CC BY
53
Известия Тульского государственного университета
Естественные науки 2008. Выпуск 2. С. 200-207
ХИМИЯ
V. IК 543.07:579.22+543.9
М.Г. Зайцев, В.А. Алферов, Т.А. Кузнецова, Т.В. Рогова,
A.A. Горячева, К.А. Понаморев, А.Н. Решетилов
Тульский государственный университет,
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, г. Пущино
ХАРАКТЕРИСТИКА БИОКАТАЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ДРОЖЖЕВЫХ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗ КАК ОСНОВЫ РЕЦЕПТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
СОДЕРЖАНИЯ СПИРТОВ*
Аннотация. Определена удельная активность четырех ферментных препаратов алкогольоксидаз. Получены аналитические и метрологические характеристики биосенсора с бирецепторными элементами на основе иммобилизованной алкогольоксидазы. Оценена чувствительность биорецепторов на основе АО, выделенной в лаборатории и коммерчески доступных препаратов.
Введение. Для большого числа отраслей народного хозяйства остается актуальной задача по экспресс - определению содержания спирта, как в конечных продуктах, так и на промежуточных стадиях производства. Так количественный анализ спиртовых компонентов необходим при производстве и хранении вин, пива, алкогольных и безалкогольных напитков, соков; контроля ферментационных процессов при использовании метилового и этилового спиртов в качестве ростовых субстратов; при промышленном получении этилового спирта для оперативного контроля содержания продукта в ферментационной среде. [1, 2]. Для определения микроколичеств алифатических спиртов применяют в основном методы газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Реже используют методы спек-трофотометрии, рефрактометрии и плоскостной хроматографии. Однако, несмотря на низкие пределы обнаружения спиртов, общими недостатками
* Работа была выполнена при поддержке гранта РНП 2.1.1.7789.
этих методов являются сложность применяемого оборудования, в некоторых случаях - пробоподготовки, а также длительность анализа. В настоящее время перспективными являются методы аналитической биотехнологии с применением биосенсоров на основе ферментов и целых клеток микроорганизмов [3]. Для определения спиртов перспективным является применение ферментных сенсоров, которые сочетают высокую чувствительность и селективность с простотой аппаратурного и методического оформления, экс-прессностью и экономичностью. Ферментные биосенсоры для оценки содержания низкомолекуряных спиртов (метанола, этанола) могут быть основаны на алкогольоксидазе (АО) [4]. Основным источником алкогольоксидазы являются метилотрофные дрожжи, которые благодаря наличию уникально сильного промотора алкогольоксидазного гена (pAOXl), с разных точек зрения являются выгодным организмом - хозяином для гетеролитической экспрессии промышленно важных белков и ферментов, в том числе и аналитического предназначения [5].
В обзоре [6] суммированы последние достижения в области создания электрохимических биосенсоров на основе АО и показаны возможности их применения. Среди всех AO-основанных сенсоров наибольшее развития получили системы, в которых определение проводиться по изменению содержания кислорода в приэлектродном пространстве или по образованию пероксида водорода. При разработке АО-биосенсоров необходимо уделять особое внимание потребительским свойствам биорецепторного элемента сенсора, которые зависят как от свойств ферментного препарата АО, так и от способа иммобилизации биокатализатора [7].
Для создания надёжных устройств данного типа в работе были проведены исследования, связанные со сравнительным изучением свойств иммобилизованных препаратов алкогольоксидаз метилотрофных дрожжей родов Candida, Pichia, Hansenula по отношению к метанолу.
Материалы и методы.
Ферментные препараты
В работе изучали свойства рецепторных элементов биосенсоров из четырех ферментных препаратов алкогольоксидаз. Три препарата были коммерчески доступны (Сигма, Германия): АО из Candida boidiini; АО из Hansenula sp.: АО из Pichia pastoris. Один из биопреаратов был выделен в работе из дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 945 In по модифицированной методике [8]. Удельную активность ферментных препаратов определяли на UV-103 спектрофотометре (Аквилон, Россия) в кинетическом режиме (длина волны 450 нм, длительность измерения 1000 с). Состав рабочего раствора (100 мл фосфатного буфера pH 7.2, Диа-М, Россия): 3 мг пероксидазы из хрена (500 Е/мл, Сигма, Германия), 50 мг АБТС. Состав реакционной смеси: 1 мл рабочего раствора, 0,005 мл исследуемого раствора фермента,
0,015 мл раствора метанола в различных концентрациях (для определения удельной активности - ЮМ). За единицу активности (Е) принимали количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль Н2О2 из метанола, что соответствует 1 мкм окисленного 2, 2’-азино-бис(3-этилбензтиазолино-6-сульфоновая кислота) (АБТС) (Алдрич, Германия) за одну мин при 21°С (s АБТС 42 мМ-1см-1). Содержание белка определяют по методу Бредфорда. Чистоту ферментных препаратов определяли методом нативного элетрофо-реза в полиакриламидном геле (ПААГ) [8].
Иммобилизация дрожжевых алкогольоксидаз
Иммобилизацию алкогольоксидаз осуществляли на нитроцеллюлозную мембрану Synpor (Алдрич, Германия) по методике [9].
Биоэлектрохимические измерения
Все измерения проводились на биосенсорной установке проточно-инжек-ционного типа “Биолан-ЮЮ” (Кронас, Россия), интегрированной с персональным компьютером со специальным программным обеспечением, которое позволяет управлять режимами работы, регистрировать, обрабатывать и хранить данные. В качестве датчиков применялись кислородные электроды (Кронас, Россия), на поверхность которых помещали рецепторные элементы с иммобилизованной алкогольоксидазой.
Результаты и обсуждение
Сравнительная характеристика ферментных препаратов дрожжевых
алкогольоксидаз.
Алкогольоксидаза выделена в высокоочищенном виде из нескольких видов метилотрофных дрожжей. Для сравнения чистоты всех ферментных препаратов был проведен нативный электрофорез в ПААГ. Согласно результатам электрофоретического анализа чистота всех препаратов соответствует категории “гомогенный”. Важно отметить, что при увеличении мощность и температуры геля наблюдается частичная денатурация ферментного препарата алкогольоксидазы из Candida boidiini, что проявляется на электрофореграмме в виде размытого пятна. Таким образом, коммерчески доступные алкогольоксидазы из дрожжей Hansenula sp. и Pichia pastoris и выделенная алкогольоксидаза из дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 945/гг являются термостабильными ферментными препаратами, что может иметь большое значение при приготовлении стабильных биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов.
Удельные активности алкогольоксидаз имеют следующие значения: АО из Candida boidiini - 13 Е; АО из Hansenula sp. -22 Е; АО из Pichia pastoris
- 28 Е; препарат АО из Hansenula polymorpha NCYC 945b, - 50 Е. Полученные значения удельных активностей алкогольоксидазных препаратов согласуются с литературными данными. Известно, что удельная активность алкогольоксидаз может изменяется в широких интервалах - от 5 до 30 и
даже 50 Е - в зависимости от вида дрожжей и схемы очистки [10]. В обычных препаратах фермента с активной окисленной формой обнаружена стабильная “красная” семихиноновая форма АО - до 60%, которая не восстанавливается ни метанолом, ни сульфитом или дитионитом натрия. Кроме того, содержание так называемой некомпетентной ФАД-содержащей формы АО может достигать 30-40%, также не способной восстанавливаться в присутствии метанола. Вероятно, саморегенерацию этих неактивных форм АО можно объяснить значительным разбросом значений удельной активности у хроматографически чистых препаратов фермента. Следует отметить, что алкогольоксидаза, выделенная авторами данной работы имеет самое высокое значение удельной активности, что свидетельствует о перспективе применения этого препарата для получения чувствительных рецепторных элементов биосенсора.
Биорецепторные элементы на основе иммобилизованной
алкоголъоксидазы.
При иммобилизации алкогольоксидазы с помощью бензохинона и ДЭАЭ-декстрана связывание белковых молекул происходит за счет многочисленных электростатических взаимодействий с мембраной, модифицированной бензохином и ДЭАЭ-декстраном, это приводит к тому, что дезактивации фермента не происходит. Такой метод использовали в работе для изготовления рецепторных элементов биосенсоров на основе всех типов АО. Для сравнительной характеристики иммобилизованных биопрепаратов алкогольок-сидаз были исследованы аналитические и метрологические характеристики биосенсора проточно-инжекционного типа на основе кислородного электрода с бирецепторными элементами.
Типичные виды ответа биосенсора представлены на рис. 1.
Для выявления долговременной стабильности приготовленных биорецепторов проводили последовательные измерения содержания метанола в пробе в течение длительного промежутка времени. В периоды между измерениями биорецепторные элементы хранили при температуре +4 °С в фосфатном буфере pH 7.5. Наибольшие ответы биосенсора наблюдали при использовании рецепторного элемента на основе АО, полученной авторами работы. Снижение активности в два раза происходило на 20 день хранения всех биорецепторов кроме биорецептора на основе АО из Candida boidinii, который полностью потерял активность на б сутки эксплуатации. Таким образом, биорецепторы на основе выделенной в лаборатории АО не уступают по стабильности во времени другим иммобилизованным биокатализаторам на основе коммерческих АО.
Рис.1. Типичные виды ответа сенсора проточно-инжекционного типа с биорецептором на основе АО из Напзетйа ро1утогрка ]\ГСУС 945/п на метанол (концентрация: 1 -0,05мМ; желтая - 0,1мМ; 2 - 0,25мМ; 3- 0,5мМ; 4 - 1мМ; 5 - 2мМ; 6 - 5мМ)
Для определения аналитических и метрологических характеристик биосенсоров на основе рецепторных элементов были построены графические зависимости ответов сенсора от содержания метанола (рис. 2).
Полученные зависимости были апроксимированы уравнениями гиперболы с двумя парамерами типа основополагающего уравнения ферментатвной кинетики Михаэлиса-Ментен:
£> _ -ЙтаХ ‘ [С^]
"" [С]+КМ'
где 11таж — максимальный ответ биосенсора, [С] — исходная концентрация метанола, Км — эффективная константа Михаэлиса.
Рис. 2. Градуировочные зависимости биосенсоров для определения
концентрации метанола
В таблице приведены значения кинетических параметров уравнений градуировочных зависимостей биосенсоров. Известно, что АО из разных видов
Параметры уравнений градуировочных зависимостей биосенсоров.
Параметр биосенсора Биосенсор с рецепторным элементом на основе
АО из Я. роІутогрНа АГСУС 945 1п АО из Напвепиіа вр. АО из Сапсіісіа Ьоісііпіі АО из РісНіа равіогів
-^таж 5 нА/С 5,5±0,5 7±1 0,71±0,03 2,1±0,1
^м,мМ 3,7±0,7 11±2 4,2±0,4 5,6±0,6
Коэффициент чувствительности, нА/с*мМ 0,96±0,05 0,52±0,02 0,10±0,01 0,25±0,01
Минимальный предел обнаружения, мМ 0,014±0,002 0,027±0,001 0,14±0,02 0,055±0,003
дрожжей имеют похожую первичную структуру и близкие спектры кругового дихроизма, что свидетельствует о схожести вторичной структуры белков. Кинетические свойства ферментов разного происхождения также похожи, хотя прослеживается некоторое различие в параметрах, в частности в Км. Константы Михаэлиса на метанол, которые в условиях гомогенного ферментативного катализа составляют величины: для АО изHansenula polymorpha Км 2.15мМ. для АО из C.boidinii Км=ЗмМ, для АО из Pichia pastoris Км=3,1мМ [10]. Полученные в ходе эксперимента значения Км для иммобилизованных ферментов несколько выше приведенных в литературе данных, но увеличиваются, как и в условиях гомогенного катализа.
Для оценки чувствительности биорецепторов на основе АО, выделенной в лаборатории и коммерчески доступных препаратов были выделены линейные участки градуировочных зависимостей ответа сенсора от концентрации метанола и охарактеризована чувствительность биосенсоров (табл.).
Наибольшей чувствительностью к метанолу обладает биорецептор на основе АО из Hansenula polymorpha NCYC 945 In. Если принять чувствительность этого биорецептора за 100%, то чувствительность биорецептора на основе коммерческих препаратов АО составляет: 50%-для АО шНапзепи1а sp; 26% - для АО из Pichia pastoris; 10% - для АО из Candida boidinii.
Выводы. Определена удельная активность ферментных препаратов ал-когольоксидаз. Удельные активности алкогольоксидаз имеют следующие значения: АО из Candida boidiini - 13 Е; АО из Hansenula sp. -22 Е; АО из Pichia pastoris - 28 Е; препарат АО из Hansenula polymorpha NCYC 945b,
- 50 Е. Полученные значения удельных активностей алкогольоксидазных препаратов согласуются с литературными данными. Алкогольоксидаза, выделенная авторами данной работы имеет самое высокое значение удельной активности, что свидетельствует о перспективе применения этого препарата для получения чувствительных рецепторных элементов биосенсора.
Получены аналитические и метрологические характеристики биосенсора с бирецепторными элементами на основе иммобилизованной алкогольокси-дазы. Биорецепторы на основе выделенной в лаборатории АО не уступают по стабильности во времени другим иммобилизованным биокатализаторам на основе коммерческих АО. Оценена чувствительность биорецепторов на основе АО, выделенной в лаборатории и коммерчески доступных препаратов. Наибольшей чувствительностью к метанолу обладает биорецептор на основе АО из Hansenula polymorpha NCYC 945 In.
Библиографический список
1. Китова А.Е. Перспективы применения биосенсорных экспресс-анализаторов при производстве спирта / А.Е. Китова [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. -2004. -Т. 4. -С.11-13.
2. Решетилов А.Н. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для экологического мониторинга и контроля биотехнических процессов / А.Н.Решетилов // Прикладная биохимия и микробиология. -2005. -Т. 41. -№ 5. -С. 504-513
3. Мизгунова У. М. Ферментативные методы определения алифатических спиртов // У. М. Мизгунова, Т. Н. Шеховцова, И. Ф. Долманова // Журнал аналитической химии. - 1998. - Т. 53. -№ 10. -С. 1014-1029.
4. Сибирпый В.А. Современные методы анализа формальдегида, метанола и этанола / В.А. Сибирный [и др.] // Микробиологический журнал. -2005. -Т. 67. -№ 4. -С. 85-110.
5. Rosenfeld S. Use of Pichia pastoris for expression of recombinant protein / Found. Eds. S.P.Colowick, N.O.Kaplan // Methods Enzymol. San Diego, London. Acad.Press. - 1999. -V.306. -P.154-169
6. Azevedo A.M. Ethanol biosensors based on alcohol oxidase / A.M. Azevedo, D.M. Praz-eres , J.M. Cabral, L.P. Fonseca // Biosens Bioelectron. -2005. -V. 21. -№ 2. -C. 235-247.
7. Yildiz H.B. Biosensing approach for alcohol determination using immobilized alcohol oxidase / H. B. Yildiz, L. Toppare // Biosens Bioelectron. -2006. -Jun 15. -V. 21. -№ 12. -C.2306-2610.
8. Ashin V. V. Alcohol oxidase of the methylotrophic yeasts: new findings/ V. V. Ashin, Y. A. Trotsenko // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. -2000. -V.10. -№ 1-3. -C. 295 - 303
9. Заявка на патент. Способ иммобилизации белков. В.В. Ашин, Н.П. Ашина, А.Е. Китова, А.Н. Решетилова. Регистрационный № 20077144733 от 15.12.2007
10. Pavlishko Н. Alcohol oxidase and its bioanalytical application / H.Pavlishko, H. Gayda, M.Gonchar // Vysnyk of L’viv Univ. Biology series. -2004. -№ 35. -P. 3-22.
Поступило 20.06.2008
