CC BY
7
УДК579.64
Сергеев Е.Е., Игнашкова Д.А., Шабронов С.С., Раков Н.О., Суясов Н.А.
ИССЛЕДОВАНИЕ СООБЩЕСТВА МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОБРАЗЦОВ ПОЧВЫ ПОЛУОСТРОВА ЯМАЛ
Сергеев Егор Евгеньевич, студент 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; e-mail: sergeevegor217@gmail.com
Игнашкова Дарья Александровна, студентка 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Шабронов Сергей Сергеевич, студен 4 курса инженерного химико-технологического факультета; Раков Никита Олегович, студент 2 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии; Суясов Николай Александрович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии.
Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, Москва, Россия.
В данной статье рассматривается выделение сообщества метанокисляющих бактерий с образцов почвы полуострова Ямал. Описана динамика роста выделенных культур при различных температурах культивирования. Установлено наличие сообщества метанокисляющих бактерий в некоторых из исследуемых образцов.
Ключевые слова: Метанотрофы, сообщество метанокисляющих микроорганизмов, почва полуострова Ямал.
STUDY OF THE COMMUNITY OF METHANE-OXIDIZING BACTERIA ISOLATED FROM SOIL SAMPLES OF THE YAMAL PENINSULA
Sergeev Egor Evgenievich, Ignashkova Daria Alexandrovna, Shabronov Sergey Sergeevich, Rakov Nikita Olegovich, Suyasov Nikolay Alexandrovich
Mendeleev University of Chemical Technology, Moscow, Russia.
This article discusses the isolation of a community of methane-oxidizing bacteria from soil samples of the Yamal Peninsula. The growth dynamics of isolated cultures at different cultivation temperatures is described. The presence of a community of methane-oxidizing bacteria in some of the studied samples was established. Keywords: Methanotrophs, methane-oxidizing consortia, soil of the Yamal Peninsula
Природный газ является доступным натуральным сырьём. По запасам природного газа Россия занимает одно из первых мест в мире. Перспективным направлением использования природного газа с высоким содержанием метана является его биологическая конверсия сообществом метанокисляющих микроорганизмов [1].
Существующие технологии биоконверсии метана предусматривают получение микробной биомассы с содержанием белковых веществ порядка 70 %. А необходимость применения подобного рода источников белка связана с дефицитом белковых веществ в рационе людей. Высушенная биомасса может быть использована в качестве белковой добавки в корма для животных [2]. Помимо белка при комплексной переработке биомассы из неё могут быть выделены другие ценные продукты: каротиноиды, экзополисахариды, нуклеиновые кислоты (НК), нуклеотиды. Эти вещества востребованы в медицине, фармацевтике, а также в пищевой промышленности [3].
Ежегодный общемировой дефицит кормового белка превышает 30 млн т, а в России он составляет около 2-2,5 млн т. По данным Союза комбикормщиков, в нашей стране проблема частично решается за счёт импорта около 2,2 млн т белкового сырья и расширения посевных площадей сои на 500 тыс. га. Однако сложившаяся ситуация заставляет специалистов искать альтернативные способы производства кормового белка, открывая для бизнеса новые возможности.
Главный балансирующий ингредиент кормов — белково-витаминный концентрат (БВК) или попросту белок. Причём в кормах он должен быть как животного, так и растительного происхождения.
Источниками растительных белков выступают все злаковые, бобовые (соя), масличные культуры и др., вплоть до обычного сена и соломы. К белкам животного происхождения относится рыбная и мясокостная мука, сухие кормовые дрожжи, некоторые отходы перерабатывающей
промышленности и БВК.
Белки хорошего качества почти всегда имеют животное происхождения, поскольку подобные белки быстро усваиваются и содержат незаменимые аминокислоты в таких количествах, которые соответствуют потребностям животных. Однако белки, полученные из дешёвого животного сырья: жил, шкур, костей, других отходов мясной промышленности — усваиваются плохо и также являются бедными по аминокислотному составу. Также есть сложности применения рыбной муки в кормах. Мясо животных при выращивании которых использовалась рыбная мука вызывает аллергические реакции у людей с гиперчувствительностью.
В начале 1990-х годов на российском рынке появились большие объёмы сои по низким ценам, и это уничтожило промышленное производство кормовых белков из альтернативных источников. Дефицит стали восполнять сначала за счёт поставок североамериканской, а затем южноамериканской
сои, что поставило российских
сельхозпроизводителей в зависимость от конъюнктуры мировых рынков. Одним из способов наращивания объемов белка и решения вопроса импортозамещения является технология гаприна -высокобелковой биомассы, полученной при культивировании микроорганизмов на природном газе.
Метанотрофы были центром внимания с момента их открытия двумя независимыми исследователями в начале 20-го века. В 1906 году Bacillus methanicum была первой выделенной бактерией, окисляющей
CH4 [41.
Окисление CH4 до метанола является первой и ключевой ферментативной стадией метаболизма метанотрофов, которая катализируется
специализированной многокомпонентной
ферментной системой -метанмонооксигеназой (ММО), существующей в двух формах: растворимой (рММО), локализованной в цитоплазме, и мембранной (мММО), связанной с мембранами. Однако метанмонооксигеназа является
неселективным ферментом поэтому помимо метана способна окислять и его гомологи, присутствующие в определенной доле в природном газе, окисленные формы которых замедляют рост основной культуры. Поэтому для культивирования рекомендовано сообщество, состоящее из основного штамма и спутников.
Спутники усваивают продукты окисления гомологов метана способствуя тем самым росту основной культуры. Бактерии-спутники играют роль ассимиляции побочных продуктов окисления некоторых компонентов природного газа, таких как этан, пропан, бутан. Поэтому динамика роста целевой культуры зависит от численности и процентного соотношения сопутствующей микрофлоры.
В промышленном производстве кормового белка из природного газа используют стабильную и высокопродуктивную смешанную культуру Methylococcus capsulatus Bath с сопутствующими гетеротрофными бактериями Alcaligenes acidovorans DB3 (6-8 % клеток в конечной биомассе), Bacillus firmus DB 5 и Bacillus brevis DB4 (менее 1 % клеток). Роль A. acidovorans DB3 состояла в утилизации ацетата и пропионата, образующихся при соокислении сопутствующих газов - этана и пропана, а B. brevis DB4 и B. firmus DB5 - в утилизации метаболитов и продуктов лизиса клеток в среде культивирования [5]. Таким образом, была решена проблема ингибирующего действия на метанотрофную культуру продуктов кометаболизма. Сбалансированность по аминокислотному составу позволяет использовать продукт в качестве основного белка в кормах для рыб и домашних животных, свободного от генно-модифицированных организмов (ГМО) и природных токсинов, а также имеющего постоянный минеральный состав.
Основная задача промышленности -оптимизация, а, следовательно, увеличение
количества и повышение качества получаемой продукции. Возможными путями решения задач оптимизации являются экстенсивный и интенсивный подходы. Одним из способов реализации второго подхода можно рассматривать поиск новых штаммов и сообществ метанокисляющих для использования в производстве.
В данный момента на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета имени Д. И. Менделеева проводится выделение высокопродуктивных сообществ метанокисляющих. Цель работы заключается в получении новых штаммов, которые можно в дальнейшем использовать для получения биомассы с высокими показателями концентрации белка.
Выделение нового штамма метанокисляющих бактерий производилось с образцов почвы полуострова Ямал. Данный выбор был обусловлен географическим положением объекта - значительная часть территории Ямала расположена над газовыми месторождениями, газ из которых может диффундировать в почву и усваиваться микроорганизмами. Полуостров - один из наиболее богатых природным газом и газоконденсатом регионов России. Суммарные разведанные запасы достигают 11.5 миллиардов тонн нефтяного эквивалента [6]. Из вышесказанного следует, что Ямал является возможной территорией для поиска новых штаммов метанокисляющих бактерий.
Анализируя природный газ Ямала, можно заключить, что он достаточно чист (содержание гомологов метана мало, содержание азота редко повышает 1% по объему, низкое содержание углекислого газа, практически отсутствует сероводород) и преимущественно состоит метана и этана. Доля этана относительно мала в верхних газоносных отложениях, из которых газ диффундирует в почву. Поэтому можно ожидать, что состав метанокисляющих сообществ, развивающихся в почвах Ямала, будет приспособлен к потреблению метана, и доля спутников, потребляющих продукты соокисления гомологов метана, будет невелика.
Для выделения сообщества был использован метод накопительных культур, суть которого состоит в подборе таких условий, при которых данный организм преодолевает конкуренцию остальных. Подбирая ряд факторов (источники энергии, углерода, азота, акцепторы электронов, газовую атмосферу, освещенность, температуру, pH и т.д.), создают определенные условия и инокулируют среду смешанной популяцией, какая имеется, например, в почве или в иле. Наиболее приспособленный к такой среде микроорганизм растет и вытесняет все остальные, сопутствующие организмы. Путем многократных пересевов в такую же жидкую среду и посева на твердую среду того же состава можно без труда выделить преобладающий (накопленный) штамм. Частый пересев с жидкой среды на жидкую предотвращает рост сопутствующих организмов, которые могли бы использовать продукты выделения или даже автолиза клеток первичной культуры. [7].
Почва Ямала использовалась в качестве инокулята. Культивирование производилось методом последовательных пересевов в качалочных колбах. Для выделения и анализа сообщества были взяты разные образцы почвы и их комбинации, которые растили при различной температуре.
Так как климат Ямала довольно холодный ожидалось, что будут преобладать мезофильные культуры, но это не подтвердилось на практике. Напротив, наилучший рост наблюдался при температуре 41,5°С, в то время как умеренный рост наблюдался при 32,5°С. При комнатной же
В ходе работы выделено устойчивое сообщество метанокисляющих бактерий, способных усваивать метан как основной источник углерода. Установлена оптимальная температура для культивирования исследуемого сообщества. В данный момент ведутся генетические исследования для установления филогенетического разнообразия и численности метанотрофных бактерий с помощью высокопроизводительного секвенирования генов 16S рРНК, pmoA и mxaF. А также идет оценка качества полученной биомассы.
Список литературы
1. Ritala A. Single cell protein—state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001-2016 / Ritala, A., Häkkinen, S. T., Toivari, M. [et al.] // Frontiers in microbiology. - 2017. - V. 8. - P. 2009.
2. Pieja A. J. Methane to bioproducts: the future of the bioeconomy? / Pieja A. J., Morse M. C., Cal A. J. //
температуре рост практически отсутствовал или же был незначителен.
В ходе экспериментов было проведено микроскопирование препаратов исследуемого сообщества. На микрофотографиях можно увидеть в том числе и сопутствующую микрофлору, однако один вид, предположительно основная культура, количественно превалирует над минорной. В связи с этим количественный и качественный учёт бактерий-спутников проводили с помощью метода Коха. Во всех экспериментах обнаруживались два одинаковых типа бактерий-спутников. Данные исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1. Характеристика микробных изолятов.
Current opinion in chemical biology. - 2017. - V. 41. -P.123-131.
3. Макарова М. И. Получение биологически ценных полупродуктов на основе биомассы сообщества метанокисляющих микроорганизмов / М.И. Макарова, Н.А. Суясов, П.В. Самосадова [и др.] //Успехи в химии и химической технологии. - 2019. - Т. 33. - №. 5 (215).
4. Земская Т. И. Аэробные метанокисляющие бактерии водной толщи озера байкал.
5. Троценко Ю. А., Торгонская М. Л. Аэробные метилотрофы-перспективные объекты современной биотехнологии //Журнал Сибирского федерального университета. Биология. - 2012. - Т. 5. - №. 3.
6. Скоробогатов В. А., Строганов Л. В., Копеев В. Д. Геологическое строение и нефтегазоносность Ямала //М.: ООО «Недра-Бизнесцентр. - 2003.
7. Шлегель Г. Общая микробиология/под ред. ЕН Кондратьевой. - 1987.
Микробный изолят
Макроморфология
Микроморфология
Форма клеток
Взаимное расположение
Микрофотография
1
Колонии блестящие, кремового цвета, концентрические, с гладким краем и выпуклым профилем, диаметром 1-3 мм
кокки
Одиночные, диплококки
Колонии матовые, бело-серого цвета, круглые, с гладким краем, профиль с вдавленным центром и шероховатой поверхностью, диаметром 2 мм
палочки
Одиночные, редко
образующие цепочки
Колонии блестящие, бежевого цвета, круглые, с гладким краем и выпуклым профилем, диаметром 2 мм
палочки
Образуют скопления и цепочки
2
3
