CC BY
57
УДК 573.6.579
Н.Ф. Крюкова С.Н. Адамович 2, А.Н. Мирскова 2, Е.В. Анганова 3
стимуляторы роста стафилококка для ускоренной диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи
1 Нерюнгринская центральная районная больница (Нерюнгри)
2 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (Иркутск) 3 Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (Иркутск)
В статье показана возможность использования ряда биологически активных протонных (2-гидроксиэтил)аммониевых ионных жидкостей общей формулы HN+RIR2(CH2CH2OH)3n. -OOCCH2X(Ind) Ar; R = H, Me, X = O, S, SO2; n = 0—2 в качестве стимуляторов роста S. аигет. Исследовано 24 штамма, выделенных от больных с гнойно-септическими осложнениями из отделения хирургического профиля. Установлено существенное ускорение роста S. aureus на питательной среде, содержащей желточносолевой агар, при. добавлении исследованных стимуляторов в концентрациях I0-4—I0-6 вес. %. Предложено применение стимуляторов для. разработки, усовершенствованной методики, ускоренной диагностики, инфекций, связанных с оказанием, медицинской помощи, вызванных S. аигет, что позволит значительно уменьшить время выдачи результата анализа и. своевременно назначить адекватное лечение больного.
Ключевые слова: стафилококки, стимуляторы роста, питательная среда
staphylococcus, sTiMuLATORs oF GRowTH FoR RApiD DiAGNosis of HEALTHCARE-ASSOCiATED iNFECTiONS
N.F. Kryukova S.N. Adamovich 2, A.N. Mirskova 2, E.V. Anganova 3
1 Neryungri Central Regional Hospital, Neryungri
2A.E. Favorsky Irkutsk Institute of Chemistry SB RAS, Irkutsk
3 Scientific Centre of Family Health and Human Reproduction Problems SB RAMS, Irkutsk
The possibility of using biologically active proton (2-hydroxyethyl) ammonium, ionic liquids of the general formula HN+RIR2(CH2CH2OH)3_n. -OOCCH,X(Ind)Ai; R = H, Me, X = O, S, SO; n = 0-2 as stimulators of growth S. aureus shows in the article;. 24 strains isolated from patients with purulent-septic complications from the surgical department studied. There are shown a significant acceleration, of growth of S. aureus in a agar nutrient containing yolk-salt agar, the addition of stimulants tested, at concentrations 4.I0-6.I0 wt. %. Proposed, use of stimulants for the development of improved, methods of rapid, diagnosis of healthcare-associated infections caused, by S. aureus, which, will greatly reduce the time of issue analysis and. prescribe adequate treatment promptly sick.
Key words: Staphylococcus, stimulators of growth, agar nutritium
актуальность
Нерациональное использование антибиотиков и сульфамидных препаратов привело к развитию резистентности к ним многих патогенных микроорганизмов, в первую очередь, стафилококков, и широкому распространению стафилококковых инфекций, принимающих угрожающий характер и являющихся причиной развития инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), особенно в хирургических отделениях, родильных домах, педиатрических стационарах (язвенные энтероколиты, энтериты, перитониты, эндокардиты, пневмонии, абсцессы легкого, стафилококковый сепсис и др.) [2, 4, 5, 9].
Длительность существующего производства бактериологических анализов негативно сказывается на оказании своевременной медицинской помощи пациенту, усложняя быстрое применение адекватной терапии. Поэтому вопросы ускоренной диагностики инфекций, вызванных стафилококками, являются актуальными.
В настоящее время для культивирования стафилококков применяются питательные среды, на которых длительность выращивания составляет
до 48 часов [7]. В ходе проведения исследований по изучению эпидемиологических и микробиологических особенностей ИСМП выявлено, что перспективным направлением для борьбы с их распространением и сокращением времени выдачи результатов анализа для быстрого назначения больному адекватной антибиотикотерапии может явиться разработка усовершенствованной методики ускоренной диагностики госпитальных инфекций, вызванных S. nureus. Для решения поставленной задачи в данной работе изучена возможность оптимизации питательных сред для роста стафилококков путем добавления в среду культивирования стимуляторов роста.
методика
В качестве стимуляторов роста S. aureus впервые исследованы биологически активные соединения, синтезированные в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН — представители нового класса биологически активных протонных (2-гидрокси-этил)аммониевых ионных жидкостей [2, 6, 8, 10] общей формулы:
HN+R1R2(CH2CH2OH)з_n. -ООССН2Х(1М)Аг;
R = Н, Ме, X = О, Б, SO2; п = 0-2.
Их молекулы состоят из катионов протониро-ванных 2-гидроксиэтиламинов и анионов биологически активных арил(индолил)окси-(сульфанил) (сульфонил)уксусных кислот. Известно, что фрагмент НОСН2СН2№ присутствует в молекулах холина, ацетилхолина и коламина, входит в состав фосфолипидов, коэнзима Q, витамина В12. Моно-этаноламин является составной частью кефалинов, а диметилэтаноламин — лецитина, относящихся к классу фосфолипидов. Второй компонент - органические кислоты — также обладают высокой биологической активностью [1]. Так, ароксиуксусные кислоты, индолилуксусная кислота (гетероауксин) и их производные широко применяются в сельском хозяйстве в качестве гербицидов и стимуляторов роста растений.
Синтезированные (2-гидроксиэтил)аммоние-вые соли арил(гетерил)(сульфанил)-(сульфонил) уксусных кислот при низкой токсичности (LD50 = 1300 — 6000 мг/кг) проявляют высокую и разнообразную биологическую активность: гемо- и иммунотропную, кардиотропную, противовоспалительную, антитромботическую, антиоксидантную, адаптогенную, гипохолестеринемическую [3, 10], являются высокоэффективными ростстимули-рующими препаратами для биотехнологических процессов [6]. Биологическая активность таких 2-гидроксиэтиламмониевых солей существенно превосходит или отличается от активности исходных кислот и алканоламинов.
Соединения данного класса проявляют рост-стимулирующую активность в низких концентрациях (преимущественно в интервале 10-4—10-8 вес. %), легкодоступны благодаря разработанным нами химическим методам синтеза. Исследованные
в данной работе соединения №№ 1—5 (табл. 1) представляют собой бесцветные кристаллические вещества, имеют постоянный состав, устойчивые при хранении, хорошо растворимые в воде.
Испытания соединений №№ 1—5 в качестве потенциальных стимуляторов роста S. aureus проведены на базе бактериологической лаборатории МУЗ Центральной районной больницы г. Нерюн-гри (Иркутская область). В работе использованы 24 штамма S. aureus, выделенных от больных с гнойно-септическими осложнениями из отделения хирургического профиля. Идентификацию выделенных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем «STAPHYtest» фирмы LACHEMA (Чехия) [8].
В ходе испытания проводили растворение каждого потенциального стимулятора роста по следующей методике: растворяли 0,1 г (100,0 мг) вещества в 100,0 мл дистиллированной воды, получая 0,1%-й раствор (матричный). Дальнейшие разведения проводили следующим образом — первое разведение:
0,1 мл матричного 0,1%-го раствора добавляли в 100,0 мл желточно-солевого агара (ЖСА). Концентрация препарата в среде составила 10-4. Второе разведение: 0,1 мл матричного 0,1%-го раствора добавляли в 1000,0 мл ЖСА. Концентрация препарата в среде составила 10-5. В эксперименте использовали каждое разведение препарата в питательной среде и чистую культуру возбудителей ИСМП.
Из культуры золотистого стафилококка готовили взвесь 104 в физрастворе по стандарту мутности. Далее брали три разведения препарата в ЖСА, разливали агар по чашкам Петри (по три чашки каждого разведения препарата в питательной среде). На чашки высевали по 0,1 мл приготовленной взвеси золотистого стафилококка и инкубировали при 37 °С. Просмотр чашек производили каждые
Таблица 1
Структура исследованных соединений №№ 1-5
Соединение Формула
1. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний-4-хлорфенил-сульфанилацетат Cl^ VSCH2C00 • HN(CH2CH2OH)3
2. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний-4-хлор-фенил-сульфонилацетат a^~ysO2CH2COO. HN(ch2ch2oh)3
3. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний-2-хлор-фенил-оксиацетат j-\ © © f V0CH2C00 • HN(CH2CH20H)3 ^l
4. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний-2-метил-4-хлор-фенилоксиацетат /Г~'\ © © Cl Y >0CH2C00. HN(CH2CH20H)3 ^Ch3
5. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний-1-бензил-индол-3-илсульфонилацетат © © S02CH2C00 • HN (CH2CH20H)3 CO CH2C6H5
Таблица 2
Всхожесть S. аиге1^ в питательной среде со стимуляторами роста №№ 1-5 и на контрольной среде ЖСА
№ стимулятора роста Время, час Концентрация,М %
10-4 10-5 10-6
1 З а а а
6 б б а
9 с с б
2 З а а а
6 б б а
9 с с б
3 З а а а
6 б б а
9 с с б
4 З а а а
6 б б а
9 с с б
5 З а а а
6 б б б
9 с с с
Контроль (без стимулятора роста) З д
6 д
9 а
примечание: а - пылевидный рост микроорганизмов, б - единичные колонии микроорганизмов, с - рост микроорганизмов с выраженной лецитиназной активностью, д - отсутствие роста микроорганизмов, «-» - исследования не проводились.
З часа, отмечая рост колоний. В качестве контроля были произведены посевы на ЖСА без стимулятора роста.
При применении синтезированных стимуляторов №№ 1—5 роста S. aureus в среде ЖСА устанавливали всхожесть микроорганизмов.
результаты
Проведенные эксперименты показали значительные различия во всхожести штаммов S.aureus на средах со стимуляторами роста разной концентрации, а также на контрольной среде ЖСА. Так, при использовании всех стимуляторов роста при концентрациях 10-4 — 10-5 вес. %, а также стимулятора № 5 при концентрациях 10-4—10-6 вес. % через З часа имел место пылевидный рост микроорганизмов, через 6 часов отмечались единичные колонии, через 9 часов после высева наблюдался рост S.aureus с выраженной лецитиназной активностью (табл. 2).
При добавлении в питательную среду стимуляторов роста 1—4 в концентрации 10-6 вес. % через З и 6 часов после посева отмечался пылевидный рост микроорганизмов, через 9 часов — рост единичных колоний.
При посеве исследуемых культур на желточносолевой агар без стимуляторов роста через З и 6 часов роста не отмечалось, и только через 9 часов появлялся пылевидный рост микроорганизмов. За
9 часов культивирования S. aureus в контроле не наблюдалось ни роста единичных колоний микроорганизмов, ни роста исследуемых с выраженной лецитиназной активностью.
заключение
Таким образом, впервые установлена рост-стимулирующая активность протонных (2-гидрокси-этил)-аммониевых ионных жидкостей общей формулы
HN + R1R2(CH2CH2OH)3_n. -ООССН2Х(М)Ат; R = H, Me, X = O, S, SO2; n = 0 — 2 в отношении
S. aureus при добавлении в питательную среду на основе желточно-солевого агара. Предложенная питательная среда для методики ускоренной диагностики ИСМП, вызванных S. aureus, содержащая желточно-солевой агар и стимулятор роста, существенно сокращает (до 9 часов) время роста стафилококков (при использовании стимуляторов роста №№ 1—4 в концентрациях 10-4—10-5 вес. % и № 5 в концентрациях 10-4 —10—6 вес. %). Использование предложенной методики позволяет значительно сократить время выдачи результата анализа для быстрого назначения адекватной анти-биотикотерапии.
литература
1. 2-Гидроксиэтиламмониевые соли органил-сульфанил(сульфонил)уксусных кислот — но-
вых фармакологически активных соединений / А.Н. Мирскова [и др.] // Химия в интересах устойчивого развития. — 2011. — Т. 19, № 5. — С. 467-478.
2. Nichols R.L. Preventing Surgical Site Infections // Clinical Medicine, Research. — 2004. — Vol. 2 (2). — P. 115—118.
3. Pat. RF 2086239; Byul. Izobret. [Invention Bulletin], 1997, 22; Pat. RF 2 080 861; Byul. Izobret. [Invention Bulletin], 1997, 16; Pat. RF 2 108 100; Byul. Izobret. [Invention Bulletin], 1998, 10, 153; Pat. RF 2 034 540; Byul. Izobret. [Invention Bulletin], 1995, 13 (in Russian).
4. Брискин Б.С. Внутрибольничная инфекция и послеоперационные осложнения с позиций хирурга // Инфекции и антимикробная терапия. — 2000. — Т. 2, № 4. — С. 561 —583.
5. Внутрибольничные инфекции: Пер. с англ. / Под ред. Р.П. Венцела. — М.: Медицина, 2004. — 840 с.
6. Мирскова А.Н. Алканоламмониевые соли органилсульфанил(сульфонил)уксусных кислот
— новые стимуляторы биологических процессов // ЖорХ. — 2008. — Т. 44, Вып. 10. — С. 1501 — 1508. (Mirskova A.N., Levkovskaja G.G., Mirskov R.G., Voronkov M.G. Hydroxyalkylammonium Salts of Organylsulfanyl(sulfonyl)acetic Acids — New Stimulators of Biological Processes. Russ
J Org Chem 2008, 44: 1478-1485. DOI: 10.1134/ S1070428008100126).
7. Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничной инфекцией: приказ МЗ СССР № 720 от 31.07.78 г.
8. Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г. Практические аспекты современной клинической микробиологии. — М.: Лабинформ, 2004.
— С. 64 — 69.
9. Современные особенности эпидемиологии и профилактики септических инфекционных осложнений у больных отделений реанимации и интенсивной терапии хирургического профиля / В.Г. Акимкин [и др.] // Поликлиника. — 2007. — № 3. — С. 62.
10. Трис-(2-гидроксиэтил) аммоний 2-метил- и 2-метил-4-хлор-феноксиацетаты — эффективные ингибиторы агрегации тромбоцитов и антиоксиданты / А.Н. Мирскова [и др.] // Докл. АН. — 2010. — Т. 433, № 5. — С. 710 — 712. (Mirskova A.N., Adamovich S.N., Mirskov R.G., Voronkov M.G. Tris-(2-Hydroxyethyl)- Ammonium 2-Methyl- and 2-Methyl-4-Chlorophenoxyacetate Serve as Effective Inhibitors of Thrombocyte Aggregation and Antioxidants, Doklady Biological Sciences, Physiology, 2010, Vol. 433, pp. 244 — 246. DOI: 10.1134/S0012496610040022.
Сведения об авторах
Крюкова Наталья Федоровна - врач-бактериолог высшей категории МУЗ «Нерюнгринская центральная районная больница», г. Нерюнгри
Адамович Сергей Николаевич - к.х.н., старший научный сотрудник Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (664033, Иркутск, ул. Фаворского, 1, ИрИХ; тел. 42-65-45; e-mail: mir@irioch.irk.ru)
Мирскова Анна Николаевна - д.х.н., профессор, главный научный сотрудник Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (664033, Иркутск, ул. Фаворского, 1; тел. 42-47-11; e-mail: mirskova@irioch.irk.ru)
Анганова Елена витальевна - к.м.н., старший научный сотрудник ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН
