CC BY
38
УДК 573.6.579
С.Н. Адамович 1, А.П. Федосеев 2, Р.В. Киборт 2, Р.Г. Мирсков 1, А.Н. Мирскова 1
перспективные стимуляторы повышения выхода бактерийной массы STAPHYLOCOCCUS AUREUS (длЯ получения протеина А)
1 Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (Иркутск)
2 Иркутский государственный медицинский университет (Иркутск)
Впервые изучено влияние 2-гидроксиэтиламмониевых солей биологически активных арилсульфанилуксусных кислот, на выход бактерийной массы. Staphylococcus aureus (штамм. № 209), биомассы бактерий Мережковского (Salmonella typhi spermophilorum) и кишечной палочки. (E. coli М-17). Внесение стимуляторов роста в питательную среду в концентрациях 10-3—10-8 вес. % повышает, выход бактерийной, массы, микроорганизмов: Staphilococcus aureus на 32—40 %, бактерий Мережковского Salmonella typhi spermophilorum. — на 47,5—140,4 %, кишечной палочки. — на 11,4—59,4 %. Увеличение выхода биомассы микроорганизмов с использованием, стимуляторов открывает, путь к их практическому использованию в процессах крупномасштабного глубинного культивирования золотистого стафилококка с целью получения ценного протеина А, биопрепаратов, диагностических средств, сывороток, вакцин, для. производства лекарственных пробиотических препаратов, для уничтожения, грызунов (переносчиков чумы., вредителей, урожая зерна, продуктов питания). Ключевые слова: стимуляторы повышения выхода ценной биомассы микроорганизмов
pRospECTivE growth sTiMuLATORs oF BACTERIAL MAss of staphylococcus aureus (to produce protein А)
S.N. Adamovich 1, А^. Fedoseyev 2, R.V. Kibort 2, R.G. Mirskov 1, A.N. Mirskova 1
1 A.E. Favorsky Irkutsk Institute of Chemistry SB RAS, Irkutsk
2 Irkutsk State Medical University, Irkutsk
The influence of 2-hydroxyethylammonium salts of biologically active arylsulfanylacetic acids on the yield, of bacterial mass of Staphylococcus aureus (strain 209), biomass of Merezhkovsky's bacteria (Salmonella typhi spermophilorum.) and E. coli (E. coli М-17) has bee studied, for the first time. The introduction, of growth stimulators (in concentration, of 10-3—10-8 wt. %) into nutrient medium, increases the yield, of microorganisms bacterial mass: Staphilococcus aureus by 32—40 %, Merezhkovsky's bacteria Salmonella typhi spermophilorum by 47,5—140,4 %, E. coli by 11,4—59,4 %. The increase of yield, of the microorganisms biomass reached by application of the growth, stimulators opens the route to their utilization, in large-scale processes of Staphilococcus aureus cultivation for the production, of valuable protein А, biopreparations, diagnostic agents, serum, vaccines, probiotic drugs as well as for the struggle with, rodents (plaque carriers, pests).
Key words: growth stimulators of valuable microorganisms mass
Разработка и совершенствование процессов производства биопрепаратов, в частности, бактерийной массы Staphilococcus aureus (для получения протеина А) является актуальной задачей. В настоящее время бактерийная масса стафилококка широко используется как источник белка A-prateim, который является важнейшим компонентом современных бактерийных биопрепаратов, биоспецифических иммуно- и гемосорбентов, диагностических средств, питательных и защитных сред, сывороток, вирусных вакцин. На его основе разработаны новые иммуноплазмосорбенты с зафиксированным на них девитализированным золотистым стафилококком, высокоэффективные при острых отравлениях, заболеваниях печени и почек, хирургических эндогенных интоксикациях, аутоиммунных и психоневрологических заболеваниях.
A-протеин, выделяемый из клеточной стенки золотистого стафилококка, где его содержание составляет 1,7 % сухого веса клетки или 6,7 % веса клеточной стенки, имеет неоценимое значениие в качестве детектора иммуноглобулина IgG при иммунодиагностике для определения IgG-фракции человека, для очистки, иммобилизации и детекции
иммуноглобулинов, при иммуноферментном анализе, в биосенсорах.
В решении задачи повышения выхода бактерийной массы стафилококка для получения протеина А положительную роль может сыграть использование стимуляторов роста. Благодаря огромному биологическому [2] потенциалу перспективны для этих целей
2-гидроксиэтиламмониевые соли органил-окси(сульфанил)(сульфонил)уксусных кислот с общей формулой Rn(HOCH2CH2)3nN + H. O'(O) CCH2X(Ind)Ar; R = H, Me, X = O, S, SO2; n = 0-2.
Проведенные ранее лабораторные и опытно-промышленные испытания ряда соединений из класса 2-гидроксиэтиламмоний органил-окси(сульфанил)(сульфонил)ацетатов показали их существенное влияние на выход биомассы дрожжей [3, 5, 7]. Так, например, при добавлении указанных выше соединений в питательные среды в концентрациях 10-3-10-8 вес. % увеличивался выход бактерийной массы дрожжей рода Candida на 14-18 %, содержание в ней протеина на 10-12 %, а суммы аминокислот на 7-7,5 %; выход биомассы дрожжей рода Saccharomyces
cerevisiac возрастал на 15-18 %, суммарное содержание аминокислот на 20-29 % по сравнению с контролем. Соединения указанной структуры повышали также выход биомассы бактерий рода Pseudomonas, Methylomonas, Acetobacter и др., гриба Aspergillus niger - продуцента пищевой лимонной кислоты, ускоряли проращивание ячменя в техно-логии получения пивоваренного солода, рост тутового и дубового шелкопрядов [3], рост микроорганизмов рода Bacillusmucilaginosus (Bm), биомасса которых является высоко-эффективной белково-витаминно-ферментной добавкой в корм сельскохозяйственных животных и птиц на 22-44 % [3]. С добавкой стимулятора нарастание биомассы бифидо-бактерий происходит быстрее в 3-4 раза, при этом достигается концентрация бифидо-бактерий 1012 — 1014 клеток в мл продукта, что на 4-6 порядков выше, чем в контроле за более длительное время [4]. Получены первые результаты по существенному стимулированию роста (в 2-2,5 раза) эмбриональных человеческих клеток, используемых в лечении многих заболеваний методами клеточной терапии [8]. При этом не обнаружено даже признаков дистрофии клеток.
Влияние 2-гидроксиэтиламмоний органил-окси(сульфанил)(сульфонил)ацетатов на повышение выхода биомассы Staphylococcus aureus практически не изучено. Известен единичный пример: профессор С.-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера д.м.н. Виноградов Е.Я. впервые обнаружил стимулирующее действие на рост стафилококка Staphilococcus Coowan синтезированного нами нового соединения - 4-бром-фенилсульфанилацетата трис(2-гидроксиэтил) аммония, который в концентрации 4 х 10-4 вес. % в мясопептонном бульоне увеличивал выход сухой бактерийной массы на 25-28,8 % по сравнению с контролем (без стимулятора):
Л~\ © ©
ir^ у SCH2COO • HN(CH2CH2OH)3
Развивая эти исследования с целью поиска перспективных стимуляторов повышения выхода бактерийной массы Staphilococcus aureus, мы из-
Br-<
учили влияние 2-гидроксиэтил-аммониевых солей биологически активных арилсульфанилуксусных кислот на выход бактерийной массы Staphilococcus aureus (штамм № 209), бактерий Мережковского (Salmonella typhi spermophilorum) и кишечной палочки (E. coli М-17).
материалы и методы
Соединения, использованные для испытаний в качестве потенциальных стимуляторов повышения выхода бактерийной массы микроорганизмов, впервые синтезированы в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН. Испытания их стимулирующей активности проведены на кафедре микробиологии Иркутского государственного медицинского университета.
В работе использовали тестовые культуры St. aureus (штамм № 209), а также бактерий Мережковского Salmonella typhi spermophilorum и кишечную палочку (E. coli М-17).
Готовили последовательные серийные разведения стимуляторов от 10-3 до 10-8 вес. % в 4,5 мл питательной среды - мясопептонный агар (МПА). В качестве контроля - 4,5 мл МПА без стимулятора. В каждую пробирку делали посев суточной бульонной культуры по одной калиброванной бактериологической петле. Термостатировали 24 ч при 37 оС. После этого содержимое пробирок высушивали во взвешенных на аналитических весах чашках Петри в сушильном шкафу при 90 оС до постоянного веса. Стимулирующее действие препаратов учитывали через 24 часа по увеличению биомассы в % по отношению к контролю (вес микробной массы в МПА без стимуляторов).
результаты и обсуждение
Исследовано влияние 8 соединений из ряда 2-гидроксиэтиламмоний органилокси- (сульфа-нил) (сульфонил)ацетатов на выход биомассы микроорганизмов в концентрациях 10-3-10-8 вес. % в питательной среде. Все соединения данного ряда проявляют различный по величине стимулирующий эффект по отношению к микроорганизмам, величина которого зависит от строения стимуля-
Таблица 1
Структура активных стимуляторов 1-3.
Соединение
1.Трис(2-гидроксиэтил)аммония
4-хлорфенилсульфанилацетат
2. Диметил-(2-гидроксиэтил)аммония 2,4-динитрофенилсульфанилацетат
3. L-(+)-трео-1-пара-нитрофенил-
2-аммоний-пропандиола-1,3
4-хлорфенилсульфанилацетат
Формула
© ©
NO
«О SCH2COO • HN(CH2CH2OH)3
о
1
-о
© ©
SCH2COO« HN(CH3)2CH2CH2OH
NO2
O2N
>-CH(OH)-CH-CH2OH
■ ^>OCCH2S о
H3N
Cl
Таблица 2
Увеличение выхода бактерийной массы микроорганизмов (в % к контролю)
№ соединения Концентрация соединений, вес. % St. aureus (штамм № 209) Бактерии Salmonella typhi spermophilorum Кишечная палочка
2 10-3 9,3 63,25 59,64
10-4 28,5 63,13
10-5 16,01 21,3 41,4
10-6 26,17 65,4 41,08
10-7 31,96 140,39 12,24
10-8 17,4 120,81 16,72
3 10-3 4,31 50,09
10-4 9,03 59,0 13,16
10-5 47,52
10-6 40,39 52,92 11,39
10-7 36,41 53,16 2,56
10-8 60,83
торов, их концентрации и от вида бактерий. Так, соединение 1 повышает выход биомассы кишечной палочки в концентрации 10-3-10-5 на 19,2-28,5 % и лишь на 1,5-2,5 % выход биомассы стафилококка. Большое влияние из испытанных веществ на выход биомассы Staphylococcus aureus, бактерий Мережковского и кишечной палочки проявили алканоламмониевые соли серосодержащих 4-хлор-и 2,4-динитрофенилсульфанилуксусных кислот (табл. 1). Показатели увеличения выхода биомассы микроорганизмов под влиянием стимуляторов 2, 3 по сравнению с контролем через 24 часа культивирования при 37 оС представлены в таблице 2.
Таким образом, внесение стимуляторов роста (2, 3) в питательную среду в концентрациях 10-3-10-8 вес. % повышают выход бактерийной массы микроорганизмов: Staphylococcus aureus на 32-40 %, бактерий Мережковского Salmonella typhi spermophilorum - на 47,5-140,4 %, кишечной палочки - на 11,4-59,4 %. Стимулирующий эффект соединений 1-3 обусловлен, по-видимому, их активностью как антиагрегантов, стабилизаторов клеточных мембран, антиоксидантов, уменьшающих интенсивность процессов перекисного окисления липидов биологических мембран [1, 6].
Полученные результаты по увеличению выхода ценной биомассы микроорганизмов с использованием стимуляторов открывают путь к их практическому использованию в биотехнологических процессах получения биопрепаратов, диагностических средств, сывороток, вакцин и др. Так, стимуляторы повышения выхода бактерийной массы Staphylococcus aureus перспективны для применения в процессах крупномасштабного глубинного культивирования золотистого стафилококка с целью получения ценного препарата - протеина А.
Биомасса бактерий Мережковского (Salmonella typhi spermophilorum), безвредных для человека и домашних животных, но вызывающих тиф грызунов со смертельным исходом, находит применение
в биологическом методе дератизации для уничтожения вредных грызунов (переносчиков чумы и др. опасных заболеваний, вредителей урожая зерна, продуктов питания) в местах их массовых скоплений (продовольственные склады, морские порты, города).
Биомасса кишечной палочки Е.соїі М-17 используется для производства лекарственных пробиотических препаратов, например, колибак-терина, бификола, биофлора, которые применяется в терапии и профилактике дисбактериоза кишечника. Пробиотики способствуют нормализации микрофлоры, стимулирует местные репаративные процессы в кишечнике; улучшают пищеварение и обмен веществ; стимулируют естественные факторы защиты. В настоящее время проводятся интенсивные исследования по использованию кишечной палочки для производства биотоплива.
Используемые для культивирования микроорганизмов природные стимуляторы дефицитны и дороги. Преимуществом химических стимуляторов является их доступность благодаря разработанным нами способам получения и технологии производства из промышленного сырья, безвредность, постоянный состав, высокая активность при добавлении в питательные среды в низких концентрациях. Введение стимуляторов в питательные среды позволяет сократить добавление дорогостоящих витаминов, аминокислот — цистеина, триптофана, ферментативных гидролизатов казеина, сои, мяса, нативной сыворотки крови и др. Разработаны лабораторные технологические регламенты производства, технические условия на ряд препаратов. Технология опытного производства стимуляторов опробована на Усолье-Сибирском химфармком-бинате. Применение данных стимуляторов не требует капитальных вложений на дополнительное оборудование и изменение технологической схемы производства.
выводы
1. Впервые установлен стимулирующий эффект 2-гидроксиэтиламмониевых солей 4-хлорфенил-сульфанилуксусной кислоты на выход бактерийной массы Staphylococcus aureus (штамм № 209), биомассы бактерий Мережковского (Salmonella typhi spermophilorum) и кишечной палочки (E. coli М-17).
2. Внесение стимуляторов в питательную среду в концентрациях 10-3-10-8 вес. % увеличивает выход бактерийной массы Staphilococcus aureus на 32 -40 %, бактерий Мережковского Salmonella typhi spermophilorum - на 47,5-140,4 %, кишечной палочки - на 11,4-59,4 %, что открывает путь к повышению эффективности процессов крупномасштабного культивирования золотистого стафилококка (с целью получения ценного протеина А, биопрепаратов, диагностических средств, сывороток, вакцин), кишечной палочки (для производства лекарственных пробиотических препаратов), препаратов для уничтожения грызунов (переносчиков чумы, вредителей урожая зерна, продуктов питания).
литература
1. 2-Гидроксиалкил-аммониевые соли арилти-оуксусных кислот и их влияние на функциональную активность тромбоцитов / Г.Г. Левковская [и др.] // Хим.-фарм. журнал. - 1986. - № 3. -С. 295-300.
2. 2-Гидроксиэтиламмониевые соли органил-сульфанил(сульфонил)уксусных кислот - но-
Сведения об авторах
вых фармакологически активных соединений / А.Н. Мирскова [и др.] // Химия в интересах устойчивого развития. — 2011. — Т. 19, № 5. — С. 467-478.
3. Алканоламмониевые соли органилсульфа-нил(сульфонил)уксусных кислот — новые стимуляторы биологических процессов / А.Н. Мирскова [и др.] // Ж. ор. Х. — 2008. — Т. 44. — Вып. 10. — С. 1501 — 1508.
4. Влияние трис-(2-гидроксиэтил)аммоний арокси-, арилтио- и арилсульфонилацетатов на жизнедеятельность бифидобактерий / А.Н. Мирскова [и др.] // Докл. АН. — 2003. — Т. 390, № 2. — С. 280 — 282.
5. Воронков М.Г., Горбалинский В.А., Дьяков В.М. Крезацин — новый биостимулятор микробиологического синтеза // Докл. АН. — 2003. — Т. 369, № 6. — С. 831 —832.
6. Синтез и биологическая активность трис-(2-оксиэтил)аммониевых солей органилтиоуксусных кислот / Г.Г. Левковская [и др.] // Хим.-фарм. ж. — 1983. — № 6. — С. 679 — 683.
7. Способ получения хлебопекарных дрожжей / А.Н. Мирскова [и др.]. — А.с. СССР 1350172 (1987). — Бюлл. изобр. 1987. — № 41.
8. Экспериментальное изучение влияния некоторых биологически активных веществ на рост фибробластов / В.Ю. Кассин [и др.] // Российская оториноларингология. — 2004. — Т. 5, № 12. — С. 85 — 88.
Адамович Сергей Николаевич - к.х.н., старший научный сотрудник Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (664033, Иркутск, ул. Фаворского,1, ИрИХ; тел. 42-65-45; e-mail: [email protected])
КибортРудольф Вадимович - д.м.н., заслуженный профессор кафедры микробиологии ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет»
Мирсков Рудольф Григорьевич - д.х.н., профессор, ведущий научный сотрудник Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского СО РАН (664033, Иркутск, ул. Фаворского,1, ИрИХ)
Мирскова Анна Николаевна - д.х.н., профессор, главный научный сотрудник Иркутского института химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения РАН (664033, Иркутск, ул. Фаворского,1, ИрИХ; тел. 42-47-11; e-mail: [email protected])
