CC BY
306
ВОРОЖЕЙКИН С.Б., ВОРОЖЕЙКИНА С.С.
АМИНОКИСЛОТЫ: ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ МЕТОДОВ ИХ АНАЛИЗА И РАЗДЕЛЕНИЯ
Среди разнообразия органических соединений, встречающихся в живой клетке, первое место занимают белки - на их долю приходится не менее 50% сухого веса клетки. Белки играют первостепенную роль в структуре и функциях клетки, поскольку именно они являются теми молекулярными инструментами, с помощью которых реализуется генетическая информация (1).
Белки представляют собой полимеры, построенные из б-аминокислот, общую формулу которых в водном растворе при значениях рН, близких к нейтральным, можно записать в виде:
Исследование аминокислотного состава является важным аналитическим методом для характеристики белков и пептидов и включает в себя расщепление этих соединений до свободных аминокислот, разделение последних, их идентификацию и количественное определение (1,2).
Я-СН-С
о
\
о
]МН,
В клетках и тканях встречается свыше 200 различных аминокислот. В составе белков обнаруживаются лишь 26 из них; обычными же компонентами белка можно считать лишь 19 аминокислот, а также иминокислоту пролин (3) (см. таблицу 1):
Таблица 1. Аминокислоты, входящие в состав белков
Аминокислота Сокращенное обоз- Я-.'Р ynr.il начепие Примечание
Алании Ала -СН3
Аргинин Аспарагин Арг Асн -{ону-мн-с —СН2—СО—1ЧН2 Основная аминокислота; для детей незаменимая К содержит амидогруппу
Аспарагиновая кислота Асп —СН^-СООН Кислая аминокислота
Цистеин Глутамин Глутаминовая кислота Глииин Гистидин Цис Глн Глу Гли Гис —сн2—бн —[СН^—СО—М12 —{сн^—соон —н с:н7 • >=< N ЫН V/ К содержит серу Я содержи! амидогруппу Кислая аминокислота Основная аминокислота; для детей незаменимая
Изолейцин Иле н -С--- с^ Чн3 Незаменимая аминокислота
Лейцин Личин Метионин Лей Лиз Мет СИ, / 3 —СН2— СИ хсн3 -[СН^-М!, [СН?)г—Б—СНЭ Незаменимая аминокислота Основная аминокислота; незаменимая Незаменимая аминокислота; Я содержит серу
Фенилаланин Фен Незаменимая аминокислота; Я содержит ароматическое кольцо
Пролин Про СН2'—-сн2 СН, \н СООН Имннокнслота (=N51 вместо ЫНг). В гид-роксипролине в положении, обозначенном звездочкой, один из атомов водорода заметен гидроксильной группой
Серии Сер —сн2-он
Треонин Тре /ОН _с----сн3 н —сн2 Незаменимая аминокислота
Триптофан Три со /т-Г\ к содержит ароматическое кольцо; незаменимая аминокислота
Тирозин Тир —сн2- (/ \ -он Я содержит ароматическое колыю
Валин Вал —сн хсн3 Незаменимая аминокислота
Растения синтезируют все необходимые им аминокислоты из более простых веществ. В отличие от них, животные (в т.ч. человек) не могут синтезировать все аминокислоты, в которых они нуждаются; часть из них они должны получать в готовом виде, т. е. с пищей. Эти последние принято называть незаменимыми аминокислотами (аргинин, валин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин и гистидин). Следует, однако, подчеркнуть: название "незаменимые" вовсе не означает, что эти аминокислоты в качестве компонентов животных белков в чем-то важнее остальных. "Незаменимы" они лишь в том смысле, что организм животного не способен их синтезировать (3).
Однако аминокислоты имеют большое функциональное значение не только как структурные элементы белков. Некоторые из них выступают в качестве нейромедиаторных веществ (глутаминовая и аспарагиновая кислоты, глицин, таурин, г-аминомасляная кислота и др.). Фенилаланин и тирозин являются предшественниками в биосинтезе дофамина, норадреналина и адреналина; триптофан - предшественником серотонина, а гистидин - предшественником гистамина. Производными аминокислот являются энкифалины, эндорфины, динорфины и другие нейропептиды (4,5).
Некоторые аминокислоты (глутаминовая, г-аминомасляная, глицин, метионин, гистидин, цистеин и таурин) нашли самостоятельное применение в качестве лекарственных средств, синтезируемых с помощью аминокислот. Например, даралгин (тирозил-2-аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинин) применяется в качестве лечебного средства при обострениях язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки; каптоприл - 1-[(28)-3-меркапто-2-метилпропионил]-Ь-пролин используется для лечения гипертонической болезни и застойной сердечной недостаточности; тимоген (глутамил-триптофан) - иммуностимулятор (5,6).
К другим областям применения аминокислот можно отнести использование их в качестве пищевых и кормовых добавок (4).
Актуальной задачей для современного здравоохранения является диагностика аминоацидурий -наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена аминокислот. Качественный и количественный анализ аминокислот, ответственных за возникновение различных отклонений в организме, является одним из наиболее информативных подходов в клинической и лабораторной диагностике (7,8).
Беря во внимание огромную важность и незаменимость аминокислот для нормального функционирования живого организма, следует отметить, что задача анализа и разделения аминокислот является актуальной для целого ряда научных областей таких, как биохимия, молекулярная генетика, медицина, фармакология и некоторых других.
Основные работы по разделению и определению аминокислот и аминов, а также родственных классов соединений проводились во второй половине XX века с применением метода тонкослойной хроматографии (далее ТСХ) (9,10).
Аминокислоты разделяли и разделяют на тонких слоях крахмала, целлюлозы, ацетилированной целлюлозы, оксидов алюминия и кальция, гидроксида железа, активного угля, гидроксида кальция, фосфата кальция, сульфата кальция, оксида магния, трисиликата магния, альгиновой кислоты, полиакрилонитрила, полиамида, сефадекса, кизельгура, анионо- и катионообменниках и силикагеле. Чаще других в качестве неподвижной фазы применяют силикагель и целлюлозу (11).
М. Бреннер и Нидервизер А., а также Фэми В. провели обширное исследование разделения аминокислот на силикагеле в; они получили величины ИТ(ЯГ- количественная характеристика, которая показывает отношение пути, пройденного центром зоны исследуемого компонента от линии старта, к пути, пройденном элюентом) для 26 соединений в различных растворителях. Разделение осуществляли на воздушно-сухих пластинах силикагеля в насыщенной атмосфере. Трудноразделимые пары соединений удалось эффективно разделить методом двухмерного хроматографирования с различными растворителями. После 10-минутной сушки хроматограмм при 110°С авторы обнаружили пятна аминокислот специальным реактивом Т-178. Получаемая при этом окраска пятен характерна для индивидуальных аминокислот. Длина пути разделения в этом случае составляет 10 см.(9,10).
Дж. Бенчлер и другие описали методику хроматографирования на пластинках меньших размеров при длине пути разделения 6 см. Они привели также значения ЯГ 16 аминокислот, полученные для 5 растворителей и смеси силикагеля и кизельгура. Для разделения аминокислот на силикагеле используется большое число систем растворителей. Так, Дж. Патаки исследовал разделение нескольких аминокислот на пяти различных силикагелях и обнаружил, что при одинаковых условиях некоторые гели обеспечивают лучшее разделение одних групп кислот и худшее других групп; следовательно, для достижения оптимальных результатов следует подбирать не только растворитель, но и сорт силикагеля (10,11).
Изучая методом М. Бреннера аминокислоты мочи, Е. Опиенска - Т. Блаут определили величины для 33 аминокислот в трех растворителях. Разделение групп лейцина и валина проводилось смесью фенол-м-крезол-боратный буфер при рН=9,3 в соотношении (1:1: 1). Для основных аминокислот использовалась смесь ацетон - пиридин - н-бутанол - вода - диэтиламин (15:9:15:8:10), а также пропанол - вода в соотношении (7:3) - растворитель Бреннера-Нидервизера. Р. Скиб разделил и количественно определил на слоях силикагеля аминокислоты, содержащиеся в образцах печени птиц. Для разделения этих аминокислот он использовал ступенчатое элюирование сначала смесью бутанол - уксусная кислота -
вода (3:1:1), а затем в том же направлении 75%-ным фенолом. Для количественного определения пятен, которые обнаруживали 0,25%-ным раствором нингидрина в ацетоне, использовали метод денситометрии при 525 нм (10,11).
Существует ряд комбинаций растворителей, которые пригодны для двухмерного разделения аминокислот и их производных на силикагеле; ниже указаны некоторые из этих комбинаций, успешно сочетаемые с силикагелем: этилацетат - изопропанол - вода - аммиак (40:40: 50: 30) в одном направлении и ацетон - вода - уксусная кислота - муравьиная кислота (50:15:12:3) или хлороформ - метанол -аммиак(4:4:1) - в другом; трет-амиловый спирт - метилэтилкетон - вода (6:2:2) и изопропанол - муравьиная кислота - вода (20:1:5) в перпендикулярном первому направлению; бутанол - уксусная кислота - вода (4:4:1), после чего смесь фенол - вода (3:1) (по массе), к которой добавлено 0,5 мл 5%-ного раствора цианида натрия; пропанол - вода (16:9) в одном направлении и бутанол - уксусная кислота в другом (11).
И. Шеллард и Д. Жолифе исследовали, как меняются величины ЯГ аминокислот экстракта пыльцы травы при хранении в 50%-ном глицерине. Совокупность значений ЯГ в четырех растворителях позволяет идентифицировать индивидуальные аминокислоты даже при изменении их ИТ.
Как видно из ряда работ, методом ТСХ анализировали в основном отдельные аминокислоты (реже смеси аминокислот) или биогенные амины, основываясь на тех или иных принципах отбора объектов анализа.
В 80-90 годы двадцатого столетия появились новые методики по улучшению как самого процесса хроматографирования, так и методов разделения аминокислот [12]. Так, для лучшего разделения и определения аминокислот и их смесей использовались различные добавки как в элюент, так и в смесь с аминокислотами: соли металлов производили изменение значений рН среды, добавление аминокислот в качестве модификаторов элюента (13;14).
В более поздних работах в качестве добавок в элюент, увеличивающих подвижность и уменьшающих размывание зон аминокислот при хроматографировании использовали раствор хитозана (15). Некоторые исследователи изучали влияние добавления циклодекстринов в подвижную фазу (элюент), в качестве модифицирующих агентов, способствующих лучшему разделению различных веществ, энантиомеров производных аминокислот и их зависимости от концентрации циклодекстринов (16). Целый комплекс работ был посвящен влиянию различных поверхностно-активных веществ (далее ПАВ) на изменение подвижности аминокислот как по отдельности, так и в различных смесях. Применение ПАВ в качестве элюента или динамической добавки в элюент для улучшения разделения аминокислот и ряда других веществ применяется и в различных современных исследованиях (17,18). В ряде работ были сделаны попытки нахождения оптимальных условий разделения аминокислот по группам (гидрофильные, гидрофобные, незаряженные) при помощи внедрения в элюент динамических модификаторов, таких, как хлороформ, хлористый метилен (19,20).
Наряду с методом ТСХ исследователи используют и другие методы по анализу аминокислот и родственных классов соединений: спектрофотометрическое определение, электрофорез и различные виды хроматографических методов. Большее применение и развитие получил метод высокоэффективной жидкостной хроматографии и тем самым несколько потеснил метод тонкослойной хроматографии, особенно в области количественного анализа и при разделении многокомпонентных смесей. Благодаря этому удалось добиться хорошего удерживания и разделения традиционно сложных веществ, в том числе свободных аминокислот (21,22).
Тем не менее, метод ТСХ и его разновидность (мицеллярная ТСХ), благодаря своей простоте, дешевизне оборудования, а главное высокой точности, получил наибольшую популярность среди исследователей и в настоящее время, поскольку анализ аминокислот этим методом требует значительно меньшего времени, чем хроматографирование на бумаге. Так, двумерное хроматографирование на бумаге длится несколько дней, тогда как методом ТСХ его можно осуществить за 4-5 часов. Другое преимущество ТСХ - повышенная чувствительность. Например, чувствительность определения гистамина этим методом в 2 раза выше, а чувствительность определения цистеиновой кислоты в 50 раз выше.
Метод ТСХ наиболее эффективно может применяться при проведении массовых анализов. Прогресс в использовании ТСХ обеспечен выпуском в России высокоэффективных ТСХ-пластин, оборудования для этого метода анализа и созданием денситометров таких, как видеоденситометр марки "ДенСкан" (ЗАО НТЦ "Ленхром") (23).
Tpi
Три. MÜF Ц>,|
Tav
Тир
те ~' _
пей
«Р
Sin А * о-прр
Birt
Lr - Li ul<hO Mat? i"«4j
Ul«£*
UrfCTetm Сйр«
про
rsyr Í-TB
aoii i-га
ори
ЛИЗ
llpl
~ЁГ*
Рис 1. Разделение аминокислот методом двухмерной ТСХ
Денситометрия применяется для количественной тонкослойной хроматографии в качестве альтернативы методу высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), требующей дорогостоящего оборудования и расходных материалов. НТЦ "Ленхром" разработаны методы разделения свободных аминокислот и их ДНС-производных с использованием одномерного и двухмерного вариантов тонкослойной хроматографии с последующей обработкой хроматограмм при помощи денситометра.
Двухмерная ТСХ дает возможность разделить большое количество соединений (до 22 аминокислот) на коротком расстоянии проявления - стандартная пластина размером 10x10 см (см. рис. 1). Одномерная ТСХ позволяет анализировать до десяти и более образцов аминокислот одновременно (23).
Однако, несмотря на многочисленные работы, проведенные за почти полувековой период, окончательного и полного ответа в вопросе разделения и определения аминокислот, ещё не найдено. Поэтому в настоящее время исследователи в области аналитической химии ведут поиск новых методик для эффективного разделения аминокислот и их производных как по отдельности, так и в многокомпонентных природных смесях.
1. Ленинджер А. Биохимия: молекулярные основы структуры и функций клетки.: Пер. с англ./Под
ред. А. А. Баева, Я. М. Варшавского. -М.: Мир, 1974. -960 с.
2. ЯкубкеХ.Д., Ешкайт X. Аминокислоты. Пептиды. Белки.-М.Мир, 1985.- 438 с.
3. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты. Пептиды и Белки.-М.: Мир, 1976. -362 с.
4. Дебабов В. Г. Биотехнология. -М.: Наука, 1994.- 425 с.
5. Машковский М. Д. Лекарственные средства, т.1,2. -М.: Новая волна, 2000.-544 с.
6. Марков В. Л., Варшавский А. Е. Наука и высокие технологии в России на рубеже третьего
тысячелетия. -М.: Наука, 2001. -635 с.
7. Наточин Ю.В. Введение в нефрологию: руководство для врачей. Под. ред. Ю. В. Наточин, Н. А.
Мухин. -М.: Гэотар-Медиа, 2007. -160 с.
8. Кнорре Д. Г. Биологическая химия /Д. Г. Кнорре, С. Д. Мызина. -М.: Высшая школа, 2003. -479 е..
9. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч.. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической
биохимии. -М.: Мир, 4.1, 1980. -450 с. Ю.Шталь Э., Хроматография в тонких слоях. -М.: Мир,1965.- 750 с. П.КирхнерЮ. Тонкослойная хроматография в 2 ч. Кн. 1-М.:Мир, 1981.-652 с.
12.Poole Colin F., Poole Salwa К. Modern thin-layer chromatography // Anal. Chem.. 1989. 61. № 22, P.1257-1262.
13.Ильясова P.P., Майстренко B.M. и др. Определение аминокислот в условиях ТСХ: -Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии". -Самара, 2005. -С.65-67.
14. Ларионова Д.А., Штыков С.Н. Разделение и количественное определение биологически активных
аминов методом ТСХ: - Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии". -Самара, 2005. -С. 126-127.
15.Калашникова О.М., Шаповалова Е.Н., Бархутова Д.Д. и др. Определение аминокислотного состава микробных матов водных экосистем Байкальского региона с помощью ТСХ. Вестник МГУ. Химия.-2004, Том 45.-№6.-С. 393-398.
16.Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н, Лопатин С.А. и др. Разделение производных энантиомеров аминокислот на аминированном b-циклодекстрине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Вестник МГУ. Химия.-2001,Том 42.-№4.-С.273-277.
17.J. Sherma, Barry P. Sleckman and Daniel W. Armstrong Chromatography of amino acids on reversed phase thin layer plates J. of liquid Chromatography, 1983.-V.6, P. 95-108.
18.A. Mohammad, A. Zehra Surfactants modified silica phase for sorption studies of essential amino acids by thin layer chromatography //Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, Volume 301, Issues 1-3, 5.- 2007. P. 404-411.
19.Ворожейкин С.Б., Романов О.Е. Влияние различных концентраций хлороформа на подвижность аминокислот //Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов.-Элиста, 2006. -С. 125-127.
20.Ворожейкин С.Б., Штыков С.Н. Влияние хлороформа и хлористого метилена на хроматографическое поведение аминокислот в ТСХ: Всероссийская конференция молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии": межвузовский сб. научных трудов.-Саратов, 2007. -С. 180-183.
21 .Metrione R. М. Separation of lissamine rhodamine sulfonyl derivative of amino acids by high-performance liquid chromatography and thin-layer chromatography// J. of Chromatographia. 1986. 363. -V. 2.-P. 337-344.
22.Чернобровкин М.Г., Ананьева И.А., Шаповалова Е.Н. и Шпигун О.А. - Определение энантиомеров аминокислот в фармацевтических препаратах методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. -М.: Журнал аналитической химии.-№1.-2004.-С. 46-50.
23.Малахова И.И. Количественная высокоэффективная тонкослойная хроматография аминокислот: Автореф. дис. канд. хим. наук: 05.11.11 /МГУ им. М.В. Ломоносова, М., 2003. -24 с. -Библиогр.: - С.22-24.
