CC BY
31
УДК 60
Дубинкин И.А, Самосадова П.В, Суясов Н.А.
ВЫДЕЛЕНИЕ МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ ОРГАНИЗМОВ ИЗ ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦОВ
Дубинкин Иван Александрович, студент 4 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии; email: nikto-2012@yandex.ru;
Самосадова Полина Викторовна, студентка 1 курса магистратуры факультета Биотехнологии и промышленной экологии;
Суясов Николай Александрович, к.т.н., доцент кафедры биотехнологии;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская пл., д.9
Данная работа посвящена изучению образца почвы района газодобычи на Ямале и выделению из него метанокисляющего сообщества. Были проанализированы основные физико-химические и микробиологические свойства почвы. Метанотрофное сообщество было выделено методом накопительных культур.
Ключевые слова: метанокисляющие микроорганизмы, выделение, Ямал
ISOLATION ON METHANE-OXIDIZING ORGANISMS FROM SOIL SAMPLES
Dubinkin I.A., Samosadova P.V., Suyasov N.A.
D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
This work is dedicated to studying soil sample, obtained from gas-extracting area of Yamal, and isolation of methanotrophic community. The main physico-chemical and microbiological properties of soil were examined. Methanotrophic community was enriched and isolated.
Keywords: methane-oxidizing microorganisms,, isolation, Yamal
Метанотрофы - особая группа бактерий, отличающаяся способностью к использованию метана в качестве единственного источника углерода [1]. Метанотрофы чаще всего встречаются в природе в составе метанокисляющих сообществ, куда, помимо самого метанотрофа, входит одна или несколько синтрофных культур, потребляющих побочные продукты работы фермента
метанмонооксигеназы. Подобный симбиоз обеспечивает эффективность и стабильность сообщества, позволяя ему более полно утилизировать компоненты газообразного субстрата, а также избегать ингибирования продуктами метаболизма [2].
Несмотря на то, что существует множество потенциальных продуктов, которые могут производится с использованием метанотрофов, единственным коммерчески реализованным продуктом является гаприн [3]. Гаприн - термин, составленный из слов «газ» и «протеин», используется для обозначения кормового белка, получаемого из биомассы метанотрофных бактерий, выращенных на метане. Высокая потребность сельского хозяйства в кормовом белке в совокупности с климатическими и географическими особенностями России, такими как недостаток удобных для выращивания сои, наиболее популярного источника кормового белка, земель и избыток природного газа, создают предпосылки для развития производства гаприна.
На данный момент известно большое количество метанотрофных микроорганизмов, но количество высокопродуктивных штаммов, использование которых экономически целесообразно, невелико, а попытки генетической модификаций с целью улучшения ростовых характеристик пока ни к чему не привели [4]. Поиск новых микроорганизмов и их сообществ, способных потреблять метан и природный газ с удовлетворительным выходом биомассы, остается приоритетным направлением научных изысканий в этой области.
Одним из источников для выделения метанокисляющих бактерий являются почвы газоносных районов. Природный газ, основной компонент которого - метан, способен диффундировать из газоносных горизонтов в почву. Присутствие метана в почве делает возможным развитие метанокисляющих сообществ. Примером подобного региона является полуостров Ямал. На его территории расположено 47 месторождений, в почвах над которыми могут развиваться метанокисляющие сообщества.
Основной фактор почвообразования на полуострове Ямал - суровый арктический климат. Основной фактор почвообразования полуострова Ямал - это суровый арктический климат. Ежегодный цикл промерзация и оттаивания вкупе с высокой влажностью создают сложные полигональные комплексы почв. Распространённые на Ямале глеевые, торфяно-глеевые и торфяные почвы
перемежаются трещинами, характеризующимися мощным органическим слоем, и пятнами, лишенными органического горизонта.
В данной работе в качестве объекта изучения выступали образцы почвы, полученные из района
Физико-химические свойства образца схожи с литературными данными. На основании проведенных анализов образец почвы можно соотнести с верхними горизонтами почв Ямала. Содержание микроорганизмов в почве согласуется с исследованием О.С. Кухаренко [5], и является типичным для тундр.
Был проведен анализ почвенной микробиоты. Из исследования [5] известно, что в почвах Ямала преобладают грамотрицательные виды. В мхах и сфагнумах разнообразие существенно выше, чем в почве, где чаще всего доминирует один вид. В исследовании утверждается, что для естественных субстратов полуострова Ямал характерны грибы родов Pénicillium и Fusarium, в то время как для антропогенных субстратов характерны
темноокрашенные микромицеты - деструкторы антропогенных материалов и патогены человека.
Первичный высев осуществлялся на агаризованный L-бульон. Выделенные изоляты были проанализированы по микро- и
макроморфологическим признакам. Также была проверена их способность к ассимиляции метанола и этанола.
Из почвы было выделено 17 микробных изолятов. Среди них присутствуют 13 граммотрицательных и 4 граммположительных, 8 из них способны к ассимиляции метанола и 7 способны к ассимиляции этанола. Наиболее
распространенными оказались три изолята, которые в совокупности составляют от 70% до 90% всей бактериальной микрофлоры. Все три из них обладают палочковидной формой клеток и способны к ассимиляции как метанола, так и этанола. Также было выделено два грибных изолята. Их колонии имели бело-зеленый окрас.
Можно заключить, что микробиота образцов достаточно типична для почв Ямала.
газодобычи на полуострове Ямал. Образцы почвы были проанализирован на основные физико-химические и биологические параметры. Результаты анализов представлены в таблице 1.
Выделение метанокисляющего сообщества осуществлялось методом накопительных культур. В качестве источника углерода и кислорода использовалась метан-воздушная смесь в соотношении 1:3. Источником остальных элементов была минеральная среда. Было опробовано две среды:
Среда 1, со следующим составом: KNO3 - 1,0 г/л , MgSÜ4*7H2Ü - 0,2 г/л, CaCl2 - 0,02 г/л, Na2HPO4*5H2O - 1,5 г/л, KH2PO4 - 0,7 г/л, CuSÜ4*5H2Ü - 0,1 мг/мл, ,FeSO4*7H2O - 2,0 мг/мл, ZnSO4*7H2O - 0,1 мг/мл, Na2MoO4*2H2O - 0,03 мг/мл, CoCl2*6H2O - 0,2 мг/мл, трилон Б (Na2EDTA) - 5,0 мг/мл,Мп02*4H2O - 0,03 мг/мл, NiCl2*6H2O -0,02 мг/мл.
Среда 2, со следующим составом: Н3РО4 (70%) - 0,35 мл/л, KCl - 0,125 г/л, MgS04*7H20 - 0,105 г/л, FeSO4*7H20 - 10,75 мг/л, CuS04*5^0 - 10 мг/л, MnSO4*5H20 - 9,5 мг/л, Н3ВО3 - 6,25 мг/л, ZnSO4*7H20 -1,5 мг/л, C0SO4X7H2O - 0,25 мг/л, Na2MoO4x2H20 - 0,25 мг/л
Культивирование проводилось герметичных в конических колбах объемом 1000 мл, в которые помещалось по 50 мл минеральной среды, при постоянном перемешивании на орбитальном шейкере. Обеспечивалось термо- и pH-статирование, а также обновление метан-воздушной смеси. Рост оценивался визуально, путем замера оптической плотности, а также микроскопированием.
Поскольку для Ямала характерен резкоконтинентальный климат и широкий диапазон температур, для определения подходящих условий выделения метанокисляющего сообщества первые два пассажа были выполнены при четырех различных температурах: 0°-5°, 22°-27°, 32°-33°, 40°-41° С.
На среде 1 рост был неудовлетворителен. Микроскопирование выявляло присутствие предположительно метанокисляющих бактерий,
Таблица 1. Характеристики образцов почвы
Параметр Значение
Внешний вид Почва имеет черно-коричневый цвет. В верхней части густо пронизана корнями.
Влажность 57-61%
Потеря массы при прокаливании 24-28%
Содержание подвижных соединений фосфора по методу Кирсанова 200±40 млн-1
Содержание гумусовых веществ по методу Тюрина 12.1±1.2%
Содержание общего азота по методу Кьельдаля 1.85%
рН вытяжки (в дистиллированной воде) 4.84
рН вытяжки (в 0.1 Н растворе КС1) 5.11
КОЕ на г. почвы 3.65*106
количество которых достигало максимума на вторые сутки, после чего оставалось неизменно. Определенная методом Коха концентрация гетеротрофной флоры составила температуре 0°-5°С составила 3.1*104, при температуре в 22°-27°С -4*105, при температуре в 32°-33°С -- 5.9*106, при 40°-41°С -- 5.16* 106. Прослеживается тенденция к повышению титра клеток при повышении температуры. Чаще всего встречались ранее упомянутые наиболее распространенные в почве изоляты, способные к ассимиляции метанола. Можно заключить, что на среде П наблюдался определенный рост, однако накопление биомассы было несущественным, поэтому выделение метанокисляющего сообщества в этой среде было признано нецелесообразным.
Использование среды 2 позволило добиться лучших результатов. При культивировании наблюдалось помутнение и закисление среды, особенно заметное при культивировании в интервале 40°-41° С. Титр КОЕ при температуре 0°-5° С составил 7*104, при температуре в 22°-27° С -4*105, при температуре в 32°-33° С -- 5.9*106, при 40°-41° С -- 2.2*107.
Поскольку наибольшее накопление биомассы было достигнуто при культивировании в среде 2 в диапазоне температур 40°-41° С, дальнейшее опыты по выделению метанокисляющего сообщества осуществлялись в этих условиях.
Было осуществлено 5 пассажей. Динамику накопления биомассы в процессе можно наблюдать на рис.1
Рисунок 1. Накопление биомассы в ходе последовательных пассажей.
Полученные зависимости имеют типичную Б-образную форму. Максимальная концентрация биомассы достигалась на 3-4 сутки культивирования, после чего рост останавливался. Благодаря выделению наиболее активной части метанокисляющего сообщества максимальное накопление биомассы повышалось от пассажа к
пассажу. Максимальное накопление было достигнуто к четвертому пассажу и составило приблизительно 2 г/л. Это в 4.7 раза больше, чем в первом пассаже, где максимальное накопление составило 0.43 г/л.
В результате пересевов была получена накопительная культура метанокисляющих бактерий, микрофотография которой приведена на рис. 2.
/ - 4 * ' h 1
'Z ' *
„ *Ь' "V?
>'М Л
■, и V* 1
,1 «
" , » , V/ *
лТ # •
• .
- » Гг
ns
, ->t
г
г
1.1
. 1
Рисунок 2. Микрофотография препарата метанокисляющего сообщества.
В ходе осуществления пассажей морфологический состав метанокисляющего сообщества менялся слабо, что позволяет сделать вывод о его устойчивости. Кокковидная форма, наиболее представленая в микропрепаратах, является достаточно распространённой среди метанокисляющих микроорганизмов. Такая форма является типичной для семейства Methylococcaceae.
Список литературы
1. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии// М.:ГЕОС. 2001. 500c
2. Лалов В.В. Анализ и синтез энерготехнологических систем производства кормового белка из природного газа // Москва, 1991 - 118 с
3. P. J. Strong, S. Xie, and W. P. Clarke Methane as a Resource: Can the Methanotrophs Add Value? // Environmental Science & Technology 2015 49 (7), 4001-4018
4. Averesch N.J.H. and Kracke F. Metabolic Network Analysis of Microbial Methane Utilization for Biomass Formation and Upgrading to Bio-Fuels // Front. Energy Res. 6:106. (2018)
5. Кухаренко О.С. и др. Структура гетеротрофного блока бактерий в тундровых почвах полуострова Ямал // Почвоведение, 2009, №4, с 463468
