CC BY
9
УДК 60
Игнашкова Д.А., Сергеев Е.Е., Раков Н.О., Авшалумов А.С., Суясов Н.А.
ИССЛЕДОВАНИЕ СООБЩЕСТВА МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ОБРАЗЦОВ ПОЧВЫ ПОЛУОСТРОВА ЯМАЛ
Игнашкова Дарья Александровна - студентка 4 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии; email: d.ignashkova@mail.ru.
Сергеев Егор Евгеньевич - студент 4 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии;
Раков Никита Олегович - студент 2 курса магистратуры факультета Биотехнологии и промышленной экологии;
Авшалумов Александр Сергеевич - студент 3 курса факультета Биотехнологии и промышленной экологии;
Суясов Николай Александрович - кандидат технических наук, доцент кафедры биотехнологии;
ФГБОУ ВО «Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева»,
125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д.20
Данная работа посвящена выделению метилотрофных сообществ микроорганизмов из образцов почвы, полученных с районов газодобычи полуострова Ямал. Выделение происходило методом накопительных культур. Также были изучены морфологические свойства культур, входящих в ассоциации, исследована возможность использовать альтернативные источники углерода.
Ключевые слова: бактериальное сообщество, метилотрофные микроорганизмы, полуостров Ямал
STUDY OF THE COMMUNITY OF METHYLOTROPHIC BACTERIA ISOLATED FROM SOIL SAMPLES OF THE YAMAL PENINSULA
Ignashkova D.A., Sergeev E.E., Rakov N.O., Avshalumov A.S., Suyasov N.A. D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russian Federation
This work is devoted to the isolation of methylotrophic communities of microorganisms from soil samples obtained from the gas production areas of the Yamal Peninsula. The allocation took place by the method of accumulative crops. The morphological properties of the cultures included in the associations were also studied, the possibility of using alternative sources of carbon was investigated.
Keywords: bacterial community, methylotrophic microorganisms, Yamal Peninsula
Одной из актуальных проблем, стоящих перед человечеством, является дефицит кормового белка. Поиск полноценного решения ведётся учёными ещё с 1960-х годов прошлого века и продолжается в наши дни. Помимо того, что само человечество не может получать необходимое количество сбалансированного питания, также страдает сельскохозяйственное производство, так как нехватка кормового белка ведет к ранней смерти животных, снижения количества и качества получаемой с их помощью продукции [1]. В связи с этим актуальным направлением является поиск разнообразных способов устранения угрозы «белкового голодания».
В качестве решения было предложено повысить объём производства растительных белковых кормов [2]. Данный способ заключается в использовании многолетних высокобелковых бобовых культур, а также клевера, рапса, люцерны и других в зависимости от географических особенностей. Однако существуют значительные проблемы осуществления такого пути: необходимы огромные по площади свободные территории, культуры могут произрастать только в определенных климатических зонах, а также огромное влияние оказывает непогода и различные антропогенные факторы. Из этого следует, что решение не является надежным.
В настоящее время активно разрабатывается микробиологический способ получения кормовых добавок, обогащенных белком. Это направление наиболее перспективно благодаря различной вариации подходов, возможности оптимизации
процесса, подбору продуцента и условий для улучшения количественных и качественных показателей продукта [3]. Ещё одним преимуществом такого производства следует отметить надёжность и стабильность, так как исключается влияние погодных условий и сезонности.
Разрабатываются методы максимально безотходного производства. Для культивирования микроорганизмов используют пивную дробину, мелассу и свекловичный жом, которые являются прекрасными источниками углерода, белка, а также необходимых витаминов для развития бактерий. Такое направление повышает качество, полезность и процент утилизации отходов биотехнологического производства. Следует отметить, что одним из важных факторов остаётся стоимость углеродного сырья. Например, получение сухой пивной дробины требует достаточно больших затрат. С целью усовершенствования такого процесса было предложено использование закваски, которая включала консорциум микроорганизмов, способных расщеплять трудноусвояемые углеводы пивной дробины до легкоусвояемых сахаров. Таким образом был получен сбалансированный белково-углеродный корм, который значительно превзошел по параметрам сухую пивную дробину. Такой эффект объясняется увеличение процентного количества белка за счёт роста микрофлоры [4].
Производство белковых компонентов
микробиологическими методами заинтересовано в использовании сравнительно дешёвых источников для
получения качественного продукта. Белок, получаемый из биомассы различных
микроорганизмов (бактерий, дрожжей и др.), носит общее название «одноклеточный белок». С советских времен его обычно называют БОО (белок одноклеточных организмов) или белково-витаминным концентратом [5]. Следует учесть, что Россия богата запасами нефти и метана, а в связи с условиями санкций вопрос использования природного газа только набирает популярность. Таким образом микроорганизмы, способные использовать
одноатомные источники углерода, представляют большой интерес для развития современной биотехнологии.
В качестве сырья для получения БВК обычно используют метан - основной компонент природного и попутного газов залежей нефти. Также его можно обнаружить при разложении твердых бытовых отходов и отходов животноводства [6]. Главной проблемой его использования в биотехнологии является взрывоопасность в смеси с воздухом при определенной концентрации.
В 1970-е годы производство белково-витаминного концентрата с помощью биомассы метанотрофных бактерий, растущих на метане, и кормовых дрожжей, использующих парафины нефтеперерабатывающего производства, было реализовано на Светлоярском биозаводе, которое прекратило существование в 94 из-за экономических проблем [7]. Такие виды БОО получили названия гаприн и паприн соответственно. Типовая схема получения включает несколько стадий: подготовительную, основной ферментации, выделения продукта, а также стандартизации и подготовки товарной формы. Во время подготовительной стадии идёт приготовление и стерилизация питательной среды, включающей соли и все необходимые макро- и микроэлементы, подготовка субстрата и посевного материала, а именно культивирование продуцента в достаточном количестве для засева в ферментер. В качестве источника азота используют раствор аммиака, который к тому же поддерживает определенную кислотность среды. Газ подаётся либо в виде смеси основного источника углерода (метана) и источника кислорода (воздуха или чистого кислорода), либо каждый газ подают раздельно. Преимущество первого способа заключается в снижении вероятности получения взрывоопасной концентрации газов, однако его осуществление намного сложнее второго способа. Процесс всегда проводят в избыточном количестве метана. Перед подачей газы также очищают от механических примесей и влаги, стерилизуют и сжимают, так как они подаются в ферментер под давлением. Стадия основной ферментации идёт непрерывно с подводом газов и минеральной среды и постоянным поддержанием значения рН. Избыток культуральной жидкости и выходящие газы отводят.
Несмотря на преимущества использования технического метана и отходов переработки нефти, существуют существенные сложности.
Микроорганизмы не способны усваивать метан полностью, из-за чего для лучшего усвоения субстрата часть неиспользованного метана отправляют на рецикл. Это создаёт трудности в планировке технологического производства. Недостатки паприна в основном связаны с остаточными парафинами в клетках и газовоздушными выбросами, что привело к сокращению его производства. Для решения этих проблем на вышеупомянутом Светлоярском биозаводе был рассмотрен вариант получения биомассы микроорганизмов, способных усваивать метанол.
Метиловый спирт получают из нефти, угля и древесины, а также из синтез-газа и попутного газа, сжигаемого при нефтедобыче. В наши дни налажена переработка атмосферного углекислого газа с целью снижения парникового эффекта и получения полезного сырья для промышленности. Например, процесс получения метанола основан на взаимодействии углекислого газа с водородом с помощью цинк-хромового катализатора. Он постоянно совершенствуется, так как разрабатываются новые селективные катализаторы [8]. Общее количество производимого метанола в мире растёт с каждым годом и сейчас достигает около 50 млн тонн в год [6], что позволяет всегда получать его в необходимом количестве.
В настоящее время на кафедре биотехнологии Российского химико-технологического университета имени Д. И. Менделеева были проведены исследования образцов почв, полученных с полуострова Ямал, на наличие метилотрофных бактерий, а также их спутников. Цель работы заключается в получении новых штаммов, которые можно в дальнейшем использовать для получения биомассы с высокими показателями концентрации белка. Рассмотрена возможность сопутствующих микроорганизмов усваивать альтернативные виды субстрата, включающие в состав более одного атома углерода.
Метилотрофы широко распространены в природе. В настоящее время известно более 50 родов метан- и метанолокисляющих бактерий, а также несколько родов метилотрофных дрожжей [6]. Их можно встретить как в почвах, так и в водоёмах, в которых образуются одноуглеродные соединения. Также в ряде исследований было доказано их нахождение в гниющих растительных остатках, рубце жвачных парнокопытных, сточных водах и водах с рисовых полей.
На полуострове Ямал сосредоточено большое количество месторождений природного газа. Так как газ способен диффундировать в почву и окисляться микроорганизмами, это делает район Ямала привлекательным местом для поиска ещё неизвестных штаммов метан- и метилокисляющих микроорганизмов. На микробный состав почвы влияет и антропогенный фактор, заключающийся в загрязнении тяжелыми металлами и
нефтепродуктами.
Обычно чистые культуры микроорганизмов практически не встречаются. Большинство бактерий образуют сообщества, состоящих из основного штамма-продуцента, а также бактерий - спутников. Также бактериальные консорциумы возможно получать искусственным путем в условиях лаборатории. Природные смешанные культуры являются наиболее эффективными для промышленного производства, что было подтверждено многими экспериментами. Они широко применяются при очистке сточных вод, получении биогаза, биоремедиации почв и в традиционных методах пищевой промышленности. Уникальность таких сообществ заключается в совместном симбиозе, обычно микроорганизмы - спутники используют для поддержания жизнедеятельности продукты метаболизма основного штамма. Этот фактор способствует авторегулированию в смешанной культуре, повышая тем самым качества и сохранность от заражения, степень усвоения субстрата и показания удельной скорости роста. Следует добавить, что в смешанных культурах возрастает степень утилизации субстрата, тем самым давая возможность использовать неочищенный субстрат. Например, при использовании метилотрофного консорциума, можно добавлять в среду технический метанол, содержащий примеси других спиртов. Такой способ существенно сокращает расходы на очищение субстрата.
Окисление метанола бактериями происходит под действием фермента метанолдегидрогеназы при помощи кофермента феназинметасульфата. Дальнейшее окисление формальдегида до СО2 может происходить сериновым или
рибулозомонофосфатным путями. Последний считается наиболее эффективным с точки зрения экономии энергии, что делает его более предпочтительным в производстве одноклеточного белка.
Выделение бактериального сообщества осуществлялось последовательными пересевами с целью отсеивания посторонней микрофлоры. В качестве источника углерода в минеральную среду вносили технический метанол в концентрации 1%. Наблюдения проводились при различных температурах. Кислотность поддерживали в диапазоне 5,0-6,5 ед. В результате было получено 4 бактериальных сообщества. В них встречаются схожие по морфологии колоний, которые были описаны и исследованы на возможность окисления иных источников углерода. В качестве субстратов были использованы глюкоза, метанол, этанол, изопропиловый спирт и н-бутанол. Высевы производились на чашки Петри с концентрацией исследуемого спирта 1 %. Данные исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1. Характеристика микробных сообществ.
Микробн ый изолят Макроморфология Форма клеток Взаимное расположение Способность усваивать
Метанол Этанол Изопроп анол Н- бутанол Глюкоза
Сообщество 1
1 Розовые, гладкие края, выпуклый профиль, гладкая поверхность, форма колоний круглая палочки одиночные, иногда образуют цепочки + - - - -
2 Бежевые, гладкие края, выпуклый профиль, поверхность гладкая кокки диплококки + - - - +
3 Жёлтые, гладкие края, выпуклый профиль, глянцевая поверхность, форма колоний круглая палочки образуют цепочки + + + + +
Сообщество 2
1 Розовые, гладкие края, выпуклый профиль, гладкая поверхность, форма колоний круглая палочки одиночные, иногда образуют цепочки + - - - -
2 Бежевые, гладкие края, выпуклый профиль, поверхность гладкая кокки диплококки + - - - +
3 Жёлтые, гладкие края, выпуклый профиль, глянцевая поверхность, форма колоний круглая палочки образуют цепочки + + + + +
4 Белые, гладкие края, круглая форма колоний, выпуклый профиль, глянцевые палочки одиночные, иногда образуют цепочки - + - + +
5 Бело - желтые, гладкие края, плосковыпуклый профиль, матовые палочки одиночные + + + + +
7 Бежево - прозрачные, профиль с вдавлением в центре, морщинистая поверхность палочки одиночные + + + + +
Штаммы неспособные расти ни на каком источнике углерода, кроме метанола, являются основными продуцентами. Также есть культуры, которые встречаются в двух сообществах, что говорит о их возможности быть основными спутниками. При этом следует отметить о том, что один штамм не способен расти на метаноле. Этот факт позволяет предположить, что для поддержания своей жизнедеятельности он использует продукты метаболизма основного штамма - продуцента.
Таким образом в ходе эксперимента были получены смешанные культуры бактерий из природного источника. Наиболее интересными из них стали 2 сообщества с лучшими показателями роста. В первом были обнаружены облигатный штамм метилобактерий и два факультативных спутника, содержание общего азота составило 63,7 %. Второе сообщество помимо облигатного штамма включало ещё пять спутников, содержание азота в биомассе составило 62,3 %.
Список литературы
1. Гордин А. А. Производство кормового белка - стратегическая цель по импортозамещению / А. А. Гордин, А. В. Нечукин // Экономика и управление: проблемы, решения. - 2015. - С. 61-63
2. Дуборезов, В. М. Пути решения белковой проблемы в молочном животноводстве / В. М. Дуборезов, И. О. Кирнос, Н. И. Васильев //
Молочная промышленность. - 2011. - №6. - С. 7071.
3. Vasey, R.B. Single-cell protein / R.B. Vasey, K. A. Powell // Biotechnology and genetic engineering reviews. - 1984. - Т. 2 - С. 285-311.
4. Леснов, А. П. Современные биотехнологии переработки пивной дробины в высокобелковые экологически безопасные корма / А. П. Леснов, С. И. Никитин, А. Н. Лазаревич // Мелиорация и рекультивация, экология. - 2011. - №4. - С. 26-30.
5. Загоскина, Н. В. Биотехнология: теория и практика / Н. В. Загоскина, Л. В. Назаренко, Е. А. Калашникова, Е. А. Живухина. - Москва: Оникс, 2009. - 505 с.
6. Троценко, Ю.А. Аэробные метилотрофы -перспективные объекты современной биотехнологии / Ю. А. Троценко, М. Л. Торгонская // Journal of Siberian Federal University. - 2012. - С. 243-279.
7. Раздел Микробиологическая промышленность Строители России ХХ - ХХ1 вв. Химический комплекс / В. А. Быков, А. А. Винаров, Н. б. Градова, Ю. В. Ковальский. // Мастер Москва, 2008
8. Кемалов Р.А., Кемалов А. Ф. Технологии получения и применения метанола - Казань: Казан. ун-т, 2016. - 167 с.
9. Mosin O. Evolution, metabolism and biotechnological usage of Methylotrophic microorganisms / O. Mosin, I. Ignatov // European Journal of Molecular Biotechnology. - 2014. - №3. - С. 131-148.
