CC BY
45
УДК: 573.6.579
ВЛИЯНИЕ ПРОТОННЫХ ИОННЫХ ЖИДКОСТЕЙ НА БРОДИЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ СПИРТОВЫХ ДРОЖЖЕЙ
К.В. Молокова1, Е.А. Привалова1, С.Н. Адамович2, А.Н. Мирскова2, Р.Г. Мирсков2
Иркутский государственный технический университет, 664074, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83, [email protected] 2Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, 664033, г. Иркутск, ул. Фаворского, 1.
Приведены результаты тестирования протонных (2-гидрокисэтил)аммониевых ионных жидкостей в качестве биологически активной добавки, стимулирующей ферментацию синтетических глюкозных субстратов дрожжами Saccharomyces cerevisiae. Установлено стимулирующее действие трис(2-гидроксиэтил)аммоний-4-хлорфенил-сульфанилацетата и трис(2-гидроксиэтил)аммо-ний-4-хлорфенил-сульфонилацетата на рост дрожжевых клеток и интенсивность спиртообразования. Показано, что введение в состав субстрата трис(2-гидроксиэтил)аммоний-4-хлорфенил-сульфонилацетата в концентрации 1 х 10 6 % масс приводит к увеличению выхода спирта на 9%. Ил. 1. Табл. 1. Библиогр. 7 назв.
Ключевые слова: стимуляторы роста; биологически активные вещества; спиртовое брожение.
PROTON IONIC LIQUIDES EFFECT ON ALCOHOL YEAST FERMENTATIVE ACTIVITY
K.V. Molokova1, E.A. Privalova1, S.N. Adamovich2, A.N. Mirskova2, R.G. Mirskov2
Irkutsk State Technical University,
83, Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia, [email protected] A.E. Favorsky Irkutsk Institute of Chemistry SB RAS, 1, Favorsky St., Irkutsk, 664033, Russia.
Proton (2-hydroxyethyl) ammonium ionic liquids were tested as synthetic glucose substrate fermentation stimulants for alcohol yeast Saccharomyces cerevisiae. Stimulative effect of tris-(2-hydroxyethyl) ammonium 4-chlorophenyl-sulfanylacetate and
tris-(2-hydroxyethyl) ammonium 4-chlorophenyl-sulfonylacetate was confirmed by yeast cells enlargement and alcohol generation effectiveness. Tris-(2-hydroxyethyl) ammonium 4-chlorophenyl-sulfonylacetate to be introduced into fermentation substrate was found to enhance the alcohol yield by 9%. 1 table. 7 sources.
Key words: stimulator of growth; biologically active substances; alcohol fermentation. ВВЕДЕНИЕ
Активация процессов жизнедеятельности микроорганизмов и сокращение сроков ферментации субстратов в процессах биосинтеза является одной из актуальных задач биотехнологии. Длительность процесса ферментации, в настоящее время используемого в промышленности для получения этилового спирта, в зависимости от технологической схемы и организации процесса составляет 56-72 ч [1]. При этом используются невысокие концентрации субстрата (около 15% масс по сахару), и выход целевого продукта составляет 59-65% от массы использованного условного крахмала. Для сокращения сроков ферментации и увеличения выхода спирта рекомендуется совершенствовать технологическую схему и оборудование, повышать концентрацию субстрата, использовать целлюлолитические ферментные препараты, увеличивающие степень гидролиза биополимеров зернового сырья, вводить новые штаммы спиртовых дрожжей [1-3].
В то же время в биотехнологии широко применяются биологически активные вещест-
ва (БАВ), обладающие способностью стимулировать рост и метаболизм микроорганизмов. Например, феруловая и гибберелловая кислота, кумарин, биотин, используются в солодовенном и спиртовом производстве, при выращивании хлебопекарных дрожжей [4]. Номенклатура БАВ постоянно расширяется. При этом предпочтение отдается соединениям, которые в низких концентрациях обладают стимулирующим эффектом, не оказывают влияния на протекание технологического процесса, не обладают побочным действием и вредным влиянием на организм человека и животных.
В литературе имеются сообщения об успешном использовании в качестве БАВ трис(2-гидроксиэтил)аммоний арилхалькоге-нилацетатов, по своей структуре подобных протонным ионным жидкостям [5-7]. Они проявляют биологическую активность в низких концентрациях (1 * 10-4-1 * 10-8% масс.), что позволяет использовать их в биотехнологических процессах без существенного изменения состава субстрата и организации процесса. В
© ©
Cl-(' х)—SCH2COO • HN(CH2CH2OH)3
Cl-/ \—SO2CH2COO . HN(CH2CH2OH)3
Структурные формулы ионных жидкостей
2
данной работе в качестве стимуляторов спиртового брожения были протестированы протонные (2-гидрокисэтил)-аммониевые ионные жидкости, синтезированные в Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского Со РАН.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Соединения трис(2-гидроксиэтил)аммо-ний-4-хлорфенил-сульфа-нилацетат (1) и трис(2-гидроксиэтил)аммоний-4-хлорфенил-сульфонилацетат (2) получали реакциями 4-хлорфенилсульфанил- или 4-хлорфенил-сульфонилуксусной кислот с трис-(2-гидрокси-этил)амином (триэтаноламином), взятыми в мольном соотношении 1 : 1, в этиловом спирте. Смесь нагревали при 60-65 оС в течение 15-30 мин, выдерживали при 20-22 оС 1 час. По окончании реакции выливали в диэтило-вый эфир до прекращения выделения осадка и выдерживали при 5-10 оС 12 ч. Осадок отфильтровывали, промывали эфиром и высушивали в вакууме. Выделены порошки, хорошо растворимые в воде и спирте. Состав и структура соединений 1 и 2 установлены методами элементного анализа, ИК и ЯМР 1Н,
13 15
С, N спектроскопии.
В работе были использованы соединения 1 и 2 в концентрации 1 х 10-6 и 1 х 10-8 % масс. Ферментации подвергали синтетический модельный субстрат состава (% масс): глюкоза -15; диаммонийфосфат - 0,5. Дозировку соединений в модельный субстрат осуществляли следующим образом: вначале готовили матричный раствор соединений 1 или 2 с концентрацией 1 мг/мл (100 мг вещества растворяли в 100 мл дистиллированной воды). Далее проводили последовательное разведение матричного раствора до концентрации 1 х 10-4 и 1 х 10-6% масс. Разведенный матричный раствор дозировали в количестве 0,1 мл на 100 мл модельного субстрата для получения концентрации, соответственно, 1 х 10-6 и 1 х х 10-8% масс.
Ферментацию проводили спиртовыми дрожжами БасМаготусвв свгвуШав расы XII, выращенными из музейной культуры методом последовательных пересевов на смешанном солодово-глюкозном жидком субстрате. Со-
держание дрожжевых клеток в посевном материале составляло 16 х 106 кл/мл; норма задачи посевного материала 8% к объему субстрата. Брожение протекало при температуре 30 °С в течение 72 ч, после чего в культураль-ной жидкости определяли содержание дрожжевых клеток методом подсчета в камере Го-ряева и содержание этилового спирта методом ГХ-МС на газовом хроматографе 7820 А с селективным масс-спектрометрическим детектором НР 5975 фирмы «Agilent Technologies». Условия хроматографирования: энергия ионизации - 70 эВ; температура сепаратора - 280 °С, ионного источника - 230 °С; кварцевая колонка 30000 х 0,25 мм со стационарной фазой (95% диметил-5% дифенилпо-лисилоксан); температура колонки 50 °С. Идентификацию компонентов осуществляли с использованием библиотеки масс-спектров «NIST11». Количественное содержание компонентов вычисляли по площадям пиков с использованием корректирующих коэффициентов чувствительности.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Проведенные эксперименты выявили различия в активности дрожжевых клеток Saccha-romyces cerevisiae при ферментации субстратов, содержавших ионные жидкости в исследованных концентрациях, а также контрольного глюкозного субстрата (таблица).
Так, при введении в состав субстрата соединения 1 увеличение кратности прироста дрожжевых клеток по сравнению с контролем наблюдалось в концентрации 1 х 10-6 и 1 х х 10-8% масс, а в случае использования соединения 2 только при концентрации 1 х 10-6% масс. Прирост числа дрожжевых клеток сопровождался увеличением концентрации спирта в культуральной жидкости, причем наибольшее увеличение спиртообразования наблюдалось в случае введения в субстрат соединения 2 в концентрации 1 х 10-6% масс. В этом случае выход спирта составил 69% от теоретически возможного и превысил контроль на 9%. В то же время соединение 2 в концентрации 1 х 10-8% масс не оказало стимулирующего действия на дрожжегенериро-
