Использование биологически активных соединений в качестве стимуляторов роста стафилококков

Анганова Елена Витальевна; Мирскова Анна Николаевна; Савченков Михаил Федосович; Духанина Алла Владимировна; Адамович Сергей Николаевич; Мирсков Рудольф Григорьевич; Крюкова Наталья Федоровна

ОБРАЗ ЖИЗНИ. ЭКОЛОГИЯ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРОВ РОСТА СТАФИЛОКОККОВ

Елена Витальевна Анганова1-2, Анна Николаевна Мирскова3, Михаил Федосович Савченков4, Алла Владимировна Духанина2, Сергей Николаевич Адамович3, Рудольф Григорьевич Мирсков3,

Наталья Федоровна Крюкова1 ('Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования, ректор - д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра эпидемиологии и микробиологии, зав. - д.м.н., проф. Е.Д. Савилов; 2Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН, директор - д.м.н., член-корр. РАМН, проф. Л.И. Колесникова, лаборатория эпидемиологически и социально значимых инфекций, зав. - к.б.н. О.Б. Огарков; 3Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, директор - акад. РАН Б.А. Трофимов; 4Иркутская государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра общей гигиены,

зав. - д.м.н., проф., акад. РАН М.Ф. Савченков)

Резюме. Изучено влияние 15 биологически активных соединений из класса трис-(2-гидроксиэтил)аммониевых солей арил(индолил)окси(сульфанил)(сульфонил)уксусных кислот на рост штаммов стафилококков (S.aureus), выделенных с кожи детей с аллергодерматозами. Всего проведено 240 исследований. Установлено, что добавление в желточно-солевой агар некоторых потенциальных биостимуляторов роста ускоряет рост стафилококков и, соответственно, сокращает время выдачи результата анализа. При этом выявлены значительные различия в скорости роста штаммов S.aureus на средах со стимуляторами в зависимости от строения аниона кислоты, продолжительности культивирования и концентрации стимулятора. Одним из наиболее активных биостимуляторов роста стафилококков является трис-(2-гидроксиэтил)аммоний-4-хлор-фенил сульфонил ацетат. При использовании указанного биологически активного вещества наблюдается рост S.aureus через 3 часа от начала культивирования.

Ключевые слова: стафилококки, стимуляторы роста микроорганизмов, питательная среда.

THE USE OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS AS GROWTH PROMOTERS OF STAPHYLOCOCCUS

E.V. Anganova1-2, A.N. Mirskova3, M.F. Savchenkov4, A.V. Duhkanina2, S.N. Adamovich3, R.G. Mirskov3, N.F. Krykova1 (Irkutsk State Medical Academy of Continuing Education; 2Scientific Centre of the Problems of Family Health and Human Reproduction, Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences, Irkutsk; 3A.E.Favorsky Irkutsk Institute of Chemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences; 4Irkutsk State Medical University, Russia)

Summary. The effect of 15 biologically active compounds from the class tris (2-hydroxyethyl) ammonium salt of an aryl (indolyl) oxy (phenylsulfanyl) (sulfonyl)-acetic acid on the growth of S.aureus, isolated from the skin of children with allergic dermatoses were studied. A total of 240 researches were conducted. The addition in a yolk-salt agar some potential biostimulators of growth accelerates the growth of staphylococcus and reduces the time extradition of result of analysis. The significant differences in the growth rate of S.aureus in agar nutritium with stimulators depending on the structure of the acid anion, duration of cultivation and the concentration of biostimulator were detected. One of the most active biostimulators growth of staphylococcus is tris (2-hydroxyethyl) ammonium 4-chloro-phenyl sulfonyl acetate. The use of the biologically active substance gives growth of S.aureus after 3 hours from the start of cultivation.

Key words: staphylococcus, stimulator of growth of microorganisms, agar nutritium.

Стафилококки являются одними из наиболее распространенных возбудителей инфекционных заболеваний. Длительность существующего производства бактериологических анализов негативно сказывается на оказании своевременной медицинской помощи пациенту, усложняя быстрое применение адекватной терапии. В настоящее время в микробиологической практике для культивирования стафилококков применяются питательные среды, на которых длительность выращивания составляет 24-48 ч [7,8]. В связи с этим актуальной задачей является совершенствование производства диагностических бактериологических анализов с целью улучшения их качества и сокращения времени. Перспективным направлением в данной области представляется использование биостимуляторов роста микроорганизмов с целью разработки способов ранней диагностики инфекционных заболеваний, вызванных стафилококками и другими бактериальными агентами. Используемые в настоящее время в России и за рубежом при культивировании микроорганизмов природные стимуляторы дефицитны и дороги. Разработка синтетических стимуляторов для добавления в питательные среды позволяет сократить применение дорогостоящих витаминов, аминокислот, ферментативных гидролизатов казеина, сои, мяса, нативной сыворотки крови и других веществ, используемых в настоящее время в био-

технологии.

Исследованиями последних лет показано, что существует ряд биологически активных веществ, при использовании которых сокращается время роста колоний на питательной среде. В частности, к таким веществам относятся, например, алканоламмониевые соли органилокси(сульфанил)-(сульфонил)уксусных кислот. По данным А.Н. Мирсковой с соавт. [4], эти вещества являются эффективными, селективными и безопасными стимуляторами ряда биологических процессов. Они успешно использованы, например, при культивировании хлебопекарных дрожжей $асскатотусг$ сгтгг1$1ас, кормовых дрожжей, применяемых в промышленных биотехнологических процессах и т.д. Получены результаты, указывающие на способность соединений из ряда 2-гидроксиэтил аммоний органилокси(сульфанил)(сульфо-нил) ацетатов стимулировать рост госпитальных штаммов З.аитгт, существенно сокращая время роста по сравнению с контролем на стандартной питательной среде, что может быть использовано в клинической микробиологиии для ускоренной диагностики инфекций, вызванных З.аитгш. Стимуляторы были эффективны в отношении 24 штаммах Б.аиггш, выделенных от больных с гнойно-септическими осложнениями из отделения хирургического профиля [2].

Цель - изучение ростстимулирующей способности био-

логически активных соединении для ускоренного культивирования S.aureus.

Материалы и методы

В качестве стимуляторов роста S.aureus исследованы 15 биологически активных соединении, разработанных в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН [4,5,6] - представителей нового класса протонных (2гидрок-сиэтил) аммониевых ионных жидкостей со структурной формулой:

Их молекулы состоят из катионов протонированных трис-(2-гидроксиэтил) аминов и анионов биологически активных арил(гетерил)окси(сульфанил)-(селенил)(суль-фонил) уксусных кислот, объединенных между собой водородными связями различных типов. Следует отметить, что водородная связь является одним из наиболее важных внутри- и межмолекулярных взаимодействий в биохимических процессах и определяет, наряду со структурой аниона, их биологическую активность. Биологическая активность таких алканоламмониевых солей существенно превосходит или отличается от активности исходных кислот и алканола-минов и определяется их необычной структурой [9,10].

Известно, что фрагмент НОСН2СН^- присутствует в молекулах холина, ацетилхолина и коламина, входит в состав фосфолипидов, коэнзима Q, витамина В12. Моноэтаноламин является составной частью кефалинов, а диметилэтанола-мин - лецитина, относящихся к классу фосфолипидов.

Органические кислоты, входящие в виде анионов в молекулы протонных (2-гидроксиэтил) аммониевых ионных жидкостей, такие, например, как ароксиуксусные кислоты, индолилуксусная кислота и их производные, обладают высокой биологической активностью и находят применение в сельском хозяйстве в качестве гербицидов и регуляторов роста растений.

Впервые исследованные (2-гидроксиэтил)аммониевые соли арил(гетерил)(сульфанил)(сульфонил)уксусных кислот также проявляют разнообразную специфическую биологическую активность при низкой токсичности (LD50=1300-6000 мг/кг). Благодаря этим свойствам и разработанным технологичным методам синтеза из доступного химического сырья с высокими выходами они могут найти применение в медицине, микробиологии и биотехнологии [1,3,4,5,6,9,10].

Исследованные в данной работе соединения №№ 1-15 представляют собой кристаллические вещества постоянного состава, устойчивые при хранении, хорошо растворимые в воде (табл. 1).

Исследование ростстимулирующей активности проведено на базе лаборатории эпидемиологически и социально значимых инфекций НЦ ПЗСРЧ СО РАМН. В работе использованы штаммы S.aureus, выделенные от детей с аллергодерма-тозами. Всего проведено 240 исследований. Идентификацию выделенных микроорганизмов осуществляли в соответствии с общепринятыми методиками с использованием коммерческих тест-систем «STAPHYtest» фирмы LACHEMA (Чехия).

Из культуры золотистого стафилококка готовили взвесь в физрастворе по стандарту мутности. Проводили растворение каждого потенциального стимулятора роста по следующей методике: растворяли 0,1 г (100,0 мг) вещества в 100,0 мл дистиллированной воды, получая 0,1% раствор (матричный). Дальнейшие разведения проводили следующим образом - первое разведение: 0,1 мл матричного 0,1% раствора добавляли в 100,0 мл желточно-солевого агара (ЖСА); второе разведение: 0,1 мл матричного 0,1% раствора добавляли в 1000,0 мл ЖСА и т.д. В эксперименте использовали каждое разведение препарата в питательной среде и чистую культуру S.aureus.

Разведения препарата в ЖСА разливали по чашкам Петри. Использовали по три чашки каждого разведения препарата в питательной среде. На чашки высевали по 0,1 мл

приготовленной взвеси золотистого стафилококка и инкубировали при температуре 37оС. Просмотр чашек производили через 3, 6, 9, 24 и 48 ч, отмечая рост колоний. В качестве контроля были произведены посевы на желточно-солевой агар без стимулятора роста. При использовании синтезированных стимуляторов роста S.aureus №№ 1-15 в среде ЖСА устанавливали всхожесть микроорганизмов.

Результаты и обсуждение

Проведенные исследования показали, что при использовании подавляющего большинства биологически активных веществ (№№ 1,2,3,6,8,9,10,13,14,15) в течение 3-х часов от начала эксперимента роста S.аureus не наблюдалось. В течение указанного времени появление колоний S.аureus имело место только при использовании стимуляторов роста §О:'п = 0-2 №№ 4,5,11,12. Особенно эффективным оказался стимулятор №11, при добавлении которого в питательную среду через 3 ч от начала культивирования отмечался рост S.аureus в 100,0% случаев практически при всех концентрациях, за исключением 10-6 мг/мл. При использовании веществ №4 и №5 рост стафилококка при экспозиции 3 часа отмечался в 11,1% случаев, № 12 - более чем в половине случаев (табл. 2).

Через 6 часов после высева наблюдался рост S.аureus при использовании большинства стимуляторов роста, за исключением веществ №13 и №15. При этом при посеве исследуемых культур на ЖСА с добавлением потенциальных стимуляторов №№ 3,4,5,14 рост колоний стафилококков отмечался во всех экспериментах. В остальных случаях при экспозиции 6 часов рост S.аureus был зарегистрирован только в ряде случаев (табл. 1).

После 9 часов культивирования рост S. аureus наблюдался при использовании большинства биологически активных веществ (№№ 1,2,3,4,5,8,9,10,11,12,14 при всех концентрациях). Причем в ЖСА с добавлением стимулятора №5 помимо роста культуры через 9 часов экспозиции отмечалась также и лецитоветилазная активность. При добавлении в ЖСА веществ №№ 6,7,13,15 через 9 ч от начала культивирования рост стафилококков S.аureus имел место только в части экспериментов.

При культивировании в течение 24-х часов рост S. аureus отмечался во всех случаях, лецитиназная активность - при добавлении большинства стимуляторов за исключением соединения №13. Через 48 ч после высева рост колоний с лети-циназной активностью зарегистрирован в 100,0% случаев.

При посеве на желточно-солевой агар без стимулятора роста (контроль) рост стафилококков и появление лецити-назной активности отмечалось через 24-48 ч от начала культивирования.

Вышеизложенное свидетельствует, что, во-первых, протестированные биологически активные вещества обладают ростстимулирующим действием при добавлении в питательную среду на основе желточно-солевого агара. Использование стимуляторов ускоряет рост стафилококков и позволяет при проведении анализов существенно сократить время выдачи результата анализа. Во-вторых, установлены значительные различия в скорости роста штаммов S.аureus на средах в зависимости от структуры аниона кислоты, экспозиции и используемой концентрации. Так, наибольший ростстимули-рующий эффект показали производные галогензамещенных арилокси(сульфанил)(сульфонил)уксусных кислот (соединения №№ 3,4,11) и индол-3-илсульфанилуксусной кислоты (№12): рост стафилококков через 3 ч - в части экспериментов, через 6 ч - в 100,0% случаев, а также - соединение № 5 (через 3 ч рост S.аureus в 11,1% случаев, через 6 ч - в 100,0% случаев, через 9 ч - в 100,0% случаев и появление лецитиназной активности). Наименее эффективными из производных арок-сиуксусных кислот оказались вещества № 6 (отсутствие роста через 6 ч), № 7 (рост через 9 ч только в части экспериментов).

Стимулирующая способность соединений селена по отношению к S.аureus ранее не была известна и не являлась очевидной. На примере трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли фенилселеноуксусной кислоты (вещество №14) впервые показана эффективность селеноорганического соединения (рост через 6 ч после начала культивирования стафилококков) (табл. 2).

Таблица 1

Структура химических соединений, использованных в качестве стимуляторов роста З.аитеш

№ Биологически активное соединение Формула

1 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенил-оксиацетат 0 © ? У0СН2С00 • Ш(СН2СН20Н)3

2 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-оксиацетат /Г\ © © С1^ V 0СН2С00 • НЩСН2СН20Н)3

3 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-бромфенил-оксиацетат © © ? ^0СН2С00 • Н^СН2СН20Н)3 Бг

4 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-бромфенил-оксиацетат Б /ТЛ 0 © Бг^ >-0СН2С00 • ЫВДСН2СН20Н)3

5 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метилфенил-оксиацетат /ГЛ © © ^0СН2С00 • Ш(СН2СН20Н)3 СНз

6 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлорфенилоксиацетат С1^ ^~0СИ2С00 • Ш(СН2СН20Н)3 СН3

7 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-нитрофенил- оксиацетат © © ^ ^0СН2С00 • Н^СН2СН20Н)3

8 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-карб-альдегидфенилоксиацетат © © ? ^0СН2С00 • ИN(CH2CH20H)3 СН0

9 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метилфенил- сульфанилацетат АГЛ 0 © ^ У 8СН2С0^ HN(CH2CH20H)3

10 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфанилацетат л, © © С1^ ^-8СН2С0^ HN(CH2CH20H)3

11 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфонилацетат л, © © у802СН2С0^ НЫ(СН2СН20Н)3

12 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний индол-3-ил-сульфанилацетат © © БСН2С00 • ИN(CИ2CИ20И)3 ОН И

13 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензил-индол-3-ил-сульфанилацетат © © БСИ2С00 • ИN(CИ2CИ20И)3 00 СИ2С6И5

14 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний фенилселен-ил-ацетат /Г\ 0 ® V ^еСН2С00-Ш(СН2СН20Н)3

15 Трис(2-гидроксиэтил)аммоний пиридин-3-ил-ацетат ^ © © г^уСН2С00 • HN(CH2CH20H)3 V

Таблица 2

Рост Башвнв на питательной среде со стимуляторами роста №№1-15

№ вещества Экспозиция (час) Концентрация (мг/мл)

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

1 3 н/р н/р н/р н/р н/р

6 ч ч ч ч ч

9 рост 100% рост 100% рост 100% рост 100% рост 100%

24 л., рост 100% л., рост 100% л., рост 100% л., рост 100% л., рост 100%