CC BY
24
ИММУНО- И ЭРИТРОПОЭЗАКТИВНЫЕ СВОЙСТВА
ИНДОЛ-3-ИЛСУЛЬФАНИЛАЦЕТАТА ТРИС-(2-ГИДРОКСИЭТИЛ)АММОНИЯ
Ольга Петровна КОЛЕСНИКОВА1, Анна Николаевна МИРСКОВА2, Сергей Николаевич АДАМОВИЧ2, Ольга Тимофеевна КУДАЕВА1, Рудольф Григорьевич МИРСКОВ2, Михаил Григорьевич ВОРОНКОВ2
1НИИ клинической иммунологии СО РАМН 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
2Иркутский институт химии им. А.Е.Фаворского СО РАН 664033, г. Иркутск, ул. Фаворского, 1
Настоящая работа посвящена исследованию иммуно- и гемопоэзактивных свойств нового биологически активного вещества индол-3-илсульфанилацетата трис-(2-гидроксиэтил)аммония (соединение ВМ-2-84). Установлено, что у интактных животных in vivo соединение достоверно стимулирует первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ, фагоцитарную активность макрофагов, подавляет реакцию гиперчувствительности замедленного типа. В культуре in vitro соединение дозозависимо ингибирует спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию спленоцитов, подавляет стимулированную продукцию провоспа-лительных цитокинов (ИЛ-1Р, ФНОа). Соединение оказывает выраженный эффект на костномозговые гемо-поэтические предшественники эритропоэза. В культуре in vitro стимулирует рост гранулоидных и тормозит рост эритроидных колоний. В экспериментальной модели аутоиммунного заболевания (иммунокомплексный гломерулонефрит) соединение ВМ-2-84 проявляет выраженный терапевтический эффект (устраняет анемию, повышает массу тела животных, снижает СОЭ, стойко снижает протеинурию), что обусловлено угнетением продукции провоспалительных цитокинов, подавлением гиперплазии эритропоэза с ранних стадий диф-ференцировки эритрона у больных мышей. По данным морфологического изучения, соединение тормозит развитие мезангиального пролиферативного гломерулонефрита.
Ключевые слова: (индол-З-ил)сульфанилалканкарбоновые кислоты, алканоламмониевые соли, модель иммунокомплексного гломерулонефрита, иммунитет, анемия.
Ранее мы показали, что трис-(2-гидрокси-этил)аммониевые соли органилгетероуксус-ных кислот общей формулы [RYCH2COO]-• [т(СН2СН2ОН)]3+, где R = Аг, Не^ У = О, S, SO2, катион которых имеет 2,8,9-тригидро-протатрановую структуру [1], облегчающую проникновение через клеточные мембраны, являются новым классом фармакологически активных веществ, обладающих антиагрегационной, мем-бранстабилизирующей, антиоксидантной, противовоспалительной, противоопухолевой, антиме-тастатической, анальгетической, кардиотропной, гипохолестеринемической и др. активностью [2—8], существенно превосходящей или отличающейся от действия исходных биологически активных кислот и триэтаноламина. В литературе ограничены сведения об иммуномодуляторных свойствах производных (индол-З-ил)сульфанилуксусной кислоты [4]. Целью настоящего исследования является изучение иммуно- и эритропоэзактивных свойств нового биологически активного вещества—индол-3-илсульфанилацетата трис-(2-гидроксиэтил)аммо-ния (соединение ВМ-2-84):
ОС?
Соединение ВМ-2-84 относится к нетоксичным веществам: LD50 при внутрибрюшинном введении равна 3000 мг/кг, при введении через рот — LD50 — 4460 мг/кг [2]. В хроническом опыте при введении в дозе 10 мг/кг изменений в тканях органов животных не выявлено.
Материал и методы
В работе использовали здоровых половозрелых мышей линии DBA/2 и гибридов (CBAxC57BL/6)F1 (CBF1), (C57BL/6xDBA/2)F1 (BDF1) обоего пола, 8—10 недельного возраста, массой тела 18—20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ± 10%. Контрольные и опытные животные были одного возраста, получены одновременно из питомника «Рассвет» (г. Томск). До эксперимента и в период
Колесникова О.П. — д.м.н., зав. лабораторией экспериментальной иммунотерапии, e-mail: [email protected] Мирскова А.Н. — д.х.н., проф., главн.н.с., е-mail: [email protected] Адамович С.Н. — к.х.н., старш.н.с.
Кудаева О.Т. — д.б.н., вед.н.с.
Мирсков Р.Г. — д.х.н., проф., вед.н.с.
Воронков М.Г. — академик РАН
его проведения контрольных и опытных мышей содержали в виварии в одинаковых условиях: в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводили в одно и то же время суток (утром). Опыты выполняли в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных (Страсбург, 1986), и одобренными комитетом по биомедицинской этике НИИ клинической иммунологии СО РАМН.
Соединение растворяли в среде RPMI-1640 и использовали в разных дозах относительно LD50. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили среду RPMI-1640. Контрольные и опытные группы состояли не менее чем из 10 мышей.
Количество антителообразующих клеток, секретирующих IgM (IgM АОК) в селезенке мышей, оценивали на 4-е сутки после иммунизации эритроцитами баран (ЭБ) по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом [9]. Количество IgG АОК определяли в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сутки после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза [10]. Результаты выражали в абсолютном количестве IgM и IgG АОК в селезенке. Клеточный иммунный ответ оценивали по реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) [11].
Модель иммунокомплексного гломеруло-нефрита вызывали у самок мышей B6D2F1 двукратным с недельным интервалом внутривенным введением лимфоидных клеток от самок родительской линии DBA/2 [12]. Содержание белка в моче определяли калориметрически с кумасси бриллиантовым голубым («Loba Feinchemie», Австрия) на Titertec Multiscan («Flow Laboratories», США), длина волны 570 нм. В опытах использовали мышей со стойкой про-теинурией и содержанием белка 3 мг/мл и более (концентрацию белка в моче определялся неоднократно). СОЭ определяли капиллярным методом, гематокрит—при помощи микроцентрифуги МЦГ-8 (Россия), в которую помещали капиллярные трубочки с кровью; по отсчетной шкале, приложенной к центрифуге, измеряли величину гематокрита в процентах. Для определения концентрации гемоглобина использовали набор для измерения содержания гемоглобина в крови бесцианидным гемихромным методом «Гемоглобин-Ново» («Вектор-Бэст», Россия). Количество ретикулоцитов на 1000 эритроцитов подсчитывали в мазках крови после окраски бриллиантовым крезиловым синим.
В мазках костного мозга мышей, окрашенных азуром II — эозином по Паппенгейму — Крюкову, подсчитывали процент ядросодержащих эритроидных предшественников. Оценку эри-троидных бурстобразующих единиц костного мозга (БОЕ-э) проводили по общепринятой методике с использованием 0,9% метилцеллюлозной культуры.
Митоген-индуцированную пролиферацию клеток селезенки выполняли стандартным способом. Клетки селезенки мышей культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций («Linbro», США) при +37 °С в атмосфере 5% углекислого газа и 95% воздуха. Клетки стимулировали митогенами — конканавалином А (Кон А, Pharmacia, Fine Chemicals, Швеция) или липополисахаридом (ЛПС E. coli 055:B5, «Sigma»). Концентрации митогенов подбирались предварительным титрованием и использовались в оптимальной, субоптимальной и высокой дозах, что составило для Кон А 5, 10 и 25 мкг/мл соответственно, а для ЛПС — 25, 50 и 100 (в части опытов — 200) мкг/мл соответственно. Соединение вносили в лунки одновременно с митогеном. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток. Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2 х 105 клеток.
Использовали спектрофотометрический микрометод для оценки Fc-рецептор-опосредованного фагоцитоза ЭБ макрофагами. Перитонеальные макрофаги, элиситированные пептоном, в концентрации 2 х 106/мл культивировали в 24-луночных пластиковых планшетах («Linbro») в течение 2 часов в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ Hepes, 2 мМ L-глутамина при температуре +37 °С в атмосфере высокой влажности с содержанием 5% CO2 в воздухе. Затем к монослою макрофагов добавляли 1 мл 2,5% опсонизированных ЭБ и культивировали в тех же условиях в течение 40 минут, после чего нефагоцитированные эритроциты лизировали гипотоническим раствором NaCl. Для разрушения макрофагов и фагоцитированных ими эритроцитов в каждую лунку добавляли 0,6 мл 1% раствора додецилсульфата натрия (детергент), после чего количество гемоглобина, вышедшего из разрушенных ЭБ, определяли на Titertec Multiscan при длине волны 405 нм [13].
Определение активности ИЛ-1 и фактора некроза опухоли а (ФНОа) проводили в макро-фагальном супернатанте. Для получения стимулированных перитонеальных макрофагов
мышам за 4 суток до забоя внутрибрюшинно вводили 10% раствор пептона. Клетки перитонеального эксудата, полученные путем промывания брюшной полости холодной средой 199, содержащей гепарин в концентрации 30 Ед/мл, инкубировали в течение 2 часов при температуре +37 °С в атмосфере 5% СО2 в 24-луночных плоскодонных планшетах. Затем после двукратного отмывания в среде RPMI-1640 оставшиеся прилипшие клетки снимали с пластика резиновым полисменом. Полученная суспензия на 86—92% состояла из макрофагов, тестированных на наличие неспецифической эстеразы. Жизнеспособность клеток определяли с использованием 0,2% раствора трипанового синего, приготовленного на 0,9% растворе NaCl. Выделенные макрофаги в концентрации 106 клеток/мл культивировали в 24-луночных пластиковых планшетах («Linbro») в течение 24 часов при температуре +37 °С и 5% содержанием СО2 в атмосфере. Для культивирования использовали бессывороточную среду RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 40 мг/мл гентамицина и 10 мМ HEPES. По окончании инкубации супернатант собирали, центрифугировали и замораживали при температуре —20 °С и в дальнейшем тестировали на наличие ИЛ-1 и ФНОа. В качестве стимулятора макрофагов in vitro использовали ЛПС E. coli в концентрации 15 мг/мл [14].
Соединение ВМ-2-84 добавляли в культуру макрофагов в начале культивирования, через 24 часа супернатант собирали и тестировали на наличие ИЛ-1- и ФНОа-активности. Активность ИЛ-1 оценивали биологическим методом — измерением пролиферативного ответа тимоцитов на субоптимальную дозу мито-гена [15]. Оценку данных проводили с помощью индекса стимуляции, который рассчитывали как отношение числа импульсов в минуту в Кон А-стимулированной культуре тимоцитов в присутствии и в отсутствие исследуемых супернатантов.
Супернатант тестировали при разведении 1:1. Для определения ФНОа-активности в макрофагальном супернатанте использовали ФНОа-чувствительную клеточную линию L-929 [16]. Суспензию клеток L-929 в концентрации 50 х 104/мл помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета (<^іпЬш») в объеме 100 мкл в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ Hepes, 2 мМ L-глутамина• К клеткам добавляли актиномицин D в заранее оттестированной дозе 0,5 мкг/мл в объеме 100 мкл. Макрофа-гальный супернатант вводили в лунку при разведении 1:100. Инкубацию клеточной культуры проводили в атмосфере 5% СО2 и 95% воздуха при температуре +37 °С в течение 18 часов. Учет активности ФНОа оценивали по результатам суправитальной окраски монослоя клеток кристаллическим фиолетовым, при этом окончательно учитывали процент погибших клеток.
Различия между группами оценивали с помощью непараметрического критерия и Вилкоксона — Манна — Уитни.
Результаты и обсуждение
При введении соединения ВМ-2-84 в индуктивную фазу первичного гуморального иммунного ответа на Т-зависимый антиген и в индуктивную фазу ГЗТ мышей соответственно иммунизировали и сенсибилизировали ЭБ в день последней инъекции соединения (ВМ-2-84 вводили в дозе 50 мг/кг трехкратно ежедневно внутрибрюшинно). Установлена достоверная стимуляция ^М-ответа и подавление ГЗТ. При инъекции соединения в такой же дозе и таком же режиме реципиентам в день индукции системной реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) в полуаллогенной модели (введение 50 х 106 клеток селезенки от родителя DBA/2 гибридам B6D2F1) не обнаружено эффекта (табл. 1).
Для оценки влияния ВМ-2-84 на вторичный гуморальный иммунный IgG-ответ соединение вводили 3 раза через день внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг до первичной и/или вторичной
Таблица 1
Влияние соединения ВМ-2-84 на первичный гуморальный иммунный ответ, ГЗТ, РТПХ у интактных мышей-самцов B6D2F1
Группа Количество АОК на селезенку ГЗТ (%) РТПХ (масса селезенки, мг)
Контроль 35585 ± 3431 0,07 ± 0,01 100,0 ± 5,5а
ВМ-2-84 50 мг/кг 78289 ± 6660** 0,036 ± 0,009* 112,4 ± 4,9
Примечание: а — средний вес селезенки при РТПХ достоверно превышает средний вес селезенки интактных мышей, равный 66,5 ± 4,8 мг (р < 0,01).
иммунизации ЭБ. Введение соединения до первичного контакта организма с антигеном в 2,2 раза увеличивает вторичный гуморальный иммунный ответ—до 3,62 х 105 IgG АОК (в контроле —1,61 х 105 IgG АОК, р < 0,05). Будучи введен на фоне сформировавшейся иммунной памяти перед вторичной иммунизацией, ВМ-2-84 не меняет величину вторичного ответа: количество IgG АОК составляет 1,55 х 105 (р > 0,05). По-видимому, соединение оказывает действие на формирование пула клеток-памяти, отвечающих на повторное введение антигена.
Для оценки влияния ВМ-2-84 на фагоцитарную активность мышам B6D2F1 вводили соединение в дозах 5 и 50 мг/кг внутрибрюшинно трехкратно через день. В качестве препарата сравнения был использован зимозан в дозе 50 мг/кг, который вводили однократно внутри-брюшинно за сутки до забоя животных (рис. 1). Соединение ВМ-2-84 обладает достоверным стимулирующим влиянием на фагоцитарную активность макрофагов в дозах 5 и 50 мг/кг по сравнению с контролем. Кроме того, препарат в дозе 5 мг/кг сопоставим с действием зимозана, который известен как стимулятор макрофагов [17]. Повышение фагоцитарной активности макрофагов под действием соединения ВМ-2-84, может также сопровождаться увеличением антигенпрезентирующей способности клеток, что и приводит к стимуляции ^М-антителообразования. Учитывая, что влияние макрофагов на формирование АОК в селезенке опосредовано секрецией цитокинов, изучали эффект соединения ВМ-2-84 на продукцию ИЛ-1 и ФНОа перитонеальными макрофагами. Препарат вносили в культуру фагоцитов в дозах 10 и 50 мкг/мл. Установлено, что ВМ-2-84 в обеих концентрациях обладал достоверным супрессирующим действием как на спонтанную, так и на ЛПС-стимулированную продукцию ИЛ-1 (рис. 2, А). В то же время соединение
Рис. 1. Влияние ВМ-2-84 на фагоцитарную
активность макрофагов интактных мышей. Здесь и на рис. 2, в табл. 1—2: *—отличие от величины соответствующего показателя в контроле достоверно при p < 0,05.
в концентрации 10 мкг/мл не влияло на спонтанную продукцию ФНОa in vitro, а в концентрации 50 мкг/мл достоверно ее стимулировало (в 2,7 раза) по сравнению с контролем. При этом ЛПС-стимулированная секреция ФНОa под влиянием ВМ-2-84 в концентрациях 10 и 50 мкг/мл статистически не отличалась от контрольных значений (рис. 2, Б). Таким образом, ВМ-2-84 стимулирует первичный и вторичный гуморальный иммунный ответ, фагоцитарную активность макрофагов при введении in vivo, но при этом снижает продукцию ИЛ-1 и повышает спонтанную секрецию ФНОa перитонеальными макрофагами при культивировании их с соединением in vitro.
ВМ-2-84 в дозе 5 мкг/мл достоверно снижает как спонтанную (с 45 x 103 до 10 x 103 имп/мин), так и стимулированную Кон А в дозе 10 мкг/мл пролиферацию клеток селезенки (с 78 x 103 до 28 x 103 имп/мин). В дозе 250 мкг/мл соединение резко, почти до нулевых значений, подавляет
Контроль ВМ-2-84 ВМ-2-84 10 мг/кг 50 мг/кг
Контроль ВМ-2-84 ВМ-2-84 10 мг/кг 50 мг/кг
Рис. 2. Влияние ВМ-2-84 на спонтанную (І I) и ЛПС-стимулированную ( ) продукцию ИЛ-1 (А)
и ФНОа (Б) у интактных мышей. Здесь и в таблицах: ** — отличие от величины соответствующего показателя в контроле достоверно при р < 0,01.
спонтанную и стимулированную пролиферацию клеток селезенки, эффект сравним с действием известного иммуномодепрессанта циклоспорина А. Антипролиферативные свойства ВМ-2-84 выявляются также в смешанной культуре лимфоцитов. Установлено ингибирующее действие соединения на ЛПС-индуцированную пролиферацию клеток селезенки (при дозе ЛПС 200 мкг/мл). Оценивая в целом иммуноактивные свойства ВМ-2-84 в культуре клеток селезенки in vitro можно отметить, что соединение проявляет антипролиферативные свойства в отношении как Т-, так и В-клеток селезенки.
Одним из перспективных и продуктивных подходов целенаправленной регуляции иммунной системы является воздействие на пролиферацию, дифференцировку и самоподдержание ранних гемопоэтических предшественников, поскольку элементы иммунной и кроветворной систем, имея единого предшественника— стволовую кроветворную клетку — и тесно взаимодействуя между собой, модулируют как иммуно-, так и гемопоэз [18, 19]. Имеются работы, указывающие на дисфункцию эритропоэза как на одно из звеньев в формировании патологии иммунной системы в различных экспериментальных моделях — аутоиммунных (мыши линии NZB), лимфопролиферативных заболеваний (мыши линии AKR), старческого иммунодефицита (мыши в возрасте 24—28 месяцев) [19—21]. Более того, показано, что нормализация пролиферативной активности ранних гемопоэтических предшественников с помощью ингибиторов гемопоэза приводит к нормализации иммунитета при аутоиммунных, иммунодефицитных и других нарушениях [22].
Ранее показано, что индукция хронической РТПХ в полуаллогенной системе (перенос лимфоидных клеток от родителя F1-гибридам) приводит наряду с ТЪ2-зависимым вариантом иммунопатологии (lupus) к появлению у части мышей ТЫ-зависимого варианта (nonlupus). Варианты иммунопатологии кроме клинических отличий (наличие или отсутствие протеинурии) имеют различия в параметрах клеточного и гуморального иммунного ответа, функциональных свойств В-лимфоцитов [23]. Модель, сочетающая иммунодефицит, гемолитическую анемию и иммунокомплексный гломерулонефрит (Th2-, или lupus-мыши), является более тяжелым системным проявлением аутоиммунного заболевания, имеющим сходство с патологией у мышей NZB/ WF1 и системной красной волчанкой у человека. Модель, сочетающая иммунодефицит и гемолитическую анемию (Th1-, или nonlupus-мыши), близка патологии у мышей NZB. Показано, что обе модели характеризуются разной степени выраженности нарушениями эритропоэза и соответственно анемии. У мышей lupus выявляются изменения пролиферативной активности стволовой кроветворной клетки и функциональной активности гемопоэтических предшественников эритроидного и гранулоидного направлений дифференцировки, что приводит к развитию у животных анемического синдрома с гиперплазией костномозгового эритропоэза [24].
Больным иммунокомплексным гломерулонефритом мышам соединение ВМ-2-84 в дозе 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно 12 раз с интервалом 24 часа. Через сутки после последней инъекции определяли массу тела, скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и другие параметры, представленные в таблице 2.
Таблица 2
Влияние ВМ-2-84 на параметры иммуно- и эритропоэза у мышей B6D2F1 с иммунокомплексным гломерулонефритом
Исследуемые показатели Контроль Гломерулонефрит Гломерулонефрит + ВМ-2-84
Масса тела, г 26,1 ± 0,8 21,3 ± 0,7** 25,2 ± 1,5#
Гемоглобин, г/л 199,2 ± 3,6 140,3 ± 6,9** 197,6 ± 4,6##
Гематокрит, % 49,4 ± 0,4 38,8 ± 1,4** 44,0 ± 0,7##
Эритрокариоциты, % 27,5 ± 1,5 37,8 ± 2,8* 29,6 ± 2,4#
Ретикулоциты, %% 10,0 ± 0,3 21,5 ± 1,2** 13,2 ± 0,4##
БОЕ-э /105 клеток костного мозга 7,2 ± 0,5 22,3 ± 0,9** 12,1 ± 0,6##
Продукция ИЛ-1 (индекс стимуляции):
спонтанная 1,6 ± 0,1 2,8 ± 0,3** 1,8 ± 0,4#
ЛПС-стимулированная 5,8 ± 0,8 6,9 ± 0,5 5,1 ± 0,38#
Примечание. Отличие от величины соответствующего показателя у мышей с гломерулонефритом достоверно: # — при р < 0,05, ## — при р < 0,01.
Как видно из таблицы 2, курсовое введение соединения ВМ-2-84 приводит к достоверному повышению массы тела у мышей с гломерулонефитом. Достоверно снижалась СОЭ - с 11,2 ± 3,3 до 4,2 ± 2,3 мм/ч.
В работе использовали разные дозы соединения, для определения влияния ВМ-2-84 на уровень белка в моче использовали концентрацию 5 мг/кг. Мышам B6D2F1 с иммунокомплексным гломерулонефритом на 5—6 месяце заболевания проведено курсовое введение ВМ-2-84 в дозе 5 мг/кг в течение 40 дней через день (15 инъекций). Была образована группа мышей, имевших протеинурию 3 мг/мл и более, в среднем в группе она составляла 7,3 ± 0,9 мг/мл, т. о. эта группа из 14 животных на 100% состояла из больных мышей. Далее сразу после лечения снизилась не только частота протеинурии, т. е. количество мышей, имеющих белок в моче более 3 мг/мл, со 100 до 78%, но и ее средние показатели в группе (концентрация белка в моче составляла 5,6 ± 0,9 мг/мл). Через 2 месяца после окончания лечения 2 мыши пали, но у 12 животных в 86% случаев протеи-нурия была ниже 3 мг/мл, в среднем в группе была равна 2,5 ± 0,4 мг/мл, что достоверно ниже показателей до лечения (р < 0,01).
Иммунодефицит, развивающийся у мышей в экспериментальной модели, возможно, связан с супрессивным действием эритробла-стов, поэтому дальнейшая работа была посвящена изучению влияния соединения ВМ-2-84 на эритропоэз у мышей B6D2F1 с гемолитической анемией и иммунокомплексным гломерулонефритом. Как следует из таблицы 2, курс лечения соединением приводит к нормализации величины гематокрита и содержания гемоглобина у мышей с анемическим синдромом. Повышение гематокрита, вероятно, свидетельствует об увеличении числа ретикулоцитов. Если учесть, что у больных мышей анемия обусловлена гемолизом, то повышение содержания гемоглобина и гематокрита свидетельствует либо об устранении гемолиза, либо о еще большей активности костномозгового эритропоэза. Для уточнения характера действия соединения изучено количество ретикулоцитов в периферической крови, число эритрокариоцитов и бур-стобразующих эритроидных единиц (БОЕ-э) в костном мозге. Как видно из таблицы 2, количество ретикулоцитов под влиянием соединения достоверно снижалось в 1,7 раза у мышей с иммунокомплексным гломерулонефритом. Курс лечения приводил к достоверному снижению количества ядросодержащих эритроидных
предшественников в костном мозге у животных. Количество БОЕ-э при введении ВМ-2-84 достоверно снижалось у мышей с иммуноком-плексным гломерулонефритом. Таким образом, соединение ВМ-2-84 обладает выраженным эффектом на эритропоэз у больных животных, начиная с ранних этапов дифференци-ровки эритрона. Учитывая, что ВМ-2-84 устраняет гиперплазию эритрона у больных мышей, можно предположить, что купирование анемии связано с уменьшением гемолиза эритроцитов.
Анемия у мышей lupus и nonlupus является гемолитической и связана с влиянием макрофагов и секретируемых ими цитокинов на формирование аутоантител к эритроцитам, что явилось в дальнейшем объектом изучения эффектов ВМ-2-84 у больных мышей. О влиянии ВМ-2-84 на функциональную активность макрофагов у больных мышей B6D2F1 судили по фагоцитозу и продукции ИЛ-1 перитонеальными макрофагами. Курсовое лечение ВМ-2-84 мышей nonlupus приводило к достоверному (в 1,8 раза) снижению фагоцитарной активности макрофагов, спонтанной и митоген-стимулированной продукции ИЛ-1. Как спонтанная, так и ЛПС-стимулированная продукция ИЛ-1 перитонеальными макрофагами под влиянием ВМ-2-84 достоверно снижалась у lupus-животных (табл. 2). Курс лечения соединением ВМ-2-84 у мышей nonlupus приводит к достоверному повышению спонтанной продукции ФНОа и практически не влияет на ЛПС-стимулированную секрецию цитокина.
Таким образом, установлено, что соединение ВМ-2-84 нормализует функцию макрофагов у больных мышей, что, по-видимому, и обусловливает его лечебное действие. Уменьшением фагоцитоза и продукции ИЛ-1 под влиянием препарата предположительно можно объяснить повышение массы тела, снижение СОЭ и про-теинурии у опытных мышей. Понижение секреции ИЛ-1, очевидно, приводит к снижению синтеза Т-хелперами 2 типа цитокинов (ИЛ-4, 5, 6), стимулирующих синтез В-клетками аутоантител к эритроцитам. В результате этого снижается гемолиз эритроцитов и нормализуются показатели костномозгового эритропоэза.
Заключение
Изучение иммуно- и эритропоэзактив-ных свойств нового биологически активного вещества — индол-3-илсульфанилацетата трис-(2-гидроксиэтил)аммония (соединение ВМ-2-84) выявило выраженные Т-лимфотроп-ные, эритропоэзмодулирующие, иммуноде-прессивные, противовоспалительные свойства,
что в сочетании с низкой токсичностью, отсутствием митостатических и лимфотоксических свойств свидетельствуют о потенциальной возможности создания на его основе иммуномодулятора нового типа для лечения аутоиммунных, иммунокомплексных, иммунодефи-цитных поражений, протекающих с анемией. Можно предполагать, что иммунодепрессив-ные свойства соединения связаны не с поликлональной токсичностью, а с наличием новых молекулярных мишеней для соединений данной химической группы.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН № 21 «Фундаментальные науки — медицине», проект № 21.14
Авторы выражают искреннюю благодарность за участие в выполнении экспериментальных исследований Тузовой М.Н. и Сухенко Т.Г.
Список литературы
1. Шкловер В. Е., Гридунова Г. В., Стручков Ю.Т. и др. Кристаллическая и молекулярная структура (4-хлорфенилтио)ацетата трис-(2-оксиэтил)аммо-ния // Докл. РАН. 1983. 269. (2). 387-390.
Shklover V.E., Gridunova G.V., Struchkov Yu.T. etal. Crystalline and molecular structure of (4-chlorophenylthio) acetate of tris-(2-oxyethyl)ammonium // Dokl. RAN. 1983. 269. (2). 387-390.
2. Пат. 2086239 РФ. Противовоспалительное средство / Мирскова А.Н., Левковская Г.Г., Гусева С.А. и др.; опубл. 10.08.1997.
Patent 2086239 RF. Anti-inflammatory drug / Mirskova A.N., Levkovskaya G.G., Guseva S.A. et al.; published 10.08.1997.
3. Пат. 2080861 РФ. Защитное средство при кардиогенном шоке и токсическом стрессе / Нефедова Т.В., Малышев В.В., Корытов Л.И. и др.; опубл. 10.06.1997.
Patent 2080861 RF. Protective remedy against cardiogenic shock and toxic stress / Nefedova T.V., Malyshev V.V., Korytov L.I. et al.; published 10.06.1997.
4. Пат. 2108100 (1993) РФ. Иммуномодулятор / Козлов В.А., Колесникова О.П., Кудаева О.Т. и др.; опубл. 10.04.1998.
Patent 2108100 (1993) RF. Immunomodulator / Kozlov V.A., Kolesnikova O.P., Kudaeva O.T. et al.; published 10.04.1998.
5. Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Сухенко Т.Г. и др. Трекрезан как модулятор гемо- и иммунопо-эза // Докл. РАН. 2003. 391. (3). 410-412.
Kolesnikova O.P., Kudaeva O.T., Sukhenko T.G. et al. Trecrezan as a modulator of hemo- and immunopoiesis // Dokl. RAN. 2003. 391. (3). 410-412.
6. Шабанов П.Д., Ганапольский В.П., Зарубина И.В. и др. Метаболический активатор трекрезан: изучение адаптогенных и иммуномодулирующих свойств // Нейронауки. 2006. 3. (5). 43-48.
Shabanov P.D., Ganapol’skii V.P., Zarubina I.V. et al. Metabolism activator trecrezan: the study of adaptogenic and immuno-modulating properties // Neironauki. 2006. 3. (5). 43-48.
7. Воронков М.Г., Колесникова О.П., Расулов М.М. и др. Экспериментальное и клиническое исследование фармакологическойактивности трис-(2-гидроксиэтил) аммониевых солей арилгетероуксусных кислот // Хим.-фарм. журн. 2007. 41. (5). 13-17.
Voronkov M.G., Kolesnikova O.P., Rasulov М.М. et al. Experimental and clinical study of pharmacological activity of tris-(2-hydroxyethyl) ammonium salts of arylheteroacetic acids // Khim.-farm. zhurn. 2007. 41. (5). 13-17.
8. Колесникова О.П., Мирскова А.Н., Адамович С.Н. и др. Алканоламмониевые соли о-крезокси-и p-хлоркрезоксиуксусных кислот как модуляторы имму-нопоэза и цитостатики // Докл. РАН. 2009. 425. (4). 556-560.
Kolesnikova O.P., Mirskova A.N., Adamovich S.N. et al. Alkaneammonium salts of o-crezoxy- and p-chlorocrezoxyacetic acids as modulators of immunopoiesis and cytostatics // Dokl. RAN. 2009. 425. (4). 556-560.
9. Cunningham A.J., Szenberg A. Further improvements in the plaque technique for detecting single antibody-forming cells // Immunology. 1968. 14. (4). 599-600.
10. Sterzl J., Riha I. Detection of cells producing 7S antibodies by the plaque technique // Nature. 1965. 208. (13). 858-859.
11. Crowle A.J. Delayed hypersensitivity in the mouse // Adv. Immunol. 1975. 20. 197-264.
12. Kimura M., Shimada K., Kanai Y. Specificity of anti-nuclear antibodies induced in F1 mice undergoing the graft versus host reaction: isotypes and cross-reactivities // Clin.Exp.Immunol. 1987. 69. (2). 385-393.
13. Rummage J.A., Lew R.W. Photometric microassay for quantitation of macrophage Fc and C3b receptor function // J. Immunol. Meth. 1985. 77.155-163.
14. Cavaillon J.-M. Dissociation of cell-associated interleukin-1 (IL-1) and IL-1 release induced by lipopolysaccharide and lipid A // Infect. Immun. 1989. 57. (3). 791-797.
15. Phillips R., Rabson A.R. The effect of IL-1 containing supernatants on murine thymocyte maturation // J. Clin. Lab. Immunol. 1983. 11. 101-104.
16. Flick D.A., Gifford G.E. Comparison of in vitro cytotoxic assays for tumor necrosis factor // J. Immunol. Methods. 1984. 68. 167-175.
17. Ompeza-Rendon R.L., Ernst M., Schade U. et al. Activation of bone marrow-derived macrophages by repeated zymosan phagocytosis leads to enhanced prostaglandin synthesis // Immunobiol. 1981. 160. 208-216.
18. Козлов В.А., Журавкин И.Н., Цырлова И.Г. Стволовая кроветворная клетка и иммунный ответ. Новосибирск: Наука, 1982. 222 с.
Kozlov V.A,. Zhuravkin I.N., Tsyrlova I.G. Hemopoietic stem cell and immune response. Novosibirsk: Nauka, 1982. 222 p.
19. Цырлова И.Г.Иммуносупрессорные клетки эритроидного ряда. Эр-супрессоры и их роль в регуляции иммунитета // Вестн АМН СССР. 1991. (12). 34-39.
Tsyrlova I.G. Immunosuppressive cells of erythroid series. Er-suppressors and their role in regulation of immunity // Vestn. AMN SSSR. 1991. (12). 34-39.
20. Орловская И.А., Матросова В.Ю., Халдоя-ниди С.К. Колониеобразующая активность клеток костного мозга мышей NZB в процессе развития аутоиммунной гемолитической анемии // I съезд иммунологов России: тез. докл. Новосибирск, 1992. 347.
Orlovskaya I.A., Matrosova V.Yu., Khaldoyanidi S.K Colony-forming activity of marrow cells of NZB mice in the course of development of autoimmune hemolytic anemia // Proc. I congress of immunologists of Russia. Novosibirsk, 1992. 347.
21. Орловская И.А., Дубинина Л.В., Халдояниди С.К. и др. Изменения в возрастной структуре стволовых кроветворных клеток старых мышей под влиянием фактора, ингибирующего их пролиферативную активность // Онтогенез. 1994. 25. (3). 26-32.
Orlovskaya I.A., Dubinina L.V., Khaldoyanidi S.K. et al. The changes in age structure of hemopoietic stem sells of old mice under the effect of factor inhibiting their proliferative activity // Ontogenez. 1994. 25. (3). 26-32.
22. ОрловскаяИА., ШкловскаяЕ.В., Козлов В.А. Негативные регуляторы гемопоэза. Гомеостатическая роль в формировании взаимоотношений между гемопоэтической и иммунной системами //Иммунология. 1996. (5). 8-13.
Orlovskaya I.A., Shklovskaya E.V., Kozlov V.A. Negative regulators of hemopoiesis. Homeostatic role in the formation of relation between hemopoietic and immune systems // Immunologiya. 1996. (5). 8—13.
23. Колесникова О.П., Кудаева О.Т., Ненашева Е.В. и др. Cелективные иммунодепрессивные свойства нового производного индолил-тиоалканкарбоновой кислоты // Бюл. ТО РАМН. 2007. (2). 14-18.
Kolesnikova O.P., Kudaeva O.T., Nenasheva E.V. et al. Selective immunosuppressive properties of the new derivative of arylheteroalkancarboxylic acids // Byul. SO RAMN. 2007. (2). 14-18.
24. Сухенко Т.Г., Колесникова О.П., Филимонов П.Н. и др. ^стояние иммуно- и эритропоэза у мышей с болезнью трансплантат против хозяина на фоне иммунодефицита // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунол. 1999. (4). 56-60.
Sukhenko T.G., Kolesnikova O.P., Filimonov P.N. et al. Immuno- and erythropoiesis in mice with the diseases of transplant versus host against a background of immunodeficiency // Zhurn. microbiol. epidemiol. immunol. 1999. (4). 56-60.
IMMUNO- AND ERYTHROPOIESOACTIVE PROPERTIES
OF INDOL-3-YL SULFANYL ACETATE OF TRIS-(2-HYDROXYETHYL) AMMONIUM
Olga Petrovna KOLESNIKOVA1, Anna Nikolaevna MIRSKOVA2, Sergey Nikolaevich ADAMOVICH2, Olga Timofeevna KUDAEVA1, Rudolf Grigorievich MIRSKOV2, Mikhail Grigorievich VORONKOV2
institute of Clinical Immunology SB RAMS
14, Yadrintsevskaya str., Novosibirsk, 630099
2Irkutsk Institute of Chemistry n. a. A.E. Favorsky SB RAS 1, Favorsky str., Irkutsk, 664033
The present work is aimed at the investigations of immuno- and haemopoiesoactive properties of new biologically active compound, indol-3-yl sulfanyl acetate of tris-(2-hydroxyethyl) ammonium (compound BM-2-84). It has been found that the compound applied for intact animals in vivo stimulates primary and secondary humoral immune response and phagocytic activity of macrophages as well as suppresses reaction of inhibited hypersensitivity. In vitro, depending on the dosage the compound inhibits spontaneous and mitogen-stimulated proliferation of splenocytes, suppresses the stimulated production of proinflammatory cytokines (IL-ip, TNFa). The compound exerts the pronounced action on marrowy hemopoietic precursors of erythropoiesis. Also, in vitro it stimulated the growth of granuloid colonies and inhibits the growth of erythroid ones. In experimental model of autoimmune diseases (immuno-complex glomerulonephritis) the compound BM-2-84 shows significant clinical effects (eliminates the anemia, increases the weight of animals, decreases ESR, steadily reduces proteinuria). The effects are due to the suppression of proinflammatory cytokines production, as well as erythropoiesis hyperplasia on early stages of differentiation of erythron in ill mice. According to the data of morphological studies, the compound inhibits the development of mesangial proliferative glomerulonephritis.
foy words: (indol-3-yl) sulfanyl alkane carbonic acids, alkyl ammonium salts, model of immuno-complex glomerulonephritis, immunity, anemia.
Kolesnikova O.P. — doctor of medical sciences, head of the laboratory of experimental immunotherapy, e-mail: [email protected]
Mirskova A.N. — doctor of chemical sciences, professor, chief researcher, e-mail: [email protected]
Adamovich S.N. — candidate of chemical sciences, senior researcher
Kudaeva O.T. — doctor of biological sciences, leading researcher
Mirskov R.G. — doctor of chemical sciences, professor, leading researcher
Voronkov M.G. — academician of RAS
