пятен. Для детектирования веществ по флюоресценции или поглощению ультрафиолетового излучения на пластинах с УФ-индика-
тором применяются облучатели, работающие на длинах волн 254 и 365 нм. ЗАО «Сорбполимер» производит облучатель хроматографический УФС 254/365 с размещением ламп в закрытом корпусе прибора и наблюдением пластины через тубус. Совмещение двух ламп с длинами волн 254 и 365 нм в одном закрытом корпусе создает неоспоримые удобства в работе и не требует затемненного помещения. Если вещества на хроматографической пластине невозможно обнаружить в видимом или УФ-свете, то их приходится обрабатывать (опрыскиванием или погружением) проявляющими растворами, делающими пятна видимыми.
Широкое применение агрессивных веществ делает опрыскивание довольно опасной процедурой. Для более безопасного ее проведения применяется специальная камера для опрыскивания, изготовленная из химически стойкого материала и присоединяемая к вытяжной вентиляции. Использование установочного столика для пластин и специального пульверизатора, совмещающего в одном корпусе эжекционную систему и емкость для раствора, обеспечивает более равномерное нанесение проявляющего вещества на пластину. Однако добиться равномерности даже при проведении опрыскивания одним и тем же человеком очень трудно. Поэтому для целей количественной тонкослойной хроматографии обработка детектирующими растворами методом погружения является предпочтительной.
ЗАО «Сорбполимер» выпускает прибор для обработки пластин методом погружения, позволяющий автоматически производить вертикальное погружение пластины в раствор с заданной скоростью, выдержку в погруженном положении и извлечение пластины. Автоматизация обработки дает возможность существенно повысить равномерность нанесения и снизить погрешность количественных расчетов, а применение тонких кювет малого объема уменьшает расход реагентов и воздействие агрессивных веществ на оператора.
Поскольку при анализе микотоксинов визуализация пятен в УФ-свете следует за обработкой проявляющими реагентами, равномерность их нанесения сильно влияет на общую погрешность расчетов. Очевидно, что в этом случае обработка пластин методом погружения с применением автоматического прибора обеспечит максимально достоверные результаты. Наиболее совершенный и удобный метод количественных расчетов в ТСХ - денситометрия, которая базируется на положении, что размер и интенсивность окраски пятна есть функция количества вещества в пятне. Для расчетов обычно используются денситометры, которые сканируют перемещающуюся пластину узким лучом света определенной длины волны. Недостатками их являются длительность проведения анализа и высокая стоимость, обусловленные конструктивными особенностями.
Технический прогресс привел к созданию видеоденситометра, производящего расчеты по видеоизображениям хроматограмм. Основное его преимущество - высокая скорость обработки. Если съемка и расчет пластины на сканирующем денситометре длятся до 30 мин, то для видеоденситометра те же процессы занимают 2-3 мин, поскольку хроматограмма обрабатывается как единое целое. Поскольку видеоденситометр состоит в общем из устройств, обеспечивающих получение и обработку изображения, стоимость его как минимум вдвое ниже, чем сканирующего денситометра.
В состав денситометра Сорбфил (производство ЗАО «Сорбполимер») входят осветительная камера, цветная видеокамера, блок ввода изображения, компьютер, монитор, принтер и программное обеспечение. Простота конструкции и достаточно высокая точность результатов ориентированы на лаборатории любого типа. Денситометр Сорбфил не требует изменения существующих методик и может обрабатывать любую ТСХ, видимую в дневном или УФ-свете с длиной волны 254 или 365 нм.
Осветительная камера предназначена для визуализации пятен на хроматограмме. Расположение лат дневного света над пластиной и применение светопоглощающей окраски позволяет добиться в осветительной камере очень высокой равномерности освещенности как в видимом, так и в УФ-свете.
Полученные с помощью видеокамеры изображения передаются в компьютер, где хранятся и обрабатываются аналогично любой другой информации. Для пластин с окрашенными в видимом свете пятнами (в том числе и после обработки проявляющими веществами), предусмотрено получение изображений с помощью планшетного сканера, что значительно расширяет возможности видеоденситометра. Специальная программа позволяет произвести, используя изображения хроматограммы, расчет процентного состава веществ в смеси и концентрации вещества в пробе. Применение программных средств уменьшает трудоемкость расчета и снижает погрешность результатов анализа, создает возможность иметь банк сравнительных данных проведенных анализов. Результаты расчетов: графики, таблицы, текстовые пояснения, а также цветное изо-
бражение хроматограммы, могут быть сохранены и отпечатаны в виде отчета.
Система для ТСХ с денситометром Сорбфил, оснащенная комплектом устройств и приборов, обеспечивающих нанесение дозированной пробы, ее разделение, регистрацию и количественную обработку значительно расширяет возможности количественной ТСХ в России. Это оборудование, обеспечивающее высокую точность и воспроизводимость анализов, столь же надежно и просто в обслуживании, как зарубежные аналоги, при значительно более низкой стоимости. Оно утверждено как средство измерения в Госстандарте России (сертификат 1Ш.С.31.001.А № 6488) и внесено в Государственный реестр средств измерений (регистрационный № 18503-99). Система является стационарной, рассчитанной на эксплуатацию в лабораторных помещениях. Она комплектуется расходными материалами, в том числе пластинами, концентрирующими патронами Диапак для пробоподготовки методом твердофазной экстракции при анализах микотоксинов, стандартными растворами и соответствующими инструкциями по применению. Выпускаемая продукция для ТСХ систематически совершенствуется и обновляется новыми видами изделий.
Проводимая на протяжении нескольких лет работа по поиску данных научно-технической методической литературы, методических указаний и ГОСТ, позволила систематизировать методики анализа органических и неорганических веществ с применением метода ТСХ. На сегодняшний день созданы те мание скис указатели методик по определению отдельных классов веществ.
Расширение применения метода количественной ТСХ позволит, не требуя переквалификации обслуживающего персонала, обеспечить высокий технический уровень исследований и анализов, снизить их себестоимость. ЗАО «Сорбполимер» имеет долговременные связи со многими ведомствами и аналитическими службами России и СНГ; совместно с Краснодарским ЦСМ, Всероссийским НИИ «Агропродукг», Краснодарским филиалом Академии стандартизации и сертификации Госстандарта РФ проводит практические занятия, семинары и учебу по ТСХ с привлечением ведущих специалистов.
Поступила 29.05.03 г.
моде]
темат
ского
ставл
ле [2-
дуктс
мы и
друг
степе
прис}
ние п
тичес
МОДе!
ниям
м
предс
стей
пов:
ЦИЛИ1
Оболе жду С1 Дит в стран модул
Дл дулей тать 1 стью I щими НОЙ С1
где к\, к руемой
За!
считал
