CC BY
47
УДК 60
Беспалова О.С., Суясов Н.А., Макарова М.И., Самосадов М.С.
ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ СООБЩЕСТВА МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ОСНОВЕ METHYL OMONAS METHANICA
Беспалова Ольга Сергеевна, студентка 4 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, e-mail: [email protected];
Суясов Николай Александрович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Макарова Марина Игоревна, студентка 1 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Самосадов Максим Сергеевич, студент 1 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии.
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Исследовалась возможность направленного формирования сообщества на основе Methylomonas methanica. Были проанализированы показатели накопления биомассы при культивировании Methylomonas methanica и микробной ассоциации на её основе в метан-воздушной и метан-этан-воздушной атмосфере. Показано, что при культивировании ассоциативной культуры на метан-этановой смеси концентрация биомассы увеличивается на 44% по сравнению с монокультивированием.
Ключевые слова: метанокисляющие микроорганизмы; микробные сообщества; кормовой белок.
STUDY OF THE PROPERTIES OF A COMMUNITY OF METHANE-OXIDIZING MICROORGANISMS BASED ON METHYLOMONAS METHANICA
Bespalova O.S., Suyasov N.A., Makarova M.I., Samosadov M.S.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
The possibility of directed microbial community formation based on Methylomonas methanica was investigated. The indicators of biomass accumulation during the cultivation of the monoculture Methylomonas methanica and the microbial association with its participation in the methane-air and methane-ethane-air atmosphere were analyzed. It has been shown that the cultivation of an associative culture with the use of methane-ethane mixture increases the biomass concentration by 44% compared with monocultivation.
Keywords: methane-oxidizing microorganisms, microbial community, feed protein.
Метанокисляющие бактерии представляют собой обособленную группу микроорганизмов, отличительной особенностью которых является использование метана и продуктов его частичной диссимиляции в качестве единственного источника углерода и энергии. Основным сырьем для выращивания метанотрофов является природный газ, содержание метана в котором составляет 70 -98%, в зависимости от месторождения, на остальную долю приходятся его гомологи: этан, пропан, бутан и т.д. Данные примеси не только не способствуют, но иногда и подавляют рост микроорганизмов. Аналогичное влияние оказывают продукты метаболизма, образующиеся и накапливающиеся в культуральной жидкости вследствие т.н. соокиления - способности метанотрофов окислять в присутствии метана различные органические соединения, не используя их как источник углерода[1]. Для удаления из среды ингибирующих соединений, а также стабилизации процесса целесообразно использовать сообщества микроорганизмов. Кроме того доказано, что
сопутствующая микрофлора положительно влияет на скорость роста и количество биомассы.
В ходе исследований было установлено, что в состав ферментационной среды при культивировании входят основной штамм-продуцент, автохтонная (сопутствующая) и аллохтонная (случайная) микрофлора, а также патогенные микроорганизмы. Сопутствующая микрофлора - бактерии, которые постоянно присутствуют в сообществе в доминирующем количестве. Они ассимилируют экзометаболиты основного штамма и усваивают гомологи метана (С2-С4). Случайная микрофлора - микрофлора, которая попадает в культуральную жидкость с поступающими потоками воды, газовой смеси, воздуха. Не оказывает влияния на процесс, но способна активно развиваться при нарушении физико-химических параметров. Инфицирующая микрофлора - условнопатогенные или патогенные микроорганизмы, присутствие которых является показателем нарушения процесса. Развиваются на продуктах лизиса метанотрофов [2].
Продукты биоконверсии природного газа в микробную биомассу представляют интерес для медицины, пищевой промышленности, сельского хозяйства. Метанотрофы широко применяются для получения кормового белка - гаприна, который представляет собой биомассу инактивированных клеток метанокисляющих микроорганизмов. По составу это продукт с высоким содержанием белка (70-79%), витаминов, аминокислот и микроэлементов. Его получение является
перспективным направлением в
сельскохозяйственной отрасли России.
Целью данной работы являлось изучение возможности направленного формирования сообщества на основе Methylomonas те(Иатса В-2110 и изучение показателей его роста в сравнении с монокультурой.
Культивирование микроорганизмов
осуществлялось в колбах Эрленмейера объемом 1000 мл, с заполнением питательной средой 50 мл в метан-воздушной и метан-этан-воздушной атмосфере.
В качестве источников углерода использовались метан и метан-этановая смесь (92% СН4, 8% С2Нб).
При проведении экспериментов использовалась среда П [1]: КШз - 1,0 г/л , 1^04*7^0 - 0,2 г/л, СаСЬ - 0,02 г/л, Ка2НР04*5Н20 - 1,5 г/л, КН2РО4 -0,7 г/л, Си804*5Нг0 - 0,1 мг/мл, ^804*7^0 - 2,0 мг/мл, 2пБ04*7Н20 - 0,1 мг/мл, Ка2Мо04*2Н20 -0,03 мг/мл, СоС12*6Н20 - 0,2 мг/мл, трилон Б (Ка2ББТЛ) - 5,0 мг/мл,МпС12*4Н20 - 0,03 мг/мл, №СЬ*6Н20 - 0,02 мг/мл.
Источник для исследования представляет собой бактериальный штамм Methylomonas теАатса В-2110 из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Данный штамм обладает типичными признаками для вида Methylomonas те^атса: клетки в форме слегка изогнутых или овальных палочек, отрицательный Г-тип. Колонии на твердой агаризованной среде округлые, выпуклые, цвет варьируется от розового до темно-коричневого. В качестве источников углерода усваивает метан и метанол (0,1%).
В ходе данной работы были исследованы показатели накопления биомассы при монокультивировании Methylomonas те^атса В-2110, а также искуственно сформированной ассоциации.
Для проведения процесса совместного культивирования с использованием Methylomonas methanica В-2110 был выделен основной спутник из промышленного сообщества на основе Methylococcus capsulatus. Выделение
осуществлялось путем высева на твердую агаризованную среду Ь-бульон. Полученный микробный изолят представлял собой Г+-палочки, на агаризованной среде развиваются в виде выпуклых округлых колоний полупрозрачного бежевого цвета. В результате генетической идентификации определено, что данный микроорганизм принадлежит к виду Cupriavidus gilardii.
Для данного штамма была исследована возможность использования различных соединений в качестве источника углерода. Установлено, что Cupriavidus gilardii способен усваивать глюкозу, пептон, метанол, этанол, изопропиловый спирт и бутанол-1.
Показатели роста монокультуры Methylomonas methanica В-2110 в метан-воздушной и метан-этан-воздушной атмосфере представлены на рис. 1.
—♦—метан-этановая смесь
-■-мотан
Рис. 1.Динамика роста монокультуры Methylomonas шеШашеа В-2110 на различных субстратах
Как видно из полученных данных, показатели накопления биомассы в метан-этан-воздушной атмосфере составило 0,57 г/л, в то время как в метан-воздушной данный показатель достиг 0,64 г/л, из чего можно заключить, что присутствие этана в атмосфере культивирования подавляет рост целевого штамма. Такой эффект, по-видимому, обусловлен тем, что этан подвергается окислению метанмонооксигеназой с образованием этанола, который способен ингибировать рост метанокисляющих бактерий.
Исследование сообщества осуществлялось с помощью контроля показателей накопления биомассы и количества микроорганизмов-спутников. Количество микроорганизмов-спутников определялось путем высева проб на агаризованную среду Ь-бульон. Закономерно, что число спутников в метан-этан-воздушной атмосфере на несколько порядков выше, чем в метан-воздушной, при этом их количество в обоих экспериментах сохраняется на одном уровне и даже несколько увеличивается в ходе пересевов, что говорит об устойчивости данной микробной ассоциации.
Показатели накопления биомассы микробной ассоциацией представлены на рис. 2.
—*—биймАыа (глеган)
(рдегэм.эгэновдя
Рис. 2. Показатели накопления биомассы смешанной культуры. Числами указан титр микроорганизма-спутника
В метан-воздушной атмосфере концентрация биомассы достигает 0,57 г/л, что незначительно отличается от показателя для монокультуры, в то время как в метан-этан-воздушной данный показатель достиг 0,64 г/л.
Такой результат, по-видимому, обусловлен присутствием этана, который окисляется ммо до этанола и ассимилируется бактериями-спутниками, тем самым способствуя их активному росту.
На основании полученных данных можно говорить о том, что использование ассоциативной культуры является целесообразным при культивировании на природном газе.
Присутствие значительного количества сопутствующей микрофлоры говорит о том, что
бактерии-спутники активно усваивают этанол -продукт соокисления метанотрофных бактерий. Показатели роста чистой культуры в тех же условиях ниже, так как этанол способен ингибировать развитие метанокисляющего штамма.
В атмосфере чистого метана наблюдается значительный рост монокультуры Methylomonas те^атеа по сравнению со смешанной. При культивировании микробного сообщества сопутствующая микрофлора присутствует в гораздо меньших количествах по причине отсутствия примесных газов. Незначительное число спутников говорит о том, что они ассимилируют метанол (промежуточный метаболит в цепи окисления метана метанотрофными бактериями) в качестве источника углерода.
Таким образом, в ходе исследования было установлено, что при использовании природного газа целесообразно применение смешанных культур, которые могут быть сформированы искусственно, в частности, при выделении микроорганизмов из других сообществ.
Список литературы
1. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии// М.:ГЕОС. 2001. 500с.
2. Харченко И. В. Роль сопутствующей микрофлоры при производстве гаприна в районе Нижнего Поволжья: дис...канд. биол. наук: 03.00.23. - Москва, 1993. - 131 с.
