CC BY
145
Известия Тульского государственного университета Естественные пауки. 2009. Вып. 1. С. 158-165
Химия
У 1;\ 543.07:579.22 • 543.9
Сравнительная характеристика биосенсоров проточно-инжекционного и кюветного типа на основе алкогольоксидазы для экспресс-определения содержания спирта
О.Н. Понаморева. М.Г. Зайцев. Т.А. Кузнецова.
A.A. Горячева. В.А. Алферов
Аннотация. Представлены результаты исследований по созданию биосенсоров амперометрического типа для экспресс-определения содержания спирта на основе алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 945 1п. Проведено сравнительное определение аналитических и метрологических параметров АО-биосенсоров при проведении анализа в двух разных формата, что является важным для выяснения потребительских качеств таких приборов. Минимальный предел обнаружения спирта с помощью обоих типов биосенсоров составляет 0,014-0,015 мМ.
Ключевые слова: биосенсоры, экспресс-определение спиртов, ал-когольоксидаза.
Введение
Во многих областях жизнедеятельности актуальной является задача высокочувствительного, селективного, оперативного контроля содержания спиртов, в первую очередь этилового и метилового. В последние годы все более пристальное внимание привлекается к разработке экспрессных методов анализа, характеризующихся высокой доступностью, и вместе с тем обладающих достаточными уровнями чувствительности и избирательности. Особенный интерес вызывает возможность миниатюризации подобных аналитических устройств. Наиболее яркими представителями аналитических систем, сочетающих в себе перечисленные качества, являются биосенсоры. В биосепсо-рах для количественного определения спиртов наиболее часто используют
Работа выполнена при поддержке ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России» (Г/К № 02.512.11.2268)
фермент алкогольоксидазу (АО) (КФ 1.1.3.13) в сочетании с электрохимическими преобразователями. Основным источником этого фермента являются метилотрофпые дрожжи [1]. Авторы [2] представили обзор по современному состоянию проблемы определения этанола с помотцыо таких биосепсорпых систем. Среди всех алкогольоксидазпых сенсоров па этанол наибольшее развитие получили системы, в которых определение проводится по изменению содержания кислорода в приэлектродпом пространстве или по образованию пероксида водорода. Рассмотрены различные типы и конструкции электродов: мембранные электроды, уголыто-пастовые, электроды, полученные методом трафаретной печати и мопослоев. Следует отметить, что в последние годы разработке и применению биосепсоров па основе алкогольоксидазы посвящено значительное число публикаций, что, безусловно, свидетельствует об актуальности данного направления биоапалитической химии [3-6]. Таким образом, необходимость выполнения самостоятельных исследований обусловлена соображениями экономической и технологической безопасности страны.
Широкому практическому использованию биосепсоров для количественного определения спиртов в различных областях деятельности человека предшествует стадия фундаментальных и прикладных исследований, направленная па выявление параметров, влияющих па потребительские свойства биосепсоров различных конструкций. В данной работе проведено сравнительное определение аналитических и метрологических характеристик проточпо-ипжекциоппого и кюветпого типа спиртовых биосепсоров па основе кислородного электрода типа Кларка и иммобилизованной АО, выделенной из метилотрофпых дрожжей Напветйа ро1утогрка.
Материалы и методы
Биологический компонент биосенсорных систем. АО была выделена из дрожжей Напветйа рокутогрка ]МСУС 945 1п по модифицированной методике [7]. Чистоту ферментного препарата определяли методом нативного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) по методике, описанной ранее [7]. Иммобилизацию алкогольоксидаз осуществляли па питроцеллюлоз-ную мембрану Бупрог (Алдрич, Германия) в соответствии с методикой [8]. Биорецепторпые элементы формировали в виде плоских мембран размером 3x3 мм.
Биосенсорные измерения. Кюветный способ регистрации сигнала. Измерения проводили с помощью гальвапопотепциостата 1РС2Ь («Кропас», Россия), интегрированного с персональным компьютером, и специализированного программного обеспечения 1РС-гшсго («Кропас», Россия) для регистрации и обработки сигналов сенсоров. Средняя величина тока, соответствующая содержанию кислорода в дистиллированной воде 9,2мг/дм3, составляла 30 нА при шуме ± 0,25 пА. Измерительную ячейку заполняли 4 мл фосфатного буфера рН=7,6, концентрация солей составляла 30 мМ. Перемешивание производили магнитной мешалкой с частотой 200 об/мин.
Измеряемым параметром являлась максимальная скорость изменения сигнала биосепсора, вызванная добавлением субстрата.
I¡роточно-инжекционный способ регистрации сигнала. Макет биосепсора проточпо-ипжекциоппого типа для определения содержания спиртов в водных средах был разработан па базе анализатора растворенного кислорода «Биолап», созданного при участии авторов статьи в рамках программы РАН и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в паучпо-техпиче-ской сфере. Объём пробы составлял 0,05 мл, скорость протока равнялась 0,6 мл/мин. Общее время анализа было равно 300 с, которому предшествовала фаза введения системы в режим измерения (100 с). Измерение завершалось фазой промывки (100 с). В работы использовали патрий-калиевый фосфатный буфер рН=7,6 с концентрацией солей 30 мМ. Измеряемым параметром (ответом биосепсора) являлась максимальная скорость изменения сигнала. Обработка результатов проводилась с помотцыо встроенной программы «Вю1ап 1010».
Результаты и обсуждение
Принцип работы биосепсора па основе кислородного электрода основан па том, что АО, иммобилизованная па поверхности кислородного электрода, катализирует реакцию окисления спирта:
И-СНз-ОН | 02 = 11-СНО I н2о2.
При этом в приэлектродпом пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода и выводится па монитор. В случае кюветпого способа регистрации проба добавляется непосредственно в измерительную ячейку — емкость с буферным раствором, в которую погружен измерительный электрод. В проточпо-ипжекциоппой системе био-сепсорпый элемент встроен в капал, по которому постоянно прокачивается буферный раствор. Проба впрыскивается в поток буфера и через определенное время поступает па фиксированный период в зону измерительного электрода, где АО катализирует окисление спирта, содержащегося в пробе.
Ранее было показано, что биорецептор па основе АО, выделенной авторами из метштотрофпых дрожжей Натетйа ро1утогрка МСУС 945 1п, не уступает, а по некоторым параметрам превосходит коммерчески доступные препараты па основе АО, что свидетельствует о перспективности применения этого биокатализатора при разработке биосепсоров па спирты [9]. При разработке биосепсоров важно учитывать потребительские качества приборов. Так, проточпо-ипжекциоппые системы являются автоматизированными системами и не требуют постоянного участия оператора в проведении нескольких последовательных анализов (рис. 1).
С другой стороны, усложнение аппаратурного оформления метода не всегда желательно. Во многих случаях потребители предпочитают использовать более простые и недорогие системы кюветпого типа (рис. 2).
а
Рис. 1. Биосенсор проточно-инжекционного типа: а — внешний вид биосен-сорного анализатора; б — схема работы биосенсора проточно-инжекционного
типа
а
Рис. 2. Биосенсор кюветного типа: а — внешний вид биосенсорного анализатора; б — схема работы биосенсора кюветного типа
Таким образом, сравнительное определение аналитических и метрологических параметров биосенсоров при проведении анализа в двух разных форматах является важным для выяснения потребительских качеств этих приборов.
Важной характеристикой анализа является его селективность. В случае биосенсорного анализа селективность определяется субстратной специфичностью фермента, способом иммобилизации биоматериала, форматом проведения анализа и др. Для оценки селективности определения низкомолекулярных спиртов была исследована специфичность биосенсорных систем кюветного и проточного типа (рис. 3).
При проведении анализа в проточно-инжекционном формате селективность биосенсорного определения повышается, о чем можно судить по соотношению величин ответов сенсора на спирты различного строения. Вероятно,
120
£ 100
1Т1
а
метанол этанол 1-пропанол 1-бутанол 2-пропанол 2-бутанол
Рис. 3. Специфичность биосенсоров на основе иммобилизованной АО и кислородного электрода: черный — кюветный тип биосенсора; серый — проточ-но-инжекционный тип биосенсора
что при снижении времени контакта биорецепторного элемента с пробой в проточной системе транспорт субстрата к активным центрам иммобилизованного фермента становится одним из определяющих факторов и вносит вклад в величину ответа биосенсора. В то же время, необходимо отметить, что селективное определение метанола или этанола с помощью алкогольок-сидазных сенсоров невозможно при их совместном присутствии.
Градуировочные зависимости биосенсоров кюветного и проточно-инжек-ционного типа имеют гиперболический вид в широком диапазоне концентраций (0,015 10 мМ), их аппроксимацию проводили с помощью уравнения типа Михаэлиса-Ментен, описывающего экспериментальную зависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Для снижения ошибок анализа предпочтительно использовать линейные участки градуировочных зависимостей. Полученные аналитические и метрологические характеристики, а также параметры градуировочных зависимостей биосенсоров приведены в табл. 1.
Нижний предел обнаружения одинаков для обоих форматов анализа, однако, коэффициент чувствительности и линейный интервал определяемых концентраций больше при проведении проточно-инжекционного анализа. Операционную стабильность биосенсоров оценивали по сходимости 15 последовательных измерений стандартного раствора метанола. Сходимость результатов была выше при кюветном режиме измерений, что свидетельствует о более стабильной работе такой системы.
Таблица 1. Аналитические и метрологические характеристики биосенсоров на основе дрожжевой АО и кислородного электрода
Характеристика, биосенсора. Способ пода.чи пробы
проточно- ижекционный кюветный
Минимальный предел обнаружения, мМ 0,014 ± 0,002 0,015 ±0,003
Верхняя граница, линейного диапазона, определяемых концентраций, мМ 3,7 ± 0,7 0,25 ± 0,01
Коэффициент чувствительности, нА/с • мМ 0,96 ± 0,05 0,77 ± 0,02
Время отклика., концентрация субстрата, равна. 1 мМ, с 85-95 130-150
Период измерения, с 200 340
Повторяемость, отклонение от среднего значения за. 15 измерений, % 6 4,5
Временные затраты метода, то есть показатель его экспресспости, определяются в первую очередь длительностью единичного измерения. Для био-сепсорпого анализа этот параметр складывается в основном из времени развития ответа и времени восстановления активности рецепторного элемента. Развитие ответа в проточпо-ипжекциоппой системе составляет 85-95 с в зависимости от концентрации субстрата; время восстановления активности рецепторного элемента после измерения составляет около 110 с. На развитие ответа в юоветной системе измерения требуется 130-150 с в зависимости от концентрации субстрата; время восстановления активности рецепторного элемента после измерения составляет около 200 с. Время единичного анализа при кюветпом режиме больше, чем при проточно-ипжекционпом, по полный цикл измерения не превышает 6 минут.
Важно отметить, что разработанные биосепсорпые анализаторы по аналитическим и метрологическим характеристикам не уступают зарубежным аналогам. Каждый тип биосепсоров обладает определенными преимуществами в эксплуатации. Полученные результаты показывают возможность применения действующих макетов биосепсоров как прототипов опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.
Список литературы
1. Metabolically engineered methylotrophic yea.st cells and enzymes as sensor biorecong-nition elements/ M.Gonchar [et. a.i.] // FEMS Yeast Research. 2002. V. 2. P. 307-314.
2. Ethanol biosensors based on alcohol oxidase / A.M. Azevedo [et. a.i.] // Biosens. Bioelectron. 2005. V. 21, N 2. P. 235-283.
3. Enzymatic microrea.ctors for the determination of etha.nol by a.n automatic sequential injection analysis system / E.M. Alha.deff [et. a.i.] // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. V. 150, N 1. P. 115-121.
4. Integrated biosensor systems for ethanol analysis / E.M. Alha.deff [et. a.i.] // Appl. Biochem. Biotechnol. 2008. V. 146, N 1-3. P. 129-165.
5. Application of a. biosensor for monitoring of etha.nol / G. Wen [et. a.i.] // Biosens. Bioelectron. 2007. V. 23, N 1. P. 121-130.
6. Isolation and characterization of mutated alcohol oxidases from the yea.st Ha.nsenula. polymorpha. with decreased affinity toward substrates and their use a.s selective elements of a.n a.mperometric biosensor / K.V. Dmytruk let. a.i.I /7 BMC Biotechnol. 2007. V. 7. P.33.
7. A shin V.V., Trotsenko Y.A. Alcohol oxida.se of the methylotrophic yea.sts: new findings // .1. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2000. V. 10, № 1-3. P. 295 — 303.
8. Заявка, на. патент. Способ иммобилизации белков. А шин В.В., Ашина Н.П., Китова А.Е., Решетилов А.Н. Регистрационный №20077144733 от 15.12.2007.
9. Характеристика, биокатализа.торов на. основе иммобилизованных дрожжевых ал-когольоксидаз как основы рецепторных элементов биосенсоров для определения содержания спиртов / М.Г. Зайцев [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Естественные науки. 2008. Вып. 2. С.200-207.
Поступило 21.12.2008
Понаморева Ольга Николаевна (olga@tsu.tula.ru), к.хлт., доцент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Зайцев Максим Геннадьевич, аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Кузнецова Татьяна Александровна, аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Горячева Анастасия Анатольевна (goryachevanastya@rambler.ru), к.хлт., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Алферов Валерий Анатольевич (chern@tsu.tula.ru), к.хлт., профессор, зав.кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Comparative characteristic of flow injection and cuvette biosensors on basis of alcohol oxidase for the rapid determination of alcohols
O.N. Ponamoreva, M.G. Zaycev, T.A. Kuznetsova, A.A. Goryacheva,
V.A. Alferov
Abstract. In this paper we present the findings of amperometric biosensors creation on basis of alcohol oxidase from methylotrophic yeast Hansenula polymorpha NCYC 945 In for the rapid determination of alcohols. We carried out comparative
detection of analytical and metrological objectives of the AO-biosensors on application two different form of the analysis, that is the important factor for consumer properties identification of such devices. The minimal detection limit of alcohol is 0,014-0,015 ruM using the both types of biosensors.
Keywords: biosensors, rapid determination of alcohols, alcohol oxidase.
Ponarnoreva Olga (olga@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.
Zaycev Maxim, postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Kuznetsova Tatiana, postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Goryacheva Anastasia (goryachevanast,ya@rambler.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.
Alferov Valery (chem@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.
