CC BY
62
УДК 616.24-002.5-085-092:616.9-06
Л. И. Арчакова1, Б. Е. Кноринг1, М. В. Павлова1, М. Н. Смирнов2
иммуногеиетический профиль больных туберкулезом легких и возможности совершенствования терапии
1Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Росмедтехнологий
2Санкт-Петербургский государственный университет, Медицинский факультет
Туберкулез легких остается одной из главных медицинских проблем. Учитывая высокую контагиозность заболевания, сложность лечения многих форм специфической инфекции, ВОЗ рассматривает туберкулез как одну из основных социально значимых инфекционных болезней, которая является предметом интенсивных научных исследований.
Туберкулез легких различается не только по клинической картине, но и по эпидемиологической значимости, а развитие заболевания не только связано с биологическими свойствами микроорганизма, но и зависит от степени напряженности клеточного иммунитета больного и во многом определяется генетическими факторами [1-4]. К настоящему времени известно более 4 тыс. моногенных болезней, являющихся следствием мутаций единичного гена, и более 600 хромосомных болезней, обусловленных изменением числа или структуры хромосом, однако доля их неизмеримо мала среди всей патологии у человека в сравнении с мультифакториальными заболеваниями, когда пожизненный риск (lifetime risk) достаточно высок. Туберкулезную инфекцию можно отнести к этой группе заболеваний [5]. Система HLA генов II класса является наиболее значимым звеном генетического контроля восприимчивости к инфекционным заболеваниям вообще и к туберкулезу в частности, так как в ней расположены гены иммунного ответа, ответственные за распознавание инфекта, кооперацию клеток и дальнейшее развитие иммунного ответа [6, 7].
Определение групп риска по параметрам возникновения и неблагоприятного течения туберкулеза органов дыхания очень важно и связано с идентификацией генов, от которых зависит восприимчивость или резистентностность организма человека к туберкулезной инфекции, в частности, генов II класса главного комплекса гистосовместимости локусов HLA-DQB1* и HLA-DRB1*.
Цель настоящего исследования — изучение значимости иммуногенетических параметров у больных туберкулезом органов дыхания и возможности оптимизации лечения.
Материалы и методы исследования. Проведено молекулярное генотипирование аллелей локуса HLA-DRB1* с целью изучения наследственной предрасположенности к туберкулезу органов дыхания у 114 больных методом полимеразно-цепной реакции (PCR-SSP) с использованием панели отечественных праймеров фирмы «ДНК-технология» (Москва, Институт иммунологии) при участии лаборатории РоссНИИ гематологии и транс-фузиологии. Сравнительный анализ локуса HLA-DRB1* был осуществлен у 434 здоровых людей, при этом у 88 проведено одномоментное изучение аллельных вариантов гена HLA-DQВ1*. Больные туберкулезом легких, так же, как и здоровые люди, были славянской
© Л. И. Арчакова, Б. Е. Кноринг, М. В. Павлова, М. Н. Смирнов, 2009
национальности, проживали в Северо-Западном регионе России. Исследование клеточного звена иммунитета включало определение субпопуляционного состава лимфоцитов по поверхностному фенотипу с использованием моноклональных антител тест-системы 1МК — Simultest и проточного цитометра, изучение гуморального звена иммунитета проводили по уровню противотуберкулезных антител (ПТАТ).
Результаты подвергнуты обработке с помощью непараметрического критерия X2 с поправкой Йетса. Показатель относительного риска развития заболевания (RR) определяли методом Вульфа (5). Показатель RR выше 1 принимали за значимый, если RR была меньше 0,5, ассоциацию расценивали как достоверно отрицательную [8].
Результаты исследования. Для локуса ^А-ОКВ1* известно 13 типов аллелей, распределение которых у пациентов с туберкулезом легких представлено на рисунке. Анализируя полученные результаты, можно констатировать, что 16 аллель достоверно более часто фиксировался у больных туберкулезом органов дыхания (17,5 против 6,9 % у здоровых, рф < 0,05). Относительный риск (RR) заболеть туберкулезом у здоровых лиц — носителей 16 аллеля — равен 2,9.
Для локуса HLA-DQB1* известно 5 типов аллелей. Данные генетического типи-рования частот встречаемости аллелей локуса HLA-DQB1* у больных туберкулезом
30
25
20
15
10
5
0
I группа больных (п = 114) П группа здоровых (и = 434)
Частота встречаемости в % аллелей локуса НЬА-БКВР *рф < 0,05 — достоверно между группами.
легких и здоровых людей представлены в табл. 1. Сопоставление результатов показало, что у больных туберкулезом легких значительно чаще встречается 05 аллель (42,0 %, рф < 0,05) по сравнению со здоровыми лицами (29,5 %), относительный риск (ЯЯ) заболеть туберкулезом у здоровых лиц — носителей 05 аллеля равен 3,3. Реже фиксировали 03 аллель (44,7 против 62,5 %, рф < 0,05, ЯЯ — 0,3).
Таблица 1
распределение аллелей локуса HLA-DQВ1* у больных и у здоровых лиц
Аллель локуса HLA-DQB1* Частота встречаемости аллелей локуса HLA-DQB1*, %
Здоровые (п = 88) Больные туберкулезом (п = 114)
02 31,8 25,0
03 62,5 44,7+
04 3,4 5,0
05 29,5 42,0+
06 46,6 42,0
+рф < 0,05 — достоверно между группами.
Изучение межлокусных взаимосвязей выявило, что для больных, имеющих в генотипе сочетание 05 аллеля HLA-DQВ1* и 16 HLA-DRB1*, отмечены достоверные различия частот встречаемости сочетания данных маркеров — 36,7 против 11,5 % у здоровых лиц при риске развития туберкулеза органов дыхания (RR), равном 4,3.
Анализ клинической картины специфической инфекции показал, что на фоне проводимого комплексного лечения при всех одинаковых клинических условиях и индивидуально подобранной химиотерапии выделялась группа больных (46 из 114) с замедленными темпами конверсии мазка мокроты, улучшения рентгенологической динамики, нередко с прогрессированием туберкулезного процесса.
У больных с неблагоприятным развитием заболевания фиксировали увеличение частоты встречаемости сочетания 05 аллеля HLA-DQВ1* и 16 ^А^ИВ 1* до 48,0 % при риске развития неблагоприятной динамики туберкулезной инфекции (RR), равном — 6,8, против 25,0 % (RR — 2,4) у пациентов с благоприятным течением и 11,5 % — у здоровых лиц. В ходе исследования также установлено, что у больных с наличием 05 аллеля HLA-DQВ1* в сочетании с 16 HLA-DRB1 * был наиболее агрессивный вариант течения заболевания: в 83,3 % наблюдений сформировался фиброзно-кавернозный туберкулез легких, на фоне лечения отмечали обострение и прогрессирование специфической инфекции.
Следующим этапом нашей работы было сравнение показателей популяционного состава лимфоцитов у 68 больных с благоприятной динамикой заболевания (1-я группа), у 34 — с прогрессирующим течением (2-я группа) и у 12 пациентов с неблагоприятным развитием заболевания, которые являлись носителями 05 аллеля HLA-DQВ1* и 16 HLA DRB1* (3-я группа).
Табл. 2 иллюстрирует, что относительное содержание CD3+ во 2-й группе было снижено, а для больных 3-й группы характерен достоверно низкий уровень CD3+ — 66,2 ± 2,1 против 71,1 ± 1,4 % у доноров. Маркером иммунной недостаточности в этой группе являлось достоверно более низкое содержание Т-хелперов CD3+CD4+ — 39,1 ± 2,6 %
(здоровые лица — 47,5 ± 3,6 %), отмечена отчетливая тенденция повышения уровня CD95+ относительно больных 1-й группы (р < 0, 1), фиксировали достоверное увеличение количества СD25+ (рецепторов к 1Ь-2).
Таблица 2
Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов в различных группах больных туберкулезом легких и здоровых лиц (%)
Показатель Благоприятная динамика заболевания (п = 68) (1-я группа) Неблагоприятное течение заболевания (п = 46) норма (контроль) (п = 20)
Без 05 аллеля ^А-DQB1* и 16 аллеля Н^А- DRB1* (п = 34) (2-я группа) С наличием 05 аллеля HLA-DQB1* и 16 аллеля ^А-ЭКБ1* (п = 12) (3-я группа)
1 2 3 4
CD3+ 73,6 ± 1,9 67,1 ± 2,3 * 66,2 ± 2,1^ 71,1 ± 1,3
CD3+ CD4+ 46,5 ± 1,3^ 43,0 ± 2,0 *■>39,1 ± 2,6^ 47,5 ± 2,5
CD3+ CD8+ 26,4 ± 1,4 22,5 ± 0,2 27,5 ± 2,2 23,0 ± 5,0
CD3+ HLA.DK 17,8 ± 3,5 9,7 ± 1,5 9,6 ± 3,1 8,9 ± 4,1
CD95+ 44,6 ± 4,0 52,2 ± 2,5 58,3 ± 6,1 51,5 ± 10,7
CD25+ 15,5 ± 1/Т 23,3 ± 5,6 26,4 ± 5,1^ 19,0 ± 1,7
CD16+ 15,6 ± 1,7 16,0 ± 1,5 22,6 ± 2,7 15,1 ± 4,9
CD19+ 8,9 ± 1,1 10,9 ± 1,2 10,3 ± 1,7 12,4 ± 5,7
Примечание. Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов в различных группах больных туберкулезом легких и здоровых лиц (%). *р < 0,05, достоверно между группами 3-4. • р < 0,05, достоверно между группами 1-3.
Как следует из табл. 3, у всех больных туберкулезом легких определяли повышенные титры противотуберкулезных антител. Так, их уровень, определяемый в реакции потребления комплемента (РПК), был в 1-й группе в 2 раза, а у пациентов 3-ей группы — в 3 раза выше, чем у доноров.
Таблица 3
Показатели гуморального иммунитета в различных группах больных туберкулезом легких
и здоровых доноров (у. е.)
Группа наблюдения РПК РПГ ИФА
Благоприятная динамика заболевания (п = 68) (1 группа) 1 *) 32,2 ± 2,7 *)24,9 ± 3,5 0,7 ± 0,3
неблагоприятное течение заболевания (п = 46) Без 05 аллеля НЬА- DQB1* }и 16 аллеля НЬА- DRB1* (п = 34) (2-я группа) 2 *)41,2 ± 4,7 *)23,3 ± 2,2 *)1,4 ± 0,4
С наличием 05 аллеля HLA-DQB1* и 16 аллеля НЬА^КВ1* (п = 12) (3-я группа) 3 *)44,9 ± 5,5^ *)29,9 ± 2,5" *)1,4 ± 0,2
Норма (контроль) (п = 20) 4 14,5 ± 1,7 7,1 ± 4,6 0,2 ± 0,1
*р < 0,05, достоверно между группами 1-4, 2-4, 3-4. • р < 0,05, достоверно между группами 1-3. •• р < 0,05, достоверно между группами 2-3.
Для иммунокоррекции в комплексную терапию больных туберкулезом легких был включен препарат селективного действия — рекомбинантный 1Ь-2 (Ронколейкин®), способствующий увеличению функциональной активности и пролиферации Т-клеток (в основном ^2). Показанием для назначения иммунокорректора наиболее тяжелой группе больных — носителей 05 аллеля НЬА-Э0В1* и 16 НЬА-ОКВ1* явилась совокупность иммунологических показателей пациента.
Противотуберкулезные препараты применялись в соответствии с лекарственной чувствительностью микобактерий туберкулеза. С иммунокорригирующей целью Ронколейкин® назначался пациентам 3-ей группы в дозе 0,5 мг в режиме трех внутривенных инфузий на физиологическом растворе.
Примененный комплексный режим иммунохимиотерапии с использованием Ронко-лейкина® у ранее прогрессирующих больных способствовал конверсии мазка мокроты или снижению интенсивности бактериовыделения в 83,3 % случаев, уменьшению инфильтра-тивных и очаговых изменений в легочной ткани — в 91,7 % наблюдений, в ряде случаев с уменьшением полостей распада, т. е. происходила стабилизация процесса или обратное его развитие. Параллельно с положительной клинической динамикой наблюдалась нормализация количества Т-лимфоцитов (до 72,2 ± 2,1 %, р < 0,05), Т-хелперов (до 45,9 ± 1,6 %, р < 0,05), а также тенденция снижения уровня маркеров, индуцирующих апоптоз (51,3 ± 3,1 %).
обсуждение. Таким образом, в результате исследования была установлена положительная ассоциация 05 аллеля НЬА-Э0В1* и 16 НЬА-ОКВ1* с заболеванием туберкулезом (ЯЯ — 3,3, ЯЯ — 2,9). Отрицательная связь характерна для 03 аллеля НЬА^ИВ1* и заболеванием туберкулезом органов дыхания (КЯ — 0,3).
При наличии в генотипе сочетания 05 аллеля НЬА-Э0В1* и 16 НЬА^ИВ1* риск развития туберкулеза органов дыхания (ЯЯ) равняется 4,3. У больных с неблагоприятным развитием заболевания увеличивается частота встречаемости сочетания 05 аллеля НЬА-Э0В1* и 16 НЬА-ЭКВ1*до 48,0 % при риске развития неблагоприятной динамики туберкулезной инфекции (ЯЯ), равном — 6,8.
Надо отметить, что для больных туберкулезом легких, имеющих в генотипе 05 аллель НЬА-Э0В1* и 16 НЬА-ОИВ1*, характерен наиболее неблагоприятный вариант развития заболевания: у 83,3 % пациентов сформировался фиброзно-кавернозный туберкулез легких.
При хронических инфекционных заболеваниях, таких как туберкулез, протекающих с реакциями гиперчувствительности замедленного типа, основным звеном противоин-фекционного иммунитета являются различные субпопуляции Т-лимфоцитов, при этом важную роль играют CD3+ и CD4+ лимфоциты, продуцирующие провоспалительные цитокины, которые принимают активное участие в генерации антимикробной активности макрофагов. Для больных туберкулезом органов дыхания, особенно носителей сочетания 05 аллеля НЬА-Э0В1* и 16 аллеля НЬА^ИВ 1 *, характерно снижение функции клеточного звена иммунитета. Показательным является возрастание количества СD25+ (рецепторов к 1Ь-2), что является компенсаторным механизмом иммуногенеза в условиях снижения количества Т-лимфоцитов.
У всех больных туберкулезом органов дыхания отмечено повышение титра противотуберкулезных антител. Это указывает на гиперфункцию гуморального звена иммунитета, особенно у больных 3 -ей группы, который, по данным многих авторов, при туберкулезной инфекции не играет защитной роли. У пациентов 1-й группы определяли более низкие концентрации антител.
Таким образом, наиболее выраженные изменения иммунного статуса отмечены у пациентов с неблагоприятным течением заболевания носителей 05 аллеля HLA-DQB1* и 16 HLA-DRB1* (3-я группа), что проявлялось в подавлении функции клеточного звена иммунитета. Этой же группе больных свойственна активация гуморального звена иммунитета. Полученные данные позволили высказать предположение о возможности включения в комплексный режим терапии иммунокорректора препарата Ронколейкина®.
Применение Ронколейкина® на фоне специфической полихимиотерапии у ранее прогрессирующих больных способствовало улучшению клинической эффективности терапии (в 83,3 % случаев — конверсии мазка мокроты или снижению интенсивности бактериовыделения, в 91,7 % наблюдений — уменьшению инфильтративных и очаговых изменений в легочной ткани) с параллельным улучшением показателей клеточного звена иммунитета.
Литература
1. Апт А. С. Генетические аспекты выявления групп риска по туберкулезу // Пробл. туберк. 2001. № 7. С. 65-68.
2. Еремеев В. В., Майоров К. Б. Взаимодействие макрофаг — микобактерия в процессе реакции микроорганизма на туберкулезную инфекцию // Там же. 2002. № 3. С. 54-57.
3. Новицкий В. В., Стрелис А. К., Уразов О. И. и др. Особенности функциональной активности лимфоцитов крови у больных туберкулезом легких // Иммунология. 2006. № 2. С. 76-79.
4. Кондакова М. Н., Павлова М. В., Скворцова Л. А. Аллельный полиморфизм гена HLA-DRB1* у подростков и его роль в выборе режима химиотерапии туберкулеза органов дыхания // Актуальные вопросы выявления, диагностики и лечения внелегочного туберкулеза: Научн. труды Всерос. научно-практ. конф. СПб., 2006. С. 274-277.
5. Кондакова М. Н. Клинико-генетические особенности патогенеза туберкулеза органов дыхания у подростков: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. СПб., 2006. 37 с.
6. Маянский Н. А.,Маянский А. Н. Номенклатура и функции главного комплекса гистосовместимости человека // Иммунология. 2006. № 1. С. 43-46.
7. DubaniewiczA.,LewkoB.,Moszkowska G. e. a. Molecular subtypes of the HLA-DR antigens in pulmonary tuberculosis // Int. J. Infec. Dis. 2000. Vol. 4. N 3. P. 129-133.
8. Математические методы в изучении генетики мультифакториальных заболеваний: Учебно-методич. пособие // Под ред. В. Н. Шабалина. М., 1994.
Статья принята к печати 18 февраля 2009 г.
