CC BY
34
УДК 579.017.8:579.66
Ерохин Л.М., Алешкина А.А., Сергеев Е.Е., Карпов А.А., Суясов Н.А.
ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА НА РОСТ СООБЩЕСТВА МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Ерохин Леонид Михайлович, студент 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; e-mail: zestoren55@yandex.ru
Алешкина Анна Андреевна, студентка 2 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Сергеев Егор Евгеньевич, студент 3 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии; Карпов Андрей Аркадьевич, преподаватель кафедры физического воспитания; Суясов Николай Александрович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии. Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, Москва, Россия.
В данной статье рассматриваются условия культивирования сообщества метанокисляющих микроорганизмов на основе бактерии Methylococcus capsulatus. Описано влияние содержания источников меди и железа (II) в питательной среде на ростовые характеристики исследуемого сообщества. Установлено, что для ионов меди характерно явление ингибирования роста целевой культуры, а для ионов железа(П) - лимитирования и ингибирования.
Ключевые слова: Methylococcus capsulatus, метанотрофы, сообщество метанокисляющих микроорганизмов.
INFLUENCE OF THE CONCENTRATION OF COPPER AND IRON IONS ON THE GROWTH OF A METHANE-OXIDIZING CONSORTIUM
Erokhin Leonid Mikhailovich, Aleshkina Anna Andreevna, Sergeev Egor Evgenievich, Karpov Andrey Arkadyevich, Suyasov Nikolay Alexandrovich
Mendeleev University of Chemical Technology, Moscow, Russia.
This article discusses the conditions for the cultivation of a methane-oxidizing consortium based on the bacterium Methylococcus capsulatus. The influence of the content of sources of copper and iron (II) in the medium on the growth characteristics of the studied consortium was described. It was found that copper ions are characterized by the process of inhibition of the growth of the consortium. It was shown that the processes of both inhibition and limitation are characteristic of iron (II) ions.
Keywords: Methylococcus capsulatus, methanotrophs, methane-oxidizing consortia.
Введение
Природный газ является доступным натуральным сырьём. По запасам природного газа Россия занимает одно из первых мест в мире. Перспективным направлением использования природного газа с высоким содержанием метана является его биологическая конверсия сообществом
метанокисляющих микроорганизмов [1].
Существующие технологии биоконверсии метана предусматривают получение микробной биомассы с содержанием белковых веществ порядка 75 %. Высушенная биомасса может быть использована в качестве белковой добавки в корма для животных [2]. Помимо белка при комплексной переработке биомассы из неё могут быть выделены другие ценные продукты: каротиноиды, экзополисахариды, нуклеиновые кислоты (НК), нуклеотиды. Эти вещества востребованы в медицине, фармацевтике, а также в пищевой промышленности [3].
Описываемые метанокисляющие
микроорганизмы не способны включать в метаболизм соединения, имеющие углерод-углеродные связи [4], в то время как природный газ, помимо метана, содержит этан, пропан, бутан. Под действием метанмонооксигеназы, ключевого фермента метанокисляющих бактерий, данные сопутствующие
соединения окисляются и накапливаются в среде, ингибируя рост целевой культуры. Окисленные соединения усваивают другие виды бактерий, образующие сообщество, тем самым снимая ингибирующий эффект [5].
Упомянутый выше фермент
метанмонооксигеназа (ММО) в клетках метанотрофов представлен двумя различными формами: мембраносвязанной (мММО) и растворённой в цитоплазме (рММО). Утверждается, что мММО является медь- и железо-зависимым ферментом, а рММО железозависимым. При этом в качестве кофактора в данных ферментах присутствует двухвалентное железо. Отмечается также, что активность мММО выше, чем рММО [6]. Если для микроорганизма характерны обе формы метанмонооксигеназы, то в зависимости от концентрации ионов меди в питательной среде преимущественную роль в катализе играет одна из них. Данный механизм получил название «медный переключатель» [7]. То есть содержание меди в среде должно оказывать прямое влияние на ростовые характеристики сообщества метанокисляющих микроорганизмов.
Подобного рода зависимости характерны и для других компонентов питательной среды. Например,
при недостатке в среде аммонийного азота у многих метанотрофов активируется нитрогеназная система и осуществляется переход к азотфиксации [8], что сопровождается уменьшением удельной скорости роста бактерий, то есть наблюдается лимитирование роста микроорганизмов по азоту. С другой стороны, избыток аммонийного азота приводит к ингибированию ММО по конкурентному механизму [9]. Явления лимитирования и ингибирования наблюдаются и в случае железа. Помимо того, что данный элемент входит в состав ММО, он также является кофактором и для других ферментов, например, системы цитохромов [10], поэтому очевидна его необходимость для жизнедеятельности метанотрофов. При избытке железо оказывает на клетки ингибирующее воздействие, характерное для многих тяжёлых металлов [11].
Экспериментальная часть
В качестве объекта исследования использовалось сообщество метанокисляющих микроорганизмов на основе облигатного метанотрофа - бактерии МеЛу1ососсш capsulatus. Микрофотография исследуемого сообщества приведена на рисунке 1.
Щ: *
С
■ 4 Ж: <'
V " * •■• ^ ; Л
,: * 4 ^ 1 *
Рис.1. Микрофотография сообщества метанокисляющих бактерий
Культивирование вели в качалочных колбах при температуре 41,5°С, каждые 12 часов проводили отбор проб и доводили рН до значения 6,0 с помощью стандартного водного раствора аммиака с концентрацией 0,025% масс. Параллельно инкубировали четыре колбы с различным содержанием ионов исследуемого металла. Объём жидкой фазы в качалочных колбах составлял 1/10 часть от номинального объёма. Оставшийся объём раз в 12 часов заполнялся метано-воздушной смесью с содержанием метана 25% об. Раствор минеральных компонентов готовился на дистиллированной воде и содержал источники фосфора, азота, меди, железа, серы, бора, цинка, магния, марганца и др. Оценку концентрации биомассы проводили
турбидиметрическим способом - с помощью измерения оптической плотности клеточной суспензии при длине волны 540 нм.
Для определения оптимального содержания солей меди и железа (II) в растворе минеральных компонентов осуществляли параллельное
культивирование исследуемого сообщества при следующем содержании ионов: меди - 0, 1,27, 2,54 и 12,7 мг/л; железа (II) - 0, 2,16, 6,48 и 26,0 мг/л.
Для каждого вида ионов осуществляли 10 последовательных пассажей с приблизительной начальной концентрацией клеток 0,1 г/л. Время культивирования после каждого пассирования составляло 84 часа. Усреднённая динамика изменения концентрации биомассы во время культивирования при различном содержании в среде меди показана на рисунке 2.
Рис.2. Рост бактериального сообщества при различных концентрациях ионов меди
Как видно из представленных данных, наибольшее накопление биомассы происходило при концентрации меди 1,27 мг Си2+/л. Сопоставимые значения получены для концентрации 2,54 мг/л. Для содержания ионов меди 12,7 мг/л характерно угнетение роста исследуемой культуры. При полном отсутствии добавленных источников меди рост исследуемой культуры хоть и менее значителен, чем при её неингибирующих концентрациях, однако обеспечивает максимальную концентрацию биомассы на уровне 1,1 г/л. Данное явление требует дополнительных исследований.
На рисунке 3 продемонстрированы кривые роста изучаемого бактериального сообщества в зависимости от содержания железа в питательной среде.
2 X, г/л
1,6
1,2
0,8
0,4 . 1—1——'
0
0 20 40 60 80 100 —•—Омг/л —■—2,16мг/л X 6,48мг/л * 21,6мг/л ^ ^
Рис.3. Рост бактериального сообщества при различных концентрациях ионов железа (II)
Таким образом, наиболее интенсивный рост бактериального сообщества наблюдался при начальной концентрации ионов железа 2,16 мг/л, немного меньший прирост биомассы фиксировался
при содержании железа 6,48 мг Fe^/л в питательной среде. При отсутствии железа в растворе минеральных компонентов наблюдалось
незначительное увеличение концентрации биомассы в ходе культивирования, а при содержании ионов железа 21,6 мг/л рост сообщества практически отсутствовал. Полученные данные позволяют говорить о лимитировании и ингибировании, соответственно, исследуемой культуры ионами Fe2+.
Выводы
В ходе работы предварительно установлены оптимальные концентрации ионов меди (II) и железа (II) для культивирования сообщества метанокисляющих микроорганизмов на основе Methylococcus capsulatus. Они составили 1,27 мг Си2+/л и 2,16 мг Fe^/л. Обнаружено, что отсутствие добавленных источников меди в питательной среде не приводит к ярко выраженному лимитированию роста культуры. Зафиксировано ингибирование роста при концентрации ионов меди 12,7 мг/л. Показано, что для ионов двухвалентного железа по отношению к исследуемому сообществу характерны явления лимитирования при полном отсутствии соответствующих солей в питательной среде и ингибирования при содержании 21,6 мг Fe^/л.
Список литературы
1. Ritala A. Single cell protein—state-of-the-art, industrial landscape and patents 2001-2016 / Ritala, A., Häkkinen, S. T., Toivari, M. [et al.] // Frontiers in microbiology. - 2017. - V. 8. - P. 2009.
2. Pieja A. J. Methane to bioproducts: the future of the bioeconomy? / Pieja A. J., Morse M. C., Cal A. J. // Current opinion in chemical biology. - 2017. - V. 41. -P.123-131.
3. Макарова М. И. Получение биологически ценных полупродуктов на основе биомассы сообщества метанокисляющих микроорганизмов / М.И.
Макарова, Н.А. Суясов, П.В. Самосадова [и др.] //Успехи в химии и химической технологии. - 2019. -Т. 33. - №. 5 (215).
4. Kelly D. P. Insights into the obligate methanotroph Methylococcus capsulatus / Kelly D. P., Anthony C., Murrell J. C. // Trends in microbiology. - 2005. - V. 13. - №. 5. - P. 195-198.
5. Nunes J. J. Enhanced production of single cell protein from M. capsulatus (Bath) growing in mixed culture / Nunes J. J., Aufderheide B., Ramjattan D.M. [et al.] // Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences. - 2020. - V. 2020. - P.894-899.
6. Штейнман А. А. Биоинспирированное окисление метана: от академических моделей метанмонооксигеназ к процессу прямого получения метанола // Кинетика и катализ. - 2020. - Т. 61. - №. 3. - С. 312-333.
7. Murrell J. C. Molecular biology and regulation of methane monooxygenase / Murrell J. C., Gilbert B., McDonald I. R. //Archives of microbiology. - 2000. - V. 173. - №. 5. - P. 325-332.
8. Murrell J. C., Dalton H. Nitrogen fixation in obligate methanotrophs // Microbiology. - 1983. - V. 129. - №. 11. - P. 3481-3486.
9. Carlsen H. N. Inhibition by ammonia of methane utilization in Methylococcus capsulatus (Bath) / Carlsen H. N., Joergensen L., Degn H. // Applied Microbiology and Biotechnology. - 1991. - V. 35. - №. 1. - P. 124127.
10. Tanaka K. Extracellular electron transfer via outer membrane cytochromes in a methanotrophic bacterium Methylococcus capsulatus (Bath) / Tanaka K., Yokoe S., Igarashi K. [et al.] // Frontiers in microbiology. - 2018. -V. 9. - P. 2905.
11. Авдеева Л. В., Гвоздев Р. И. Действие солей тяжелых металлов на процесс окисления пропилена бактериями-метанотрофами // Химическая физика. -2019. - Т. 38. - №. 11. - С. 52-57.
