CC BY
65
УДК 663.15
ТРИС-(2-ГИДРОКСИЭТИЛ)АММОНИЕВЫЕ ИОННЫЕ ЖИДКОСТИ - НОВЫЕ БИОСТИМУЛЯТОРЫ РОСТА СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
© Е.А. Привалова1, Н.П. Тигунцева2, С.Н. Адамович3, Р.Г. Мирсков4, А.Н. Мирскова5
1,2Иркутский национальный исследовательский технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83. 3,4,5Иркуткий Институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Фаворского, 1.
Биологически активные трис-(2-гидроксиэтил)аммониевые ионные жидкости (ИЖ) общей формулы [N(CH2CH2OH)3H]+ ' -O(O)CCH2YAr (где Ar=арил; Y=O, S, SO2) исследованы в качестве стимуляторов роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae (концентрация 10-4-10-8 % масс). В присутствии данных ИЖ сокращается лаг-фаза развития, в 2-5 раз увеличивается скорость генерации дрожжевых клеток в логарифмической фазе роста, в процессе ферментации повышается степень сбраживания сахаров, на 6-10% увеличивается выход этилового спирта. Использование исследованных биостимуляторов в производстве спирта и биотоплива дает возможность повысить эффективность процессов и выходы целевых продуктов на единицу массы затраченного сахара. Ключевые слова: ионные жидкости; стимуляторы (активаторы); культивирование дрожжей; скорость роста; биомасса; ферментация; спиртообразование.
TRIS-(2-HYDROXYETHYL)AMMONIUM IONIC LIQUIDS AS NEW BIOSTIMULANTS OF SACCHAROMYCES CEREVISIAE ALCOHOL YEAST
Е.А. Privalova, N.P. Tiguntseva, S.N. Adamovich, R.G. Mirskov, A.N. Mirskova
Irkutsk National Research Technical University, 83 Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia. A.E. Favorsky Irkutsk Institute of Chemistry SB RAS, 1 Favorsky St., Irkutsk, 664033, Russia.
Biologically active tris-(2-hydroxyethyl) ammonium ionic liquids of the general formula [N(CH2CH2OH)3H]+ ' -O(O)CCH2YAr (Ar=aryl; Y=O, S, SO2) have been studied as growth stimulants for Saccharomyces cerevisiae yeast (in the concentration of 10-4-10-8 % mass). Ionic liquids to be introduced into nutrient medium are found to reduce a lag-phase of development and 2-5 times increase the generation rate of yeast cells in a log phase of growth. Fermentation increases sugar attenuation and yields 6-9% more of ethanol in the presence of the examined ionic liquids. Application of the studied biostimulants of growth will improve process efficiency and the product yield per a unit of used sugar mass.
Keywords: ionic liquids; stimulants; growth of yeast; generation rate; biomass; fermentation; ethanol production.
Введение
Микробиологические синтезы лежат в основе получения широкого спектра продуктов народного хозяйства, среди которых можно выделить пищевые кислоты, витамины, биотоплива и растворители.
Наиболее крупнотоннажным продуктом, получаемым методом микробиологического синтеза, является этиловый спирт, биосинтез которого осуществляется преимущественно культурами дрожжевых грибов рода Saccharomyces cerevisiae. При этом существенное
1 Привалова Елена Андреевна, кандидат химических наук, доцент кафедры органической химии и пищевой технологии им. профессора В.В. Тутуриной, тел.: (3952) 405122, e-mail: [email protected]
Privalova Elena, Candidate of Chemistry, Associate Professor of the Department of Organic Chemistry and Food Technology named after Professor V.V. Tuturina, tel.: (3952) 405122, e-mail: [email protected]
2Тигунцева Надежда Павловна, ассистент кафедры органической химии и пищевой технологии им. профессора В.В. Тутуриной, тел.: (3952) 405122, e-mail: [email protected]
Tiguntseva Nadezhda, Assistant Professor of the Department of Organic Chemistry and Food Technology named after the Professor V.V. Tuturina, tel.: (3952) 405122, e-mail: [email protected]
3Адамович Сергей Николаевич, доктор химических наук, старший научный сотрудник лаборатории элементоорганических соединений, тел.: (3952) 426545, e-mail: [email protected]
Adamovich Sergey, Doctor of Chemistry, Senior Researcher of the Laboratory of Organoelement Compounds, tel.: e-mail: [email protected]
4Мирсков Рудольф Григорьевич, доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории элементоорганических соединений, тел.: (3952) 426545, e-mail: [email protected]
Mirskov Rudolf, Doctor of Chemistry, Professor, Leading Researcher of the Laboratory of Organoelement Compounds, tel.: (3952) 426545, e-mail: [email protected]
5Мирскова Анна Николаевна, доктор химических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории химии серы, тел.: (3952) 426545, e-mail: [email protected]
Mirskova Anna, Doctor of Chemistry, Professor, Chief Researcher of the Laboratory of Sulfur Chemistry, tel.: (3952) 426545, e-mail: [email protected]
количество углеводов, поступающих в производство, тратится на синтез биомассы дрожжей [8]. Повышения выхода спирта можно добиться путем совершенствования технологической схемы и снижения потерь сбраживаемых веществ в производстве. Активация метаболических процессов дрожжевой клетки, направленная на увеличение образования целевых продуктов микробиологического синтеза, позволила бы полнее использовать углеводы питательной среды и добиться роста продуктивности микроорганизмов при сокращении затрат сбраживаемых сахаров и снижении общего времени культивирования.
Активация роста и спиртообразующей направленности метаболизма дрожжей может быть достигнута путем оптимизации состава питательной среды, используемой на стадии дрожжегенерирования и ферментации, добавлением биологических стимуляторов. Целью данной работы было изучение влияния биологически активных соединений класса 2-гидроксиэтиламмониевых солей на рост биомассы спиртовых дрожжей и глубину ферментации сахаров.
Экспериментальная часть
В качестве стимуляторов роста дрожжевых грибов рода ЗаосЬвготуовз свгеу1$1ав расы XII использованы водорастворимые соединения, синтезированные в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН на основе биогенных 2-гидроксиэтиламинов Р1Р2М(СН2СН2ОН)п и биологически активных арил-халькогенилуксусных кислот ЛгУСН2С(О)ОН.
Испытуемые соединения 1-4 (таблица) относятся к классу 2-гидроксиэтиламмониевых солей/ионных жидкостей (ИЖ) общей формулы
[1Ч(СН2СН2ОН)зН]+ ■ — О(О)ССН2УЛг, где Аг = арил; У = О, Б, БО2. Среди них выявлены сти-
муляторы микробиологических процессов [1, 4, 6, 7], апробированные в медицине, клинической микробиологии и биотехнологии. Предварительные исследования показали, что эти ИЖ имеют низкую токсичность (Ь050=1300—6000 мг/кг) и проявляют разнообразную биологическую активность в низких концентрациях, в частности, стимулируют процесс ферментации глю-козных субстратов и активируют спиртообразование [3].
ИЖ 1—4 получали реакцией хлорфенилокси- или хлорфенилсульфанил-(сульфонил)уксусных кислот с трис(2-гидроксиэтил)амином (триэтаноламин), мольное соотношение 1:1, растворитель — этиловый спирт. Смесь нагревали при 60—65°С в течение 15—30 мин, выдерживали при 20—22°С 1 ч, выливали в диэтиловый эфир, выдерживали при 5—10°С 12 ч. Образовавшийся осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме. Выделенные порошки хорошо растворимы в воде и спирте. Структуры соединений подтверждены методами элементного анализа, ИК, ЯМР 1Н, 13С, 15Ы спектроскопии.
Культивирование дрожжей ЭассЬаготусез сеге-visiae расы XII проводили на синтетической среде Ри-дер состава (г/л): сахароза — 20; (К1Н4)2БО2 — 3; МдБО4 — 0,7; №С1 — 0,5; КН2РО4 — 1; К2 НРО4 — 0,1.
Дозировку ИЖ в питательную среду осуществляли следующим образом: вначале готовили матричный раствор ИЖ с концентрацией 2 мг/мл (200 мг ИЖ растворяли в 100 мл стерильной дистиллированной воды). Далее проводили последовательное разведение матричного раствора до концентрации 1 ■ 10-2; 1 ■ 10-3; 1 ■ 10-4; 1 ■ 10-5; 1 ■ 10-6; МО"7 % масс. Затем разбавленный матричный раствор дозировали в количестве 1 мл на 20 мл питательной среды Ридер для получения итоговой концентрации соответственно 1 ■ 10-3; 1 ■ 10-4; 011 О-5; 1 ■ 10-6; 1 ■ 10-7; 110-8 % масс.
Характеристика ионных жидкостей, использованных в качестве стимуляторов роста дрожжей
Соединение Формула брутто Формула структурная
1. Трис(2-гидроксиэтил) аммоний-4-хлорфенил-сульфанилацетат C14H22CINO5S [К(СИ2СИ20И)зИ]+ • ■0(0)ССИ2-8-^~^-С1
2. Трис(2-гидроксиэтил) аммоний-4-хлор-фенил-сульфонилацетат C14H22CINO7S [М(СН2СН20Н)зИ]+ • -0(0)ССИ2-802-^~^-С1
3. Трис(2-гидроксиэтил) аммоний-2-хлор-фенил-оксиацетат 2-C14H22CINO6 [К(СИ2СИ20И)зИ]+ • -0(0)ССИ2-0/ \ С1/-
4. Трис(2-гидроксиэтил) аммоний-4-хлор-фенил-оксиацетат 4-C14H22CINO6 [N(CH2CH20H)зH]+ • -0(0)ССИ2-0^~~^-С1
Посевной материал спиртовых дрожжей расы XII готовили методом посева на скошенный сусло-агар с дальнейшим смывом выращенной культуры синтетической средой Ридер. Содержание дрожжевых клеток
посевном
материале
составляло
7,7-10 кл/мл; норма задачи посевного материала -1 мл на 20 мл питательной среды. Культивирование проводили при температуре 30°С в течение 20-36 ч (для построения кривых роста 72 ч). Содержание дрожжевых клеток в культуральной среде оценивали путем определения оптической плотности при 490 нм на фотоэлектроколориметре КФК-3 «ЗОМС» по калибровочному графику, построенному в соответствии с рекомендациями [5]. Содержание живых и мертвых клеток определяли с помощью окрашивания метиле-новым синим, содержание почкующихся клеток - мик-роскопированием. Контрольные опыты проводили с добавлением в питательную среду 1 мл дистиллированной воды вместо раствора ионной жидкости.
Определение общей биомассы дрожжей проводили весовым методом [5], содержание белка в биомассе определяли колориметрически с амидо-черным [2].
Контрольную ферментацию среды Ридер с содержанием сахарозы 10% в присутствии ионных жидкостей проводили при 30°С в течение 96 ч и норме задачи посевного материала дрожжей 5%. Течение ферментации отслеживали, определяя содержание остаточного сахара методом Дюбуа [9], накопление спирта определяли с помощью ГХ-МС на газовом хроматографе 7820 А с селективным масс-спектромет-рическим детектором НР 5975 фирмы Agilent Technologies. Условия хроматографирования: энергия ионизации - 70 эВ; температура сепаратора - 280°С, ионного источника - 230°С; кварцевая колонка 30000x0,25 мм со стационарной фазой (95% диметил-5% дифенилполисилоксан); температура колонки
50°С. Идентификацию компонентов осуществляли с использованием библиотеки масс-спектров «N^11». Количественное содержание компонентов вычисляли по площадям пиков с использованием корректирующих коэффициентов чувствительности.
Обсуждение результатов
Влияние исследованных соединений на рост клеток дрожжей на примере ИЖ 1 представлено на рис. 1. Остальные соединения обладали подобным эффектом. Наиболее эффективно стимулируют прирост числа дрожжевых клеток ИЖ 1 в диапазоне концентраций 1 ■ 10-4—1 ■ 10-8 % масс и ИЖ 4 в диапазоне концентраций 1 ■ 10-6—1 ■ 10-8 % масс, причем стимулирующий эффект начинает проявляться спустя 10-12 ч от начала культивирования. Количество дрожжевых клеток через 36 ч от начала процесса возрастает в 1,7-2,7 раза по сравнению с контролем для ИЖ 1 и в 1,1-2,6 раза для ИЖ 4.
При подсчете живых, мертвых и почкующихся клеток было выявлено, что качественный состав клеток дрожжей в культуральной среде существенно разнится в зависимости от использованной ионной жидкости. Содержание живых клеток в культуральной среде, содержащей ИЖ 1, превышало контрольные значения при концентрациях МО"5 и МО"6 % масс, а содержание почкующихся клеток практически во всем диапазоне исследованных концентраций было на уровне контроля либо несколько выше. В случае добавления в среду для культивирования дрожжей ИЖ 4 в исследованном диапазоне концентраций не было отмечено увеличение количества живых дрожжевых клеток по сравнению с контролем, но наблюдался незначительный рост числа почкующихся клеток при концентрациях 1 ■ 10"6—1 ■ 10"8 % масс, дающих наиболее выраженный эффект прироста общей биомассы.
I 2 ч ■ 4 ч ■ б ч ■ 12 ч Щ 14 ч 6 ч СЗ 18 ч £320 ч ВЗбч Рис. 1. Прирост биомассы дрожжевых клеток в культуральной среде при различных концентрациях ИЖ 1
в
Для ИЖ 3 можно отметить незначительное увеличение числа живых и почкующихся клеток при концентрации 1 ■ 10-6 и 1 ■ 10-7 % масс по сравнению с контролем. Эти концентрации стимулируют и возрастание общего количества биомассы. Интересно отметить тот факт, что при отсутствии ярко выраженного стимулирующего влияния ИЖ 2 на рост биомассы дрожжей наблюдался положительный отклик микроорганизмов, выражающийся в повышении количества живых клеток по сравнению с контролем.
На основании полученных результатов для дальнейших исследований были выбраны концентрации ИЖ 10-4—10-6 % масс (ИЖ 1 — ИЖ 3) и 10-7, 10-8 % масс (ИЖ 4), при которых прирост биомассы дрожжевых клеток был выражен лучше.
При указанных концентрациях были получены кривые роста микроорганизмов (рис. 2), которые свидетельствуют о резком увеличении скорости роста микроорганизмов в средах, содержащих ионные жидкости, по сравнению с контролем, начиная от 10—14 ч культивирования. Для всех исследованных соединений наблюдается сокращение лаг-фазы, клет-
ки дрожжей более оперативно переходят в экспоненциальную фазу роста.
Скорость генерации клеток на отрезке времени культивирования 6—20 ч (экспоненциальная фаза) увеличивается в присутствии ионных жидкостей в 2—5 раз. В начальный период (лаг-фаза) и конечный период (стационарная фаза) скорости генерации клеток в культуральных средах, содержащих ИЖ, и в контроле незначительно отличаются друг от друга. Так как в биотехнологии непрерывные процессы культивирования микроорганизмов ведут, задерживая культуру на экспоненциальной фазе развития, путем введения в питательную среду исследуемых ионных жидкостей можно добиться значительного увеличения скорости прироста биомассы.
Введение ионных жидкостей в состав питательной среды стмулирует рост биомассы дрожжей по общему количеству сухого вещества (рис. 3), а также приводит к увеличению содержания белка в клетке (рис. 4), что косвенно свидетельствует об улучшении ее физиологического состояния.
2 1,8 1,6 1,4 1,2
0,6 0,4 0,2
6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66 70 Время культивирования, ч
—•—10/-4 —■— 10/-5 —А— 10/-6 —Контроль
Рис. 2. Накопление биомассы дрожжей в присутствии ИЖ 1
1,55
Ч
Ü 1,5
и §
cf 1,45
Ц 1,4
и
о 1,35
£
1,3 1,25 1,2
ИЖ 1; 10/-4 ИЖ 2; 10/-6 ИЖ 3; 10/-5 ИЖ 4; 10/-7 Контроль Концентрация ионной жидкости в питательной среде, % масс
Рис. 3. Прирост биомассы дрожжей в присутствии ионных жидкостей через 36 ч культивирования
1
0,8
0
2
60
50
i 40
ч
X®
04 30
=
i 20
S
и
10
0
|||||
ИЖ 1; 10/-4 ИЖ 2; 10/-6 ИЖ 3; 10/-5 ИЖ 4; 10/-7 Контроль Концентрация ионной жидкости в питательной среде, % масс
Рис. 4. Содержание белка в биомассе дрожжей, выращенных с использованием ионных жидкостей
Проведение ферментации среды Ридер в присутствии ионных жидкостей выявило увеличение скорости и глубины сбраживания сахаров (рис. 5), а также увеличение накопления спирта (рис. 6). Так, степень сбраживания сахаров по сравнению с контролем возрастает на 10—15% и в отдельных случаях достигает 95%. Эффективность ферментации синтетической среды Ридер без добавления
стимуляторов роста была довольно низкой, продуктивность микроорганизмов в серии параллельных опытов составила в среднем 35,2 мг спирта на 100 мг ассимилированного сахара. Введение в состав среды ионных жидкостей позволило повысить продукцию спирта до 37—45 мг на 100 мг ассимилированного сахара.
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 Время ферментации, ч
-•-10/-4 -«-10/-5 -А-10/-7 —♦— Контроль
Рис. 5. Динамика сбраживания сахаров в присутствии ИЖ 3
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 Время ферментации, ч
-•-10/-4 -Ш-10/-5 -А-10/-7 —»— Контроль
Рис. 6. Динамика образования спирта в присутствии ИЖ 3
120
100
80
60
40
20
0
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Таким образом, проведенное исследование показало, что 2"гидроксиэтиламмониевые ионные жидкости позволяют интенсифицировать процесс выращивания спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII, что выражается в приросте биомассы, повышении числа живых и почкующихся клеток, увеличении содержания белковых соединений в клетке. Положительное влияние ионных жидкостей на клетки дрожжей позволяет увеличить глубину сбраживания сахаров и усилить спиртообразование. Использование исследованных биостимуляторов в производстве
спирта и биотоплива, а также кормовых и хлебопекарных дрожжей дает возможность повысить эффективность процессов и выходы целевых продуктов на единицу массы затраченного сахара. Преимуществом исследованных биостимуляторов является их доступность, низкая стоимость, хорошая растворимость в воде, устойчивость при хранении, нетоксичность, эффективность в низких (110"4—1 ■ 10"8 % масс) концентрациях.
Статья поступила 05.10.2015 г.
Библиографический список
1. Алканоламмониевые соли органилсульфа-нил(суль-фонил)уксусных кислот - новые стимуляторы биологических процессов / А.Н. Мирскова, Г.Г. Левковская, Р.Г. Мирсков, М.Г. Воронков // Журнал органической химии. 2008. Т. 44. Вып. 10. С. 1501-1508.
2. Бузун Г.А., Джемухадзе К.М., Милешко Л.Ф. Определение белка в растениях с помощью амидо"нерного // Физиология растений. 1982. Т. 29. Вып. 1. С. 196-204.
3. Влияние протонных ионных жидкостей на бродильную активность спиртовых дрожжей / К.В. Молокова, Е.А. Привалова, С.Н. Адамович, А.Н. Мирскова, Р.Г. Мирсков // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2014. № 1 (6). С. 70-74.
4. Использование биологически активных соединений в качестве стимуляторов роста стафилококков / А.Н. Мирскова, М.Ф. Савченков, А.В. Духанина, С.Н. Адамович, Р.Г. Мирсков, Н.Ф. Крюкова // Сибирский медицинский
журнал. 2014. № 2. С. 75-79.
5. Качмазов Г.С. Дрожжи бродильных производств. Практическое руководство: учеб. пособие. СПб.: Лань, 2012. 224 с.
6. Перспективные стимуляторы повышения выхода бактерийной массы Staphylococcus aureus (для получения протеина А) / С.Н. Адамович, А.П. Федосеев, Р.В. Киборт, Р.Г. Мирсков, А.Н. Мирскова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2012. № 5 (87). Ч. 1. С. 173-176.
7. Стимуляторы роста менингококка на основе солей 2-гидроксиалкиламинов / А.Н. Мирскова, С.Н. Адамович, Е.Я. Виноградов, Р.Г. Мирсков // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. 2012. № 5 (87). Ч. 1. С. 276-280.
8. Яровенко В.Л., Маринченко В.А. Технология спирта. М.: Колос, 2001. 464 с.
9. Dubois M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analyt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.
УДК 669.71
ВЛИЯНИЕ ГИДРОФИЛЬНЫХ КОЛЛОИДОВ НА СГУЩЕНИЕ И ПРОМЫВКУ КРАСНЫХ ШЛАМОВ ИЗ НИЗКОКРЕМНИСТЫХ БОКСИТОВ
© В.И. Саламатов1, Б.А. Байбородин2, О.И. Рандин3, О.В. Саламатов4
Иркутский национальный исследовательский технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83.
Приведены результаты исследования процессов сгущения и промывки низкокремнистых красных шламов с применением гидрофильных коллоидов (крахмал, мука). Исследовано влияние гидрофильных коллоидов на агрега-тивную и кинетическую устойчивость шламистых пульп красных шламов. Показано, что обработка пульп гидрофильными коллоидами в оптимальной дозировке обеспечивает рост скорости осветления как в процессе сгущения, так и в процессе декантационной противоточной промывки осадков красных шламов. Установлено, что гидрофильные коллоиды оказывают влияние на сорбционные свойства красных шламов, образуя на границе раздела фаз нерастворимые тонкие гидрофобные пленки.
Ключевые слова: гидрофильные коллоиды; сгущение; декантационная промывка; красный шлам.
1Саламатов Виктор Иванович, кандидат технических наук, доцент кафедры машиностроительных технологий и материалов, тел.: 89149367088, e-mail: [email protected]
Salamatov Viktor, Candidate of technical sciences, Associate Professor of the Department of Machine-Building Technologies and Materials, tel.: 89149367088, e-mail: [email protected]
2Байбородин Борис Алексеевич, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой мировой экономики, тел.: (3952) 344515, e-mail: [email protected]
Bayborodin Boris, Doctor of technical sciences, Professor, Head of the Department of World Economy, tel.: (3952) 344515, e-mail: [email protected]
3Рандин Олег Иванович, кандидат химических наук, доцент кафедры информатики, тел.: 89041259 544, e-mail: [email protected] Randin Oleg, Candidate of Chemistry, Associate Professor of the Department of Computer Science, tel.: 89041259544, e-mail: [email protected]
4Саламатов Олег Викторович, аспирант, тел.: 89086547000, e-mail: [email protected] Salamatov Oleg, Postgraduate, tel.: 89086547000, e-mail: [email protected]
