CC BY
1128
Известия Тульского государственного университета Естественные пауки. 2009. Вып. 1. С. 138-157
Химия ^
УДК 543.9 • 57.087 • 579.6
Биосенсоры и биотопливные элементы на основе целых клеток микроорганизмов и выделенных из них ферментов. Обзор
О.Н. Понаморева
Аннотация. В обзоре представлены результаты фундаментальных и прикладных исследований, проводимых на базе на.учно-образо-ва.тельного центра «Экобиотехнология» (Тульский государственный университет и Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН), по изучению процессов биоэлектрокатализа в системах «субстрал’-ба.ктерия-электрод» для дальнейшего использования в биосенсора.х и биотопливных элементах и по созданию биосенсоров для контроля биотехнологических процессов и экологического мониторинга.
Ключевые слова: биосенсоры, экологический мониторинг, мониторинг биотехнологических процессов, биоэлектрока.тализ, биотопливные элементы (БТЭ).
Введение
Биосепсоры — биоапалитические устройства, позволяющие использовать высокочувствительные «интеллектуальные» методы измерения содержания химических соединений или биологических эффектов в образцах. Согласно определению Международного союза по чистой и прикладной химии, биосенсор — это интегральная система, которая способна воспринимать и преобразовывать специфичную количественную или полуколичествеппую аналитическую информацию с использованием биологического распознающего элемента, находящегося в тесном контакте с преобразователем.
Целые клетки микроорганизмов, как биокомпопепт, наиболее часто используются в биосепсорах предназначенных для экологического мониторинга, так как микроорганизмы — это живые датчики, реакция которых зависит от взаимодействия целой группы факторов, отражая множество топких и важных изменений в окружающей среде [1, 2]. Микроорганизмы, как биокомпопепт в биосепсорах каталитического типа, имеют ряд преимуществ перед
Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 09-03-97528-р_центр_а. №08-04-99019-р_офи).
индивидуальными ферментами. Они способны окислять широкий спектр химических соединений, в том числе ксенобиотиков, адаптироваться к неблагоприятным условиям, в иммобилизованном состоянии сохранять окислительный потенциал в течение длительного времени. Немаловажным фактором для потребительского спроса является доступность и низкая стоимость микроорганизмов по сравнению с выделенными из них ферментами. Более чем 90% ферментов, известных до настоящего времени, имеют внутриклеточную локализацию, поэтому использование целых клеток является лучшей альтернативой очищенным ферментам. Это позволяет не только избегать трудоемких и дорогостоящих операций по выделению ферментов, по и сохранять их в естественном окружении [3]. Микроорганизмы являются катализаторами широкого спектра реакций, так как содержат множество ферментов, в том числе ферментные системы, катализирующие последовательные превращения субстратов, что также увеличивает возможности применения биосепсоров для детекции соединений различного строения. Кроме того, бактериальные клетки — электрохимические станции, которые преобразуют энергию химических связей органических соединений в энергию восстановительных потенциалов, что используется при создании биотопливпых элементов и медиаторпых биосепсоров [4].
В коллективе паучпо-образователытого центра «Экобиотехпология» в Тульском государственном университете и Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН разрабатываются биосепсоры па основе амперометрических преобразователей (кислородного датчика и медиаторпых электродов) и иммобилизованных клеток микроорганизмов (бактерий, дрожжей) для экспресс-анализа биотехнологических процессов и оценки степени загрязнения водных ресурсов.
1. Методы иммобилизации микроорганизмов для получения рецепторных элементов биосенсоров
Одной из важнейших задач является разработка рецепторных элементов биосепсоров с заданными свойствами. Для формирования рецепторных элементов биосепсора, характеризующихся максимальной долговременной стабильностью, необходимо выбрать такой способ иммобилизации, при котором организмы будут функционировать длительный период времени, не теряя своей активности. С целью увеличения долговременной стабильности био-рецепторпого элемента нами проведены работы по подбору условий иммобилизации клеток микроорганизмов в различных матрицах. Как известно, при формировании рецепторного элемента биосепсора используют разные методы иммобилизации микроорганизмов — включение в гели, синтетические мембраны, а также адсорбцию, химическое сшивание клеток друг с другом или с носителем с помощью бифункциональных реагентов. Первые три типа иммобилизации наиболее часто применяются в биосепсорах па основе
целых клеток микроорганизмов. Известен ряд недостатков, связанных с использованием гелевых матриц. В частности, к ним относятся трудоемкость изготовления рецепторного элемента, необходимость специального подбора условий иммобилизации для каждого конкретного микроорганизма, снижение пластической прочности гелей после иммобилизации. Однако, несмотря па это, включение клеток в полимерные гели (полиакриламидный, агаровый) и синтетические мембраны, особенно па основе поливинилового спирта (ЛВС), может успешно применяться при формировании рецепторных элементов биосепсоров для определения широкого спектра соединений. Нами были исследованы возможности увеличения стабильности биорецепторпых элементов сенсоров путем иммобилизации микроорганизмов в различные матрицы: путем включения клеток микроорганизмов в агаровый и полиакриламидный (ПААГ) гели, гель па основе поперечно-сшитого бычьего сывороточного альбумина (БСА), гель ПВС и адсорбции па стекловолоконном фильтре Whatman GF./A. В качестве модельных для изучения влияния метода иммобилизации па свойства биорецепторпого элемента были использованы уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius В-1280. Бактерии Gluconobacter oxydans обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся поверхностной локализацией ряда основных окислительных ферментов и высокой оперативностью электроп-трапспорт-пой цепи, что обеспечивает быстрый ответ биосепсора. Следует отметить, что способ иммобилизации является одним из факторов, который влияет па специфичность биорецепторпых элементов. Субстратная специфичность биорецепторов па основе бактерий G. oxydans в матрице ПВС, полученной УФ облучением, криогеле ПВС и в агаровом геле аналогична субстратной специфичности адсорбированных клеток. При иммобилизации G. oxydans в матрицу БСА происходит снижение откликов па: пропанол-1, бутанол-1 и этанол по сравнению с клетками, адсорбированными па стекловолоконном фильтре. При использовании матрицы из полиакриламидного геля наблюдается полное угнетение окислительной активности клеток по отношению к этанолу, пропанолу-1 и бутаполу-1. Известно, что алкоголь- и глюкоз-дегидрогеназы (АДГ и ГДГ) локализованы в цитоплазматической мембране бактерий G. oxydans. Именно эти ферменты отвечают за окисление этанола и глюкозы соответственно. Пространственное строение этих ферментов имеет общие закономерности, по у ГДГ отсутствуют характерные для АДГ дисульфидные связи, образуемые цистеипами, и их место занимает гистидин. Акриламид вызывает S-алкилировапие тиолытых групп в белках и пептидах, что может являться одной из причин ингибирования активности фермента АДГ в клетках G. oxydans при иммобилизации в ПААГ. Самой высокой долговременной стабильностью при сохранении высокой чувствительности характеризовался биорецептор па основе бактерий, включенных в поперечно-сшитый БСА [5J.
В рецепторных элементах целоклеточпых сенсоров применяют не только бактерии, по и дрожжи, которые проявляют большую стабильность и вы-
живаемость в условиях биосеттсорттого анализа. Для создания стабильных рецепторых элементов па основе метилотрофпых дрожжей РШпа апдивЬа ВКМ Н-2518 и Натетйа ро1утогркга МСУС 495 1п использовали иммобилизацию в криогель ЛВС [6]. Биосепсоры с полученными рецепторными элементами использовали для экспресс-определения содержания спиртов. Время стабильной работы биосепсоров составило 30-40 суток. Таким образом, метод иммобилизации целых клеток микроорганизмов в криогель ЛВС может быть рекомендован при разработке микробных сенсоров па основе дрожжевых штаммов.
2. Микробные сенсоры для контроля окружающей среды
Экспресс-оценка загрязнения объектов окружающей среды является необходимым компонентом экологических исследований. Учитывая постоянно растущий перечень загрязняющих веществ, поступающих в окружающую среду, а также ужесточение гигиенических показателей их нормирования, полный химический анализ загрязнения вод, почв, растительности представляет собой очень сложную и дорогостоящую задачу. Поэтому возрастающее внимание уделяется экспресс методам контроля, ориентированным па детектирование опасных уровней загрязнения и оценку совокупного воздействия токсикантов па окружающую среду. Потребность в доступных системах и приборах для экологического контроля инициировала развитие новых технологий и методов, которые способны обеспечить определение различных химических соединений в водных средах в условиях полевого эксперимента, а не только в специализированных лабораториях. Большинство этих методов связано с функционированием биосепсоров. В области экологического мониторинга наиболее перспективными являются биосепсоры па основе целых клеток микроорганизмов. Использование микроорганизмов в рецепторных элементах биосепсоров основано па наличии у них специфических ферментных систем, производящих трансформацию ксенобиотиков, которая может сопровождаться появлением электрохимически активных продуктов, либо поглощением косубстратов реакции. Мировой объем сектора рынка, связанный с применением биосепсоров в экологии составил в 2005 г. 100 млн. долларов [7]. Биосепсоры были включены в качестве перспективных аналитических приборов для эффективного экологического контроля в международные программы по обеспечению мониторинга качества воды [8]. Большинство разработанных биосепсорпых систем — опытные образцы, и для их успешной коммерциализации необходимо провести стандартизацию этих приборов и методик анализа в России. Практическое внедрение таких биосепсорпых устройств позволит расширить сферу экологического мониторинга, снизить риск опасного загрязнения биосферы, в том числе среды обитания человека и обеспечить повсеместное распространение недорогих и удобных в эксплуатации приборов отечественного произ-ВОДСТВс!.
2.1. БПК-биосенсоры. Важнейшей интегральной характеристикой качества воды является биохимическое потребление кислорода (ВПК). Большинство БПК-датчиков основаны па измерении интенсивности бактериального дыхания вблизи преобразователя, обычно электрода типа Кларка. БПК-биосепсорпые системы все еще имеют ряд ограничений, которые затрудняют их применение: недостаток стандартизации и недоработки законодательства в большинстве стран, сложные требования по обслуживанию и недостаточная устойчивость применяемых культур микроорганизмов перед тяжелыми металлами и различными токсичными веществами [9]. При проведении новых исследований основное внимание в совершенствовании параметров БПК-сепсоров направлено па увеличение стабильности, повышение корреляции данных, полученных биосепсорпым и стандартным методами оценки БПК5, поиск новых эффективных микроорганизмов, применение новых припиципов преобразования сигналов [10]. В пашем колективе активно ведутся исследования по созданию БПК-сепсоров для экспресс-анализа различных объектов, в том числе сточных вод пищевых и биотехнологических производств [11, 12]. В качестве протопита опытного образца был создан макет биосепсора проточпо-ипжекциоппого типа для экспресс-определения ВПК в водных средах па базе анализатора растворенного кислорода «Биолап». Прибор «Биолап» создан в рамках программы РАН и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Активизация инновационной деятельности в сфере уникального научного приборостроения»; разработчики: ТулГУ, ИБФМ РАН (г. Пущипо), ООО «Апагтитик-ВНИПИМ» (г. Тула), ЗАО «Кропас» (г. Москва). Использование анализатора проточпо-ипжекциоппого типа позволяет понизить определяемый минимум концентраций компонентов за счет отсутствия разбавления анализируемой пробы буфером и уменьшить время между анализами за счет быстрого удаления остатка субстрата и продуктов его окисления из измерительной кюветы протоком буфера. В рецепторном элементе биосепсора использовали следующие штаммы микроорганизмов: бактерии СНисопоЬас1ег охуйат 8Ь8р. тНивЬгтв В-1280, дрожжи Ргскга апдивЬа ВКМ У-2518 и Агхикь айептмюгат ВГИ (78)-6. Выбор биоматериала для формирования биорецепторпых элементов основывался па спектре утилизируемых субстратов и устойчивости микроорганизмов по отношению к вредным факторам окружающей среды (табл 1).
Разработанные биосепсоры по аналитическим и метрологическим характеристикам не уступают зарубежным аналогам. Вместе с тем единичный анализ ВПК с помощью разработанных моделей биосепсоров требует меньших временных затрат чем анализ ВПК с помощью других известных моделей бисенсорпых анализаторов. Действующий макет биосепсорпого анализатора может служить прототипом опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.
Таблица 1. Характеристики БПК-биосенсоров на основе разных типов микроорганизмов
Рецепторный элемент Относительное стандартное отклонение, % Долговре- менная стабиль- ность, сутки Чувствительность, нА • дм3/ (мин • мг) Длитель- ность одиночно- го измерения, мин Линейный диапазон зависимости ответа биосенсора. от БПК5, мг/дм3
Gluconobacter oxydans sbsp. industrius В-1280 5,9 30 2,25 8-12 0,5-8,8
Arxula adeninovarans ВГИ (78)-6 6,5 <40 1,21 10-14 1,0-15,6
Pichia, angusta BKM Y-2518 6,1 26 0,72 10-14 1,6-16,3
2.2. Микробные сенсоры для тестирования общей токсичности.
Действие ксенобиотиков-токсикантов па микроорганизмы непосредственно связано с потреблением кислорода. В зависимости от типа микроорганизмов может наблюдаться увеличение дыхательной активности в присутствии некоторых органических ксенобиотиков или снижение дыхания за счет ингибирующего действия токсикантов. Особенность информации, получаемой с помощью живых целых клеток микроорганизмов, состоит в интегральном характере восприятия и отражения всех токсических воздействий, обусловленных совокупностью токсикантов и комплексных факторов их совместного присутствия [13J. В настоящее время совместно с сотрудниками сапитарпо-химиче-ской лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии Тульской области» проводятся исследования, направленные па применение комбинации «иммобилизованные микроорганизмы — кислородный электрод типа Кларка» для оценки токсичности товаров народного потребления, чтобы избежать ряда ограничений, свойственных другим методам биотестировапия. В качестве биоматериала для биосепсора использовали микроорганизмы разных типов: бактерии — деструкторы ксенобиотиков рода Pseudomonas, метилотрофпые дрожжи и бактерии рода Н. coli, которые являются стандартными объектами биотестировапия в других методах. Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования микробных сенсоров не только для определения качественных показателей загрязнения объектов окружающей среды, по и для проведения количественной оценки их токсичности. Предлагаемый метод может быть применен в токсиколого-гигиепических исследованиях для оценки токсичности, что позволит ограничить эксперименты па животных и
снизить материальные затраты па проведение исследований по оценке токсикологической опасности химических соединений, продуктов и изделий па их основе, а также различных препаратов [14]. В настоящее время авторы продолжают исследования в этой области и проводят корреляцию данных с традиционными токсикологическими и санитарно-химическими методами с целью разработки метода определения токсичности с помотцыо микробного сенсора.
2.3. Детекция ксенобиотиков и применение биосенсоров в экологической биотехнологии. Способность микроорганизмов к трансформации или деградации ксенобиотиков хорошо известна и является предметом особого внимания исследователей, прежде всего с точки зрения использования микроорганизмов-деструкторов для очистки загрязненной окружающей среды, прежде всего от нефтяных загрязнений. С помощью биосепсоров па основе кислородного электрода был проведен выбор наиболее эффективных бактериальных штаммов — деструкторов углеводородов нефти, ароматических и полиароматических соединений, капролактама и его олигомеров, изучено биохимическое поведение иммобилизованных бактериальных клеток, используемых в рецепторном элементе биосепсоров, исследованы каталитические характеристики ферментных систем катаболизма бактериальных клеток in vivo. Данные по биохимическому поведению иммобилизованных бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas — деструкторов нефти, полученные па основе биосепсорпого определения их дыхательной активности, согласуются с физиологическими характеристиками микроорганизмов, полученными другими методами [15]. Биосепсорпый подход применили для изучения биохимического поведения сочетаний: бактериальный хозяин — плазмида для разных штаммов бактерий рода Pseudomonas и разных плазмид биодеградации капролактама [16] и нафталина. [17] Полученные результаты показывают возможность применения микробных сенсоров для анализа результатов при генетическом конструировании бактерий-деструкторов ксенобиотиков [18]. Данный подход может значительно сократить время отбора наиболее эффективных микроорганизмов-деструкторов токсичных веществ. Таким образом, биосепсоры рассматриваются не только как аналитические приборы нового поколения, по также и как принципиально новая методология, совмещающая идеи и достижения современной биологии, электронных технологий, химических и физических паук и позволяющая глубже проникнуть в изучение проблем живой материи.
Разработанные биосепсорпые системы па основе бактерий — деструкторов ксенобиотиков были использованы для количественного определения содержания нафталина и капролактама. В биосепсорах проточпо-ипжекциоппого и кюветпого форматов анализа для детекции капролактама и линейных олигомеров использовали бактерии P. putida BS394, несущие плазмиду деградации капролактама pBS268. Нижний предел детекции капролактама составлял 0,005 мМ, что позволяет определять концентрации капролактама ниже ПДК.
Использование в качестве основы биорецептора бесплазмидного штамма, не содержащего плазмиду, позволило получить сенсор, не обладающий чувствительностью к капролактаму. Использование дифференциальной схемы измерения образца сенсорами па основе плазмидпого и бесплазмидного штаммов с последующим вычитанием сигналов может позволить, в определенной степени, нивелировать сигналы, обусловленные присутствием мешающих соединений [19].
3. Биосенсоры для мониторинга биотехнологических процессов
Для большого числа отраслей народного хозяйства остается актуальной задача по экспресс-определению содержания спирта и углеводов, как в конечных продуктах, так и па промежуточных стадиях производства.
3.1. Биосенсоры на основе метилотрофных дрожжей и дрожжевых алкогольоксидаз. Для определения спиртов перспективным является применение биосепсоров па основе метилотрофных дрожжей или выделенного их них фермента — дрожжевой алкогольоксидазы (АО). При разработке АО-биосепсоров необходимо уделять особое внимание потребительским свойствам биорецепторпого элемента сенсора, которые зависят как от свойств ферментного препарата АО, так и от способа иммобилизации биокатализатора. Для создания падёжных устройств данного типа нами были проведены исследования, связанные со сравнительным изучением свойств иммобилизованных препаратов целых клеток микроорганизмов метилотрофных дрожжей родов РШпа и Напветйа и выделенных их них алкогольоксидаз. В качестве электрохимического преобразователя в биосепсорах использовали гальвапо-потепциостаты с кислородными электродами, интегрированные с кюветпой и проточпо-ипжекциоппой системами проведения анализа. На основании величины сигнала биосепсора получили следующий ряд каталитической активности различных штаммов метилотрофных дрожжей Р. апдивЬа ВКМ У-2559>Р. апдшйа ВКМ У-2518>Р. апдиаЬа ВКМ ¥-1397 II. ро1утог-рка МСУС 495 1п>Р. теЫшпоИса-ВНИИ генетики. Нижний предел детекции этанола для биосепсора па основе дрожжевых клеток составил 0,05-0,1 мМ. Для выбора штамма, способного обеспечить наибольшую селективность детекции спиртов, была проведена оценка субстратной специфичности тестируемых культур с помощью биосепсора. Было показано, что сенсоры па основе штаммов Р. апдивЬа ВКМ У-2559 и ВКМ У-1397 давали ответ, помимо целевых субстратов (метанола и этанола), па бутапол, пропанол, изопропапол, глюкозу, глицерин. Штамм Р. апдивЬа ВКМ У-1397 также характеризовался чувствительностью к сорбиту и сорбозе. Наиболее узкой субстратной специфичностью в сочетании с высокими абсолютными значениями ответа па этанол обладал штамм Р. апдивЬа ВКМ У-2518. Важно отметить, что селективность микробного сенсора не уступает селективности биосепсора па основе ферментного препарата алкогольоксидазы [20].
Алкогольоксидаза (АО, ЕС 1.1.3.13) является первым ферментом метаболизма метанола у метилотрофпых дрожжей, окисляющих метанол до формальдегида и перекиси водорода молекулярным кислородом. АО обладает широкой субстратной специфичностью. Наибольшее значение скорости катализа АО наблюдается в реакциях с метанолом, естественным субстратом. Нами проводятся исследования по получению высокоэффективных ферментных препаратов АО из метиллотрофпых дрожжей и созданию АО-биосепсоров для экспресс-определения содержания спирта [21, 22]. Биосепсорный метод позволил проследить динамику изменения активности при храпении рецепторного элемента. Выполнена оценка эффективности способа иммобилизации для мембран различного типа (всего исследовано 6 типов мембран). Показано, что наиболее высокие значения сигнала достигаются при использовании мембран типа Protran SUS (фирма Симас). Использованный метод иммобилизации обеспечивает для биорецептора чувствительность (3.04 пА/'с (мМ-1)), нижнюю границу (0.01 мМ) и верхнюю границу детекции (0.4 мМ), время отклика (95 с при измерении низкой концентрации спирта 0.25 мМ), период измерения (480 с), высокую точность (отклонение от среднего значения 1.3% при 14 измерениях), высокую сохранность при храпении (снижение коэффициента чувствительности за 28 суток составило 76%). Полученные значения константы Михаэлиса Км и максимальной скорости Vmax составляли, соответственно, 0.4 мМ 2.4 пА/'с (приведены значения для метанола и иммобилизации с помощью гидрохинона). Показана возможность длительного храпения иммобилизованной алкогольоксидазы (до 5 мес.). Линейный диапазон определяемых концентраций для метанола составляет 0,023 до 6,5 мМ, (ПДК для водоёмов хозяйственного пользования составляет 0,09 мМ) а для этанола — от 0,055 до 7 мМ (в литературе приводятся данные для линейного диапазона от 0,5 до 15 мМ). В качестве иллюстрации возможности практического применения биосепсоров выполнен ряд анализов реальных образцов па содержание спиртов (метилового и этилового). Анализ ферментационных жидкостей, содержащих метиловый спирт, ферментным и микробным сенсором находились в высокой взаимной корреляции (коэффициент корреляции «клетки-фермент» составлял 0.987). Анализ образцов пива, красных вин, водок также характеризовался степенью совпадения с заявленным содержанием алкоголя в напитках. Анализ проб, полученных при ферментационном производстве этилового спирта, показал, что коэффициент корреляции био-сепсорпых измерений с методом газовой хроматографии составляет 0.96 [23J.
Разработанные в результате выполнения проекта методы получения рецепторных элементов биосепсоров, биосепсорпых электродов, содержащих иммобилизованный фермент и иммобилизованные микроорганизмы, их характеристики; созданные лабораторные макеты биосепсорпого анализатора могут быть использовании как перспективные технические и технологические решения при дальнейшей разработке промышленного изделия.
3.2. Применение медиаторных электродов, полученных трафаретной печатью и модифицированных алкогольоксидазой, для определения спиртов. Одним из перспективных направлений развития биосепсорпых технологий является использование медиаторных электродов, полученных методом трафаретной печати (screen-printed электроды). Преимущества рассматриваемой технологии состоит в миниатюрности создаваемых датчиков, их многофункциональности, низкой себестоимости и, следовательно, возможности их одноразового применения. В связи с этим они уже заняли достойное место па рынке.
Нами исследована принципиальная возможность использования алкого-льоксидазы в сочетании с электродами, полученными трафаретной печатью (скрип-припт электроды) и модифицированных берлинской лазурыо. Показана высокая чувствительность метода (возможность измерять концентрацию метанола 0.05 мМ) при формировании электродов путем фиксирования ферментной мембраны па поверхности электрода [24].
3.3. Ферментные и микробные сенсоры на основе кислородного электрода для детекции глюкозы, этанола и крахмала.
содержания глюкозы, этанола и крахмала в реакционной среде при производстве пищевых продуктов, получаемых сбраживанием (производство пива, этилового спирта), позволяет оптимизировать процесс брожения. Такой контроль может быть реализован путем применения биосепсорпых анализаторов, позволяющих проводить измерения в режиме реального времени.
Исследована возможность анализа крахмалсодержащих образцов с помощью ферментного сенсора па основе глюкозооксидазы и микробного сенсора па основе уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans совместно с промышленным амилолитическим ферментным препаратом Алькоголаза II 400 [25, 26]. Так, для анализа образов крахмальной продукции, не содержащих глюкозы, разработан биферментпый сенсор па основе совместно иммобилизованных ферментов глюкозооксидазы и глюкоамилазы [27]. Для проб, содержащих и глюкозу и крахмал, предложена простая схема анализа па основе микробного сенсора и растворимой глюкоамилазы, которая позволяет одновременно регистрировать как исходный уровень глюкозы, так и скорость гидролиза крахмала под действием глюкоамилазы [28]. Диапазон детекции крахмала составлял 0,03 — 0,50 г/л, время единичного анализа составляло 10-15 мин.
3.4. Применение низкоселективных микробных сенсоров для селективного определения содержания веществ в многокомпонентных водных средах.
стратпая специфичность — чувствительность к большому количеству веществ. Зачастую анализируемые вещества находятся в растворе одновременно, что существенно затрудняет определение концентрации целевого вещества. Существует несколько подходов повышения селективности микробных
биосеттсоров. Одним из подходов является математическая обработка экспериментальных данных. Для этого нами были успешно использованы кластерный анализ и искусственные нейронные сети (ИНС). Показана возможность идентификации компонентов смеси, содержащей глюкозу, ксилозу и этанол, с помотцыо сенсоров, основанных па микробных клетках [29]. Измерительная система была представлена тремя микробными сенсорами амперометрического типа с иммобилизованными клетками CUuconobacter oxydans, Hansemda polymorpha и Hscherichia coli. Использованные в ходе выполнения исследования при обработке данных математические методы позволяют получить результат только по принципу «ДА-НЕТ». Для количественного определения концентраций необходимо построение калибровочных поверхностей для всех используемых сенсоров, что существенно усложняет процедуру анализа. Вместе с тем, полученные результаты показали, что применение системы микробных сенсоров позволяет осуществлять идентификацию составляющих смесь веществ. При этом для обработки результатов можно использовать как кластерный анализ, так и искусственные нейронные сети. Это направление получило развитие в работах по определению содержания глюкозы, этанола, метанола и фруктозы при их совместном присутствии с помощью пизкоселек-тивпых микробных сенсоров [30, 31]. Для повышения селективности предложено использовать систему биосеттсоров с различающимися характеристиками. В качестве рецепторных элементов многоканального биосеттсора использовались иммобилизованные различными способами бактериальные клетки CUuconobacter oxydans, а так же дрожжевые микроорганизмы Pichia angusta и Saccharomyces bayanus. Был разработан макет многоканального биосеттсора проточтто-иттжекциоттттого типа для селективного определения компонентов в водных средах. Макет был разработан па базе прибора «Мультибио-01». Разработчиками прибора являются: ТулГУ, ИБФМ РАН (г. Путцитто) и ЗАО «Кроттас» (г. Москва). Прибор «Мультибио-01» имеет возможность анализировать одну пробу четырьмя сенсорными элементами одновременно.
Как показано при анализе смеси глюкоза-метаттол-этаттол использование сетей с выходом, отвечающим за концентрацию одного атталита, показывают хорошие результаты [31]. Особенно эффективен данный подход при использовании ИНС и большим числом входных нейронов. Поэтому обработка данных по четырехкомпопептпой модельной смеси была проведена с использованием нейронных сетей с одним выходом. В работе каждая созданная нейросеть представляет собой персептротт с 4 входными нейронами и 1 выводным. Оптимизированные сети были применены для анализа модельных растворов. Относительные ошибки определения компонентов в модельных растворах лежат в интервале 0-16 %, что позволяет применить разработанную методику для анализа образцов алкогольной продукции и продуктов сбраживания. Таким образом, разработана автоматизированная многоканальная биосетт-сорттая установка, позволяющая проводить селективную оценку содержания глюкозы, фруктозы, метанола и этанола в диапазоне концентраций от 1,00
до 5,00 мМ по каждому из компонентов. Относительные ошибки определения концентраций апалитов с помотцыо ИНС лежат в интервале от 6 до 28 %. Разработанный многоканальный биосепсор может служить прототипом для создания опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.
4. Закономерности функционирования биосенсоров и биотопливных элементов на основе уксуснокислых бактерий в условиях биоэлектрокаталитического окисления субстратов
Значительный прогресс в создании амперометрических биосепсоров стал возможен благодаря использованию в них соединений, способных к переносу электронов от активных центров ферментов па электрод — медиаторов электронного транспорта. Медиаторы способны взаимодействовать не только с выделенными ферментами, по и с ферментами в составе бактерий. Известно, что поверхностная локализация ферментов в мембранах бактериальных клеток облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Для детекции легкоутилизируемых углеводов и спиртов перспективными могут стать медиаторпые биосепсоры па основе бактерий СИисопоЬасЬег оху(1ат, содержащих мембраплокализоваппые ферменты. Электрокаталити-ческое окисление субстратов бактериями в присутствии медиаторов электронного транспорта мало изучено. Исследование кинетических особенностей электрокаталитического окисления легкоутилизируемых субстратов бактериями СИисопоЬасЬег оху(1ат в присутствии медиаторов электронного переноса представляется актуальным для разработки принципов создания микробных медиаторпых сенсоров. Известно, что при биоэлектрокаталитическом окислении углеводов и спиртов бактериями О. оху(1ат можно использовать 2,6-ди-хлорфенолиндофенол (ДХФИФ), п-бензохинон (БХ), гексацианоферрат (III) калия (ГЦФ) в качестве медиаторов переноса электронов. Все эти соединения хорошо растворимы в воде и применяются в биосепсорпых системах в составе рабочих растворов. Для создания безреагептпых биосепсорпых систем необходим поиск новых медиаторов электронного транспорта, нерастворимых в водных средах, по способных взаимодействовать с активными центрами ферментов бактерий. Перспективными классами соединений, применяемых в качестве медиаторов в биосепсорах па основе ферментов, являются ферроцены и хипопы. Возможность использования таких соединений в биосепсорах па основе целых клеток только изучается.
Используя прямые методы регистрации переноса заряда в системе «суб-страт-клетка-медиатор-электрод» циклические вольтамперограммы и регистрацию тока при фиксированных значениях потенциала, показано, что водорастворимые медиаторы ДХФИФ, БХ, ГЦФ, фепазипметасульфат, а также водоперастворимые медиаторы ферроцен (ФЦ), ^Г-диметилферроцеп
(ДМФЦ), ацетштферроцетт, ферроцетткарбальдегид и некоторые хиттотты-2,5-дибром-1,4-бепзохипоп, 2-метил- 1,4-бензохинон могут быть использованы в качестве медиаторов для переноса зарядов от цепи электронного транспорта бактерий G. oxydans па электрод [32J. Для таких медиаторов, как ферроцен, ацетштферроцетт, ферроцетткарбальдегид, 5-дибром-1,4-беттзохиттотта, 2-метил-1,4-беттзохиттотта возможность переноса заряда в сочетании с данными клетками продемонстрирована впервые.
Для медиаторов ДХФИФ [33J, БХ, 2,5-дибромбеттзохиттотт, ГЦФ и ФЦ получены количественная оценка скоростей окисления (портрет субстратной специфичности) спиртов: тт-пропаттола, тт-бутаттола, метанола, этанола, трет-бутаттола, изо-пропаттола, изо-бутаттола, моносахаридов: галактозы, ксилозы, маттттозы, фруктозы и глюкозы. Наиболее высокие скорости окисления соответствовали глюкозе. Для сравнения были получены оценки скорости окисления этих же субстратов в условиях переноса заряда па естественный акцептор электронов кислород. Найдено, что соотношение скоростей окисления для субстратов глюкозы и этанола составляют для ДХФИФ-2.5, дибромхиттотта-5, БХ-5, ФЦ-2.5, ГЦФ-1.1 и кислорода 0.9.
Используя модель, учитывающую стадию переноса субстрата через мембрану, реакцию его с ферментом, регенерацию фермента и медиатора (модель Эльбери), был выполнен анализ стадии, ограничивающей процесс электрока-талитического окисления глюкозы и этилового спирта иммобилизованными бактериями G. oxydans в присутствии ДХФИФ [34J. Преобразовав систему уравнений, основанных па равенстве потоков вещества и электронов от субстрата к электроду, получено уравнение, аналогичное уравнению Хэйпеса, с помощью которого был проведен анализ зависимости скорости электроката-литического окисления от параметров. Показано, что при концентрациях субстратов менее 1,5 мМ, скорость определяющей стадией является диффузия субстрата в матрицу иммобилизованных бактерий; при концентрациях выше 1,5 мМ лимитирующей стадией является ферментативное окисление субстратов бактериями. Смену лимитирующей стадии процесса, происходящей при переходе от низких к высоким концентрациям, объяснили наличием быстрой регенерации ферментов дыхательной цепи при участии медиатора.
Для трех водорастворимых медиаторов (ДХФИФ, БХ, ГЦФ) [35J и четырех гидрофобных медиаторов, иммобилизованных па поверхности электрода (ФЦ, ДМФЦ, 2,5-дибром-1,4-беттзохиттотта, 2-метил-1,4-беттзохиттотта) выполнена оценка эффективности их взаимодействия с бактериями при окислении глюкозы [36J. Изучена зависимость электрокаталитического тока при варьировании концентрации глюкозы в условиях избытка медиатора и концентрации медиатора в условиях избытка глюкозы. Для описания кинетики применена модель двухсубстратпой ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг». Параметром, определяющим эффективность взаимодействия, являлось отношение максимальной скорости реакции к кажущейся константе Михаэлиса (/тах/^м)- Показано, что ряд эффективности водорастворимых медиаторов имеет вид БХ ДХФИФ ГЦФ.
а отношения Imaxl^yi для них составляют 8.4, 3.3 и 0.6 соответственно. Для гидрофобных медиаторов ряд эффективности имеет вид: 2,5-дибром-1,4-бепзохипоп>ФЦ>ДМФЦ>2-метил-1,4-бепзохипоп, а отношения 1тах/Км для них составляют 368, 117, 49 и 23 соответственно. На основе полученных данных сделан вывод о том, что параметром, оказывающим существенное влияние па скорость электрокаталитического процесса, является тип используемого медиатора [37J.
На основе полученных данных о роли медиатора и субстрата сделан вывод о том, что параметрами, оказывающими существенное влияние па скорость электрокаталитического процесса, является тип используемого медиатора и тип окисляемого субстрата. Бактерии G. oxydans в сочетании с медиаторами электронного транспорта ферроценом и 2,5-дибром-1,4-бепзохипопом были использованы для создания модели биосепсора для экспресс-оценки индекса ВПК, позволяющего судить о степени загрязненности пробы воды [38J.
Исследование свойств микробных медиаторных сенсоров и разработка биотопливпых элементов представляют связанные направления. БТЭ — устройства, в которых осуществляется превращение химической энергии различных веществ (углеводов, спиртов) в электричество в процессе биологической трансформации. Интерес к разработке альтернативных источников энергии (к которым относятся БТЭ) связан с грядущим глобальным истощением па Земле источников полезных ископаемых, используемых для нужд энергетики. Особая привлекательность БТЭ обусловлена возможностью использования в них в качестве топлива веществ, являющихся отходами. Это обстоятельство связано с тем, что микроорганизмы или их ферменты способны к деструкции достаточно широкого класса низко- и высокомолекулярных соединений. Таким образом, помимо энергетической, БТЭ способны решать и экологические проблемы утилизации отходов. К настоящему моменту создано большое количество типов БТЭ, различающихся материалом электродов, ячеек, применяемыми биокатализаторами. Одними из перспективных микроорганизмов в качестве биокатализатора БТЭ являются бактерии Gluconobac-ter oxydans. Эти микроорганизмы обладают уникальной мембранной локализацией основных ферментов — дегидрогеназ, что облегчает доступ медиатора к активным центрам ферментов, осуществляющих неполное и активное окисление углеродных субстратов, поэтому при изучении закономерностей функционирования БТЭ биокатализатором служили бактериальные клетки Gluconobacter oxydans subsp. industrius BKM В-1280 (далее G. oxydans). Были применены два режима функционирования — генерация тока при заданном потенциале и генерация потенциала при различных внешних нагрузках — от условий короткого замыкания до нагрузки, соответствующей разомкнутому состоянию (холостой ход).
В режиме генерации тока исследовали профиль растворенного кислорода, устанавливающийся в БТЭ. Показали, что за время порядка 5-7 мин интенсивное окисление субстрата приводит к полному исчезновению кислорода из реакционной среды и дальнейшее окисление субстрата осуществляется за
счет акцептирования электронов медиатором и переноса их па анод. Пришли к заключению, что мешающее действие кислорода па временах, больших 7 мин, не проявляется. При выборе медиатора было установлено, что для иммобилизованных бактерий О. оху(1ат наиболее эффективным искусственным акцептором электронного транспорта из ряда БХ, ДХФИФ и ГЦФ являлся ДХФИФ как анодный медиатор [39]. С помотцыо вольтамперпых характеристик был показан значительный рост тока в БТЭ при использовании ДХФИФ. Основная часть измерений была проведена при использовании ДХФИФ в концентрации 34 мкМ. Наиболее высокие значения силы тока наблюдали при использовании глюкозы в качестве окисляемого субстрата (насыщающей являлась концентрация 10 мМ). Этанол и ксилоза окислялись со значительно меньшей скоростью, составляющей, соответственно, 26% и 30% от токов па глюкозу; сорбит не приводил к появлению тока. Зависимость тока от потенциала носила немонотонный характер с максимумом при +250 мВ. pH зависимость была аналогична таковой, полученной для клеток при окислении глюкозы в естественных условиях; за оптимум величины была принята величина pH 7.6 [40].
В экспериментах по генерации потенциала получили ряд количественных оценок. Среднее значение генерируемого потенциала для контрольных условий составляет 55 мВ (коэффициент вариации равен 6,1%). Рассчитанное значение силы тока при нагрузке 10 кОм составляет 5,6 • 10-7 А. Рассчитанная величина внутреннего сопротивления системы равна 88 кОм, значение плотности тока, отнесённое к рабочей поверхности электрода, было равно
0,25 мкА/'см2 [41]. Сравнивая кинетику развития потенциала нашли, что в случае иммобилизованных клеток сокращается время достижения установившегося значения потенциала. При этом генерируемая разность потенциалов и ток па нагрузке 10 кОм возрастают па 25 %, а развиваемая мощность па 56 %. Вместе с тем увеличивается па 14 % внутреннее сопротивления элемента. При использовании гидрофобных медиаторов ФЦ и ДМФ в композиции с иммобилизованными клетками более эффективным оказался ФЦ. В сопоставимых концентрациях применение ферроцена позволило получить более высокие значения генерируемой ЭДС (па 8 %) и разрядного тока (па 47 %); при этом па 38 % снижалось внутреннее сопротивление ячейки при более чем двукратном увеличении мощности БТЭ.
Основной характеристический портрет системы, включающий зависимость развиваемой мощности (эквивалентно интенсивности переноса заряда) от установившейся скорости окисления (отражает величину тока) и от концентрации медиатора, субстрата (глюкозы) и количества бактериальных клеток обнаруживает следующие особенности [42]. Зависимость мощности от генерируемого тока имеет колоколообразпый характер с максимумом при токе, соответствующем внутреннему сопротивлению БТЭ. Увеличение концентрации медиатора в два раза при незначительном снижении пиковой мощности приводит к значительному росту тока короткого замыкания (50 по сравнению с 30 мкА). Увеличение в два раза концентрации субстрата
оставляет без изменения ток короткого замыкания и положение максимума мощности, значительно снижая его значение. Увеличение в два раза концентрации биокатализатора увеличивает значение максимальной мощности, сдвигает его в сторону токов короткого замыкания (снижает внутреннее сопротивление) и значительно увеличивает ток короткого замыкания (42 по сравнению с 30 мкА).
Полученные результаты являются новыми, предлагающими неизвестные ранее представления об особенностях микробного биоэлектрокатализа.
Заключение
В обзоре приведены результаты по разработке биосепсорпых систем и биотопливпых элементов, полученные коллективом в последние годы. Одним из важных направлений исследований было повышение стабильности биоре-цепторпых элементов в ходе их иммобилизации в гели и матрицы. Другое направление исследований в коллективе — увеличение селективности микробных сенсоров с использованием подходов, применяемых в аналитической химии при выполнении многокомпонентного анализа (обработка экспериментальных данных с помощью искусственных нейронных сетей (ИНС)). Проводятся исследования свойств сенсоров с применением плазмидсодержащих и бесплазмидпых штаммов бактерий — деструкторов ксенобиотиков для разработки метода экспресс-характеристики физиолого-биохимического поведения микроорганизмов, а также для повышения селективности анализа с помощью двухкапалытых биосепсоров. Исследование свойств микробных медиаторпых электродов и разработка биотопливпых элементов (БТЭ) — альтернативных источников энергии — представляют связанные направления в биосепсор-пой области. В последние годы проводится поиск эффективных сочетаний «клетка микрооргапизма-тип электронного медиатора-тип субстрата». Получены новые данные, количественно описывающие взаимодействие «клетка-медиатор». Наряду с исследовательской деятельностью создаются биосепсо-ры, являющиеся прототипами промышленных изделий, которые позволяют в полу- или полностью автоматическом режиме определять концентрацию искомого соединения без пробоподготовки в кратчайшие сроки, что, во многом, и определяет их преимущества перед физико-химическими методами змдьЛшздь.
Список литературы
1. Биосенсоры. Медицинские, биотехнологические и экологические аспекты /
А.Н. Решетилов [и др.] /7 Вестник новых медицинских технологий. 1999. Т. VI, № 3-4. С. 44-49.
2. D’Souza S.F. Microbial biosensors. Review // Biosens. Bioelectron. 2001. V. 16. P. 337-353.
3. Baeumner A.J. Biosensors for environmental pollutants and food contaminants. Review // Anal. Bioa.na.l. Chem. 2003. V. 377. P. 434-445.
4. Biofuel cells and their development. Review./ R.A. Bullen [et. a.i.] // Biosens. Bioelectron. 2006. V. 21. P. 2015-2045.
5. Иммобилизация клеток Gluconobact.er oxydans для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров./ В.А. Арляпов [и др.] // Изв.ТулГУ. Сер. Химия.
2006. Вып. 6. С. 137 - 144.
6. Биосенсоры для экспресс-определения спиртов на основе дрожжей Pichia angusta и Hansenula polymorphia,, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта / Л.Д. Асулян [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Естественные науки. 2008. Вып. 1. С. 169-176.
7. Решети,лов А.Н. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для экологического мониторинга и контроля биотехнологических процессов. Обзор // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41, № 5. С. 504-513.
8. Rodriguez-Mozaz S., Lopez de Alda, M.J., Barcelo D. Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring. Review // Anal Bioa.na.l Chem. 2006. V. 386, N4. P. 1025-1041.
9. Bourgeois W., Burgess .I.E., St.uetz R.M. On-line monitoring of wastewater quality: a. review // .1. Chem. Technol. Biotechnol. 2001. N 76. P. 337-348.
10. Экспресс-метод определения ВПК с помощью биосенсора. / В.А. Арляпов [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2006. Вып. 6. С. 131 — 136.
11. Микробные биосенсоры для экспресс-определения ВПК сточных вод предприятий пищевой промышленности / В.А. Арляпов [и др.] // Вода.: Химия и Экология. 2008. №3. С. 20-22.
12. Express detection of BOD in wastewaters of sta.rch-processing industry / V.A. Arlya.pov [et. a.i.] // Starch science and technology / Editor: C.E. Za.ikov — в печати.
13. Campanella L., Favero G., Tomassetti M. Immobilised yea.st cell biosensor for total toxicity testing // Since of Total Environ. 1995. N 171. P. 227-234.
14. Применение биосенсора, на. основе иммобилизованных микроорганизмов для оценки токсичности продукции производственного и бытового назначения, и товаров для детей / И.Ф. Чепкова [и др.] // Токсикологический вестник - в печати.
15. Сравнительная оценка, дыхательной активности иммобилизованных микроорганизмов — деструкторов углеводородов нефти и их искусственных ассоциаций / И.Л. Лагунова, [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2006. Вып. 6. С. 179-188.
16. Сравнительная оценка, окисляющей активности ферментных систем бактерий-деструкторов ка.прола.кта.ма. и эффективности функционирования этих штаммов в качестве рецепторного элемента, биосенсора. / И.В. Российская [и др.] /7 Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2005. Выи 5. С. 216-225.
17. Оценка, влияния плазмид биодегра.да.ции нафталина, на. биохимическое поведение бактерий — нефтедеструкторов рода. Pseudomonas с помощью биосенсорных технологий / И.Л. Лагунова. |и др.| /,/ Изв. ТулГУ. Сер. Естественные науки.
2007. Вып. 1. С. 243-252.
18. Биосенсорная оценка ка.таболической активности штаммов-деструкторов е-капродактама. с различными сочетаниями «САР-пла.змида. — бактериальный хозяин» / И.В. Российская [и др.] // Биотехнология. 2008. №4. С. 44-47.
19. Детекция ка.прола.кта.ма. двумя типами микробных биосенсоров / И.В. Российская [и др.] // Вода: Химия и Экология. 2008. ЛИ. С. 30-38.
20. Новый метод экспресс-анализа, в спиртовом производстве. Ч. 1./ А.Н. Решетилов [и др.] // Ликероводочное производство виноделие. 2008. Т. 3, № 99. С. 20-22.
21. Новый метод экспресс-анализа, в спиртовом производстве. Ч. 2. / А.Н. Решетилов [и др.] // Ликероводочное производство виноделие. 2008. Т. 3, №100. С. 24-27.
22. Характеристика, биока.тализа.торов на. основе иммобилизованных дрожжевых ал-когольоксида.3 как основы рецепторных элементов биосенсоров для определения содержания спиртов / М.Г. Зайцев [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Естественные науки. 2008. Вып. 2. С. 200-207.
23. Перспективы применения биосенсорных экспресс-а.нализа.торов при производстве спирта / А.Е. Китова, [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2004. № 4. С.17-19.
24. Использование электродов, полученных трафаретной печатью и модифицированных берлинской ла.зурью и алкогольоксида.зой, в биосенсорной системе для определения спиртов / И.В. Блохин [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2008. Вып. 1. С. 177- 186.
25. Биосенсорный анализ крахмала.: применение гомогенного гидролиза, с детекцией глюкозы ферментным и микробным сенсорами / Е.В. Рыбакова, [и др.] // Сенсорные системы. 2005. Т. 19, JYH. С. 90-96.
26. Количественное определение крахмала, в муке с помощью микробного сенсора. / О.Н. Пона.морева. [и др.] // Изв ТулГУ. Сер. Химия. 2004. Вып. 4. С. 112-120.
27. Ферментные биосенсоры для экспресс-анализа, содержания глюкозы, этанола и крахмала, в ферментационных средах / А.Е. Китова, [и др.] // Микробные биока.тализа.торы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК / Под ред. В.А. Полякова.. М.: Пи щи ром из дат, 2004. С.255-263.
28. Биосенсор для определения глюкозы, крахмала, и этанола / И.В. Блохин [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2005. Вып 5. С. 226-232.
29. Лобанов A.B., Решетилов A.H., Пономарева О.Н. Определение состава многокомпонентных смесей при помощи микробных сенсоров. // Сенсорные системы. 2005. Т. 29. №1. С. 83-89.
30. Применение технологии искусственных нейронных сетей для определения содержания компонентов в смеси глюкоза.-эта.нол-мета.нол при помощи микробных биосенсоров / В.А. Арляпов [и др.] // Изв ТулГУ. Сер. Естественные науки. 2007. Вып. 1. С. 209 - 217.
31. Арляпов В.А., Понаморева О.H., Алферов В.А. Многоканальная биосенсорная система, для определения содержания глюкозы, метанола, и этанола при их совместном присутствии // Биотехнология. 2008. Ж5. С. 84-91.
32. Микробные сенсоры на. основе производных ферроцена, и бензохинона., применяемых в качестве медиаторов / Е.Ю. Чигринова. [и др.] // Сенсорные системы.
2007. Т. 21, №3. С. 262-268.
33. Изучение характеристик амперометрического сенсора на основе бактерий Cluconoba.cter oxyda.ns и медиатора электронного транспорта 2,6-дихлорфенолин-дофенола / В.А. Алферов [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2004. Вып. 4. С. 126-134.
34. Математическая модель микробного биосенсора. амперометрического типа / Е.Е.Бабкина [и др.] /7 Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2002. Вып. 3. С. 82 — 90.
35. Эффективность медиаторов электронного транспорта при электрока.талитиче-ском окислении субстратов иммобилизованными бактериями / В.А. Алферов [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2004. Вып. 4. С. 104-112.
36. Bioelectroca.ta.lytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Cluconoba.cter oxyda.ns. Evaluation of wa.ter-insoluble mediator efficiency / E. Ba.bkina. [et. a.i.] // Electroanalysis. 2006. V. 18, N. 19-20. P.2023-2029.
37. Оценка, эффективности водорастворимых медиаторов при биоэлектрока.тали-тическом окислении глюкозы иммобилизованными бактериями / Е.Е.Бабкина, [и др.] // Сенсорные системы. 2006. Т. 20, JVM. С. 329-335.
38. Безреа.гентный медиа.торный биосенсор на. основе бактерий Gluconobacter oxydons для определения ВПК сточных вод / Е.Ю. Чигринова. [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2006. Вып. 6. С. 153-161.
39. Testing of bacteria. Gluconobacter oxydons and electron transport mediators composition for application in Biofuel Cell / A. R.eshetilov [et. al.] // Electroa.na.lysis. 2006. V. 18, N 19-20. P. 2030-2034.
40. Анод биотопливного элемента на. основе бактериальных клеток Cluconoba.cter oxyda.ns и медиатора электронного тра.спорта. 2,6-дихлорфенолиндофенола. /
В.А. Алферов [и др.] // Электрохимия. 2006. Т. 42, JVM. С. 456-457.
41. Параметры модели биотопливного элемента на. основе бактериальных клеток Cluconoba.cter oxyda.ns и медиатора электронного транспорта. 2,6-дихлорфенолиндофенола. / В.А. Алферов [и др.] /7 Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2005. Вып. 5. С. 203-209.
42. Генерация электрической энергии в биотопливном элементе на. основе клеток микроорганизмов / А.Н. Решетилов [и др.] // Вестник биотехнологии и физикохимической биологии им. Ю.А. Овчинникова.. 2006. Т.1, №5. С. 54-63.
Поступило 21.12.2008
Понаморева Ольга Николаевна (olga@tsu.tula.ru), к.хлт., доцент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Biosensors and biofuel cells on the basis of the whole cells of microorganisms. Review
O.N. Ponamoreva
Abstract. Results of the research performed at the Center for Reseach and Education «Ecobiotecnology» (the Tula State University and the Institute of
Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences), on designing whole cell biosensors for monitoring of fermentation, environmental applications and allied fields are represent. Parameters of the mediator electrodes involving microbial cells and and data on the properties of microbial biofuel cells — devices based on biosensor principle and representing alternative sources of electric energy — are given.
Keywords: biosensors, environmental analysis and monitoring, bioprocess monitoring, bioelectrocatalysis, biofuell cell.
Ponarnoreva Olga (olga@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of biotechnology, Tula State University.
