CC BY
62
УДК 579.66
Макарова М.И., Суясов Н.А., Самосадова П.В., Беспалова О.С.
ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ ЦЕННЫХ ПОЛУПРОДУКТОВ НА ОСНОВЕ БИОМАССЫ СООБЩЕСТВА МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Макарова Марина Игоревна, студентка 1 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии, e-mail: marina97@inbox.ru;
Суясов Николай Александрович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Самосадова Полина Викторовна, студентка 1 курса магистратуры факультета биотехнологии и промышленной экологии;
Беспалова Ольга Сергеевна, студентка 4 курса факультета биотехнологии и промышленной экологии. Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20
Данная работа посвящена выделению нуклеиновых кислот из биомассы сообщества метанокисляющих микроорганизмов. Биомасса, полученная при культивировании сообщества метанокисляющих микроорганизмов на природном газе, характеризуется высоким содержанием белка и может использоваться в качестве кормовой добавки в сельском хозяйстве. При этом существует необходимость выделения нуклеиновых кислот, так как их избыток может быть опасен для животных. Нуклеиновые кислоты содержатся в биомассе в большом количестве и могут использоваться во многих сферах медицины.
Ключевые слова: гаприн, комплексная переработка биомассы, метанокисляющие микроорганизмы, нуклеиновые кислоты
OBTAINING BIOLOGICAL VALUE SEMIFINISHED PRODUCTS BASED ON THE BIOMASS OF A METHANE-OXIDIZING MICROORGANISM BIOCENOSIS
Makarova M.I., Suyasov N.A., Samosadova P.V., Bespalova O.S.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
This paper is devoted to the extraction of nucleic acids from the biomass of a methane-oxidizing microorganism biocenosis. The biomass obtained from the cultivation of the methane-oxidizing microorganism biocenosis on natural gas is characterized by high protein content, and it can be used as a feed additive in agriculture. For this purpose, there is a need to isolate nucleic acids, since their excess can be dangerous for animals. Nucleic acids are contained in biomass in large quantities, and they can be used in many fields of medicine.
Keywords: gaprin, complex processing of biomass, methane-oxidizing microorganisms, nucleic acids
Нуклеиновые кислоты являются основой многих препаратов медицинского назначения. Установлено, что нуклеиновые кислоты являются
иммуномодуляторами в организме,
антиоксидантами, восстанавливают клетки и повышают способность тканей к регенерации, стимулируют процессы обновления клеток. Производные нуклеиновых кислот способны оказывать противомикробное, противовирусное и противоопухолевое действие [1]. Их широкое применение обуславливается низкой токсичностью, хорошей переносимостью пациентами, а также препараты на основе ДНК практически не обладают побочными эффектами. В данный момент препараты на основе нуклеиновых кислот применяются для лечения пищевых аллергий, онкологических заболеваний, для лечения и профилактики инфекционных заболеваний и многих других. Препараты на основе нуклеината натрия применяются не только в медицине, но и в животноводстве и птицеводстве для стимуляции роста и развития животных.
В современных условиях существует дефицит нуклеиновых кислот. Он обусловлен тем, что в данный момент нуклеиновые кислоты выделяют из молок осетровых рыб, что является дорогим и сложным методом. При этом существуют альтернативные источники нуклеиновых кислот, которые являются перспективной заменой традиционных методов. Оптимальным является использование бактериальной биомассы, так как она характеризуется большим содержанием
нуклеиновых кислот. Одним из вариантов является биомасса сообщества метанокисляющих
микроорганизмов. В ходе культивирования биомассы метанокисляющими микроорганизмами на природном газе возможно производство высокобелкового продукта - гаприна, который может использоваться в сельскохозяйственной промышленности как кормовая добавка с высоким содержанием витаминов группы В. Использование природного газа как микробиологического сырья обуславливается низкой себестоимостью его добычи, значительными залежами в России, сокращением экспорта и независимостью от смены
климата и сезонов. Требования к кормам подразумевают низкое содержание нуклеиновых кислот, поэтому их выделение необходимо для применения биомассы в сельском хозяйстве [2]. Полученная в ходе культивирования биомасса является ценным высокобелковым продуктом. В ней содержится 70-75% от СВ протеина, 8-11% нуклеиновых кислот, 8-10% липидов, 6-8% углеводов. Также в биомассе метанокисляющих микроорганизмов содержатся такие ценные полупродукты, как полисахариды, каратиноиды и т.д. [3].
Получение биомассы сообщества
метанокисляющих микроорганизмов является крупнотоннажным процессом. В ходе комплексной переработки возможно выделение нуклеиновых кислот. При этом целесообразно разработать технологию и последовательность выделения различных биологически активных веществ. В связи с этим, целью данной работы стало исследование экстракционного извлечения нуклеиновых кислот из состава биомассы метанокисляющих
микроорганизмов, а также оценка эффективности и влияния обезжиривания.
Контроль эксперимента осуществлялся путем определения следующих параметров в составе биомассы: белковых веществ (метод Лоури), сырого протеина (метод Къельдаля), нуклеиновых кислот (метод Спирина), ДНК (метод Дише), липидов (в аппарате Сокслета).
Для выделения нуклеиновых кислот необходимо подобрать оптимальные условия экстракции. Показано, что на экстракцию нуклеиновых кислот влияет ряд факторов, при этом наибольшее влияние оказывают температура, содержание сухих веществ в суспензии и концентрация диаммонийфасфата, который использовался в качестве экстрагента. С увеличением содержания сухих веществ в суспензии повышается степень экстракции нуклеиновых кислот. При этом максимальное их извлечение достигается при 870С и концентрации диаммонийфосфата 1 моль/л. Минимальный выход белковых веществ в раствор достигается при повышенных концентрациях диаммонийфосфата и высоких температурах. Аналогично, содержание сырого протеина в денуклеинизированной биомассе остается высоким при повышенных температурах, при этом разница при температурах 87 и 95 градусов незначительна, увеличение температуры не целесообразно. Таким образом, для сохранения белковых веществ оптимально проведение процесса при 87 градусах, концентрации диаммонийфосфата 2 моль/л.
В дальнейшем применялись следующие условия, которые были определены как оптимальные для выделения нуклеиновых кислот из
биомассы сообщества метанокисляющих
микроорганизмов в ходе комплексной переработки: температура - 870С, концентрация
диаммонийфосфата 1,5 моль/л и концентрация биомассы 8% по СВ. Денуклеинизация проводится в течение 3 часов, увеличение продолжительности экстракции может негативно влиять на структуру нуклеиновых кислот, так как возможно ее разрушение при длительном воздействии температуры.
Процесс экстракции нуклеиновых кислот может быть оптимизирован. Имеются данные о том, что предварительное выделение липидов повышает степень экстракции нуклеиновых кислот [4]. Выделение ДНК клеток некоторых бактерий заблокировано липидами. В ходе обезжиривания происходит разрушение мембран, что помогает существенно облегчить выделение полинуклеотидов и, таким образом, повысить степень экстракции нуклеиновых кислот. Также стадия обезжиривания позволяет не проводить отдельно стадию инактивации биомассы. Выделенные простые липиды применяются в промышленности, где используются в качестве технологической смазки. Также липиды используются в мыловарении, спирты, присутствующие в липидах, используются для получения витамина Б, убихинона, которые применяются в медицине и сельском хозяйстве.
Для достижения максимальной степени извлечения липидов необходимо проводить экстракцию раствором этанол-хлороформ (1:2) в течение 2,5 часов. В ходе спектрофотометрического анализа получены спектры экстрактов, которые обладают пиками на 260 нм, что соответствует пику поглощения нуклеиновых кислот. Показано, что при продолжительном обезжиривании начинают экстрагироваться не только липиды, но и нуклеиновые кислоты.
При переработке биомассы для максимального выделения нуклеиновых кислот следует сократить время обезжиривания до 60 минут, при этом степень экстракции липидов снижается до 70%.
При обезжиривании биомассы в течение 150 минут и последующей денуклеинизации концентрация нуклеиновых кислот в экстракте меньше, чем в случае нативной биомассы. В случае биомассы, обезжиренной в течение 60 минут, концентрация нуклеиновых кислот выше. Из этого следует, что обезжиривание позитивно влияет на конечную концентрацию нуклеиновых кислот в экстракте, но при условии неполного и непродолжительного обезжиривания. На рисунке 1 представлены графики изменения концентрации нуклеиновых кислот во времени в ходе денуклеинизации.
Рис. 1. Концентрация нуклеиновых кислот в экстракте при денуклеинизации необезжиренной биомассы Ме1ку1ососсш са/пи/Ши, (а), обезжиренной течение 150 минут (б), обезжиренной в течение 60 минут (в)
В ходе денуклеинизации необезжиренной биомассы в экстракт частично выделяется белок, но в целом незначительно. При предварительном обезжиривании белок вымывается в экстракт в среднем, на 32% больше по сравнению с необезжиренной биомассой. Содержание сырого протеина в конечном продукте, который может использоваться в качестве белковой добавки в кормах, составляет 70,08% для биомассы Methylococcus capsulatus.
Данный способ экстракции также может быть использован для биомасс Methylobacter sp. и Methylocystis parvus. В ходе исследования были получены результаты, аналогичные
денуклеинизации Methylococcus capsulatus. Обезжиривание в течение 60 минут повышает выход нуклеиновых кислот, при этом потери белка увеличиваются в среднем на 30%.
В ходе комплексной переработки биомассы метанокисляющих микроорганизмов при выделении биологически активных веществ для получения субстанций нуклеиновых кислот оптимально использовать ультрафильтрационное разделение. При использовании мембран с отсекаемыми молекулярными массами 100 и 10 кДа и методов осаждения и переосаждения при pH 2, могут быть получены субстанции нуклеиновых кислот, в которых содержится 2,44 г/л ДНК и 2,57 г/л РНК.
Нуклеиновые кислоты - одни из наиболее ценных полупродуктов, которые могут быть выделены из биомассы сообщества метанокисляющих микроорганизмов.
Предварительное обезжиривание повышает степень экстракции нуклеиновых кислот и их выделение. Данная технология предусматривает максимально простые и легко реализуемые процессы, отсутствие токсичных соединений в ходе выделения, что позволяет использовать биомассу с максимальной экономической выгодой.
Список литературы
1. Федянина Л. Н. и др. Лекарственные препараты и биологически активные добавки к пище на основе нуклеиновых кислот различного происхождения //Тихоокеанский медицинский журнал. - 2007. - №. 4 (30).
2. Волова Т. Г. и др. Введение в биотехнологию. - 2008.
3. Гальченко В. Ф. Метанотрофные бактерии. -М : ГЕОС, 2001.
4. Крылов И. А., Красноштанова А. А., Гусева И. И. Комплексная переработка биомассы промышленных микроорганизмов. - 2001.
