Биосенсор на основе алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha ncyc 495 ln для определения метилового и этилового спиртов Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 543.9

БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ АЛКОГОЛЬОКСИДАЗЫ ИЗ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ ИЛШЕШЬЛ РОЬУМОЯРИЛ ^УС 495 LN ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТИЛОВОГО И ЭТИЛОВОГО

СПИРТОВ

Д.Ю. Зайцева, М.Г. Зайцев, М.Р. Мингалимов

Алкогольоксидазу выделяли из метилотрофных дрожжей Иатвпи1а ро1ушогрЬа ЫСУС 495 1п, очищали методом фракционного высаливания и ионообменной хроматографией. Выделенный ферментный препарат использовали при разработке биосенсора для определения содержания низших спиртов. Для изготовления биорас-познающего элемента биосенсора применили способ ковалентного связывания фермента с нитроцеллюлозной мембраной посредством взаимодействия гидроксиль-ных групп с бензохиноном. Предел обнаружения метанола и этанола с помощью разработанного макета биосенсора - 0,004 и 0,02 мМ соответственно. Относительное стандартное отклонение (для 15 последовательных измерений и доверительной вероятности 0,95) составило 4 и 6 % для метанола и этанола соответственно, а долговременная стабильность функционирования биосенсора - 15 суток.

Ключевые слова: алкогольоксидаза, биосенсор, метилотрофные дрожжи, метанол, этанол.

Введение

Количественное определение этилового спирта с высокой чувствительностью, селективностью и точностью требуется во многих различных областях анализа, таких как: пищевая промышленность, производство алкогольных напитков и целлюлозно-бумажная промышленность [1]. При разработке экспрессных методов биоанализа наиболее перспективным является применение ферментных и целоклеточных биосенсоров, которые отличаются простотой аппаратурного и методического оформления, достаточными уровнями чувствительности и избирательности, экспрессностью и экономичностью. При определении содержания низших спиртов наибольшее развитие получили электрохимические биосенсоры на основе иммобилизованного фермента алкогольоксидазы (АО), принцип работы которых заключается в измерении концентрации кислорода или образующегося пероксида водорода в приэлектродном пространстве [2]. Основным источником АО являются метилотрофные дрожжи.

Алкогольоксидаза (алкоголь: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.1.3.13) представляет собой олигомерный фермент с молекулярной массой около 600 кДа, состоящий из восьми идентичных субъединиц, расположенных в виде квази-кубической ориентации, каждая из которых содержит связанный флавинадениндинуклеотид (ФАД). Алкогольоксидаза (АО) катализирует окисление первичных спиртов с низкой молекулярной

массой в присутствии растворенного кислорода, с получением соответствующих альдегидов и перекиси водорода [3].

Биосенсоры на основе алкогольоксидазы, имеют преимущество, например, перед алкогольдегидрогеназными биосенсорами, в связи с тем, последним нужен кофактор, добавляемый к образцу или иммобилизованный на поверхности датчика, в то время как биосенсоры на основе АО более просты, так как они используют только молекулярный кислород для регенерации кофактора [4]. Одним из ключевых этапов при разработке эффективного биорецепторного элемента является иммобилизация биологического компонента. Одной из важнейших задач является разработка биораспознающего элемента, который отличается высоким уровнем чувствительности, операционной и долговременной стабильности.

В связи с этим целью данной работы является разработка биосенсора на основе иммобилизованной алкогольоксидазы для определения содержания метанола и этанола.

Материалы и методы

Штамм микроорганизмов. В работе использовали метилотрофные дрожжи Hansenula polymorpha NCYC 495 ln, предоставленные лабораторией биосенсоров ИБФМ РАН г. Пущино.

Культивирование метилотрофных дрожжей. Для выращивания дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495 ln использовали питательную среду для культивирования дрожжевых микроорганизмов. Клетки выращивали в шейкере - инкубаторе (180 об/мин) при 28 °С в колбах Эрленмейера с 200 мл среды, содержащей: (NH4)2SO4- 2,5 г, MgSO4- 0,2 г, KH2PO4-3H2O- 0,7 г, NaH2PO4-2H2O- 3,0 г, дрожжевой экстракт (Тип Д)-0,5 г, DL лейцин- 0,17 г, глицерин- 8,3 мл, микроэлементы- 1 мл.

Инокулят вносили в количестве 5 % по объему среды. На финальном этапе выращивания проводили процедуру индукции алкогольоксидазы микроорганизмов. Осажденную биомассу переносили в колбу с 200 мл бесфосфатной питательной среды и добавляли метанол до концентрации 1% об. Колбу помещали в шейкер - инкубатор на 24 ч (Т =28 0С, 180 об/мин). Полученную биомассу осаждали центрифугированием при 8000g в течение 15 мин. Дрожжевые клетки помещали в морозильную камеру (Т=-20 0C), чтобы увеличить время хранения.

Для выделения АО проводили ультразвуковое разрушение выращенной дрожжевой биомассы. Клетки ресуспендировали в 10 мл калий-натрий фосфатного буферного раствора (pH=7,6) и разрушали на УЗ диспергаторе (УЗД 1-0.1/22) при температуре =2-6 0С (6 циклов по 20 сек с интервалом 15 сек, клеточный дебрис осаждали центрифугированием (12000 об/мин., 10 мин, 4 0С). Супернатант использовали для дальнейшей очистки.

Ступенчатое высаливание белков сульфатом аммония. Для

отделения сторонних белков от АО использовали метод ступенчатого высаливания. Процедуру проводили в 3 этапа: в супернатант вносили сухой (NH4)2SO4 до концентрации 30 % от насыщения [5]. После растворения соли экстракт выдерживали 5 мин при комнатной температуре. Осадок отделяли центрифугированием (8000 g, 10 мин.). Затем в супернатант вновь вносили (NH4)2SO4 до концентрации 70 % от насыщения [5] растворяли и осадок отделяли центрифугированием. На последнем этапе вносили (NH4)2SO4 до 100 % от насыщения [5] и проводили аналогичные процедуры. На каждом этапе осаждения определяли содержание белка и удельную ферментативную активность алкогольоксидазы в осадке и супернатанте. Осадки с максимальной алкогольоксидазной активностью отбирали для последующей финальной очистки от сопутствующих белков методом ионообменной хроматографии.

Анионообменная хроматография. Анионообменную

хроматографию проводили на установке для препаративного разделения белков Biologic LP(BIO-RAD). Белковую пасту, необходимо растворять в буферном растворе, для снижения ионной силы раствора препятствующей сорбции белков на положительных зарядах ДЭАЭ-сефарозы. Для этого препарат АО растворяли из расчета 1 г белковой пасты на 75 мл 60 мМ калий фосфатного буфера, pH=7,6. Перед нанесением белка колонку с наполнителем промывали K-Na-фосфатным буфером (рН=7,6; 25 мл). Раствор препарата АО центрифугировали 10 мин при 8000 g и наносили с использованием перистальтического насоса со скоростью 1 мл/мин на колонку, заполненную ДЭАЭ-сефарозой. После нанесения всего количества препарата АО колонку промывают 60 мМ калий фосфатным буфером, содержащим 200 мМ NaCl, pH=7,6 до удаления несорбируемых белков. Скорость промывки 1мл/мин.

Десорбцию АО с ДЭАЭ-сефарозы проводили в следующих условиях:

Скорость потока- 0,75 мл/мин

Линейный градиент концентрации раствора NaCl (1 M) 0-100 % в течение 90 мин

Общее время хроматографии- 140 мин объём единичной фракции- 2 мл

Определение константы Михаэлиса для выделенного фермента алкогольоксидазы спектрофотометрическим методом. Для определения Км выделенного фермента проводили серию экспериментов по определению кинетических кривых окисления красителя ABTS при различных концентрациях окисляемых соединений: метанола, этанола. Диапазон концентраций для всех субстратов составил 0,05 мМ-10 мМ. За величину ответа принимали скорость увеличения оптической плотности -

тангенс угла наклона зависимости оптической плотности от времени протекания реакции.

Иммобилизация биоматериала. Активацию поверхности нитроцеллюлозной мембраны проводили бензохиноном.

Нитроцеллюлозную мембрану (4х4мм) инкубировали в 10 мл раствора бенхохинона (0,05 М) в отсутствие доступа света (24 ч, 20 °С). Затем мембрану отмывали в следующей последовательности: дистиллированная вода (несколько раз), 1 М раствор КаС1, дистиллированная вода, 50 % этанол, дистиллированная вода, 50 % этанол, дистиллированная вода, фосфатный буфер (рН=7,6).

Активированные бензохиноном мембраны помещали в образец с максимальным содержанием АО на сутки (1=4 0С), после чего отмывали калий-фосфатным буфером рН=7,6 и закрепляли на поверхности электрода.

Между измерениями ферментсодержащие мембраны хранили при 4° С в фосфатном буферном растворе рН=7,6.

Биосенсорные измерения. Регистрацию сигнала в биосенсорном анализе проводили, используя кислородный электрод Кларка, на поверхности которого закрепляли рецепторный элемент. В качестве преобразователя использовали установку БПК-термооксиметр Эксперт-001 (Эконикс-Эксперт: объем кюветы 5 мл; натрий-калиевый фосфатный буфер рН=7,6; перемешивание раствора в кювете осуществляли с использованием магнитной мешалкой (скорость перемешивания 300 об/мин); ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (20-200 мкл, 1000-5000 мкл) («Ленпипет», Россия). Добавляли аликвоту анализируемого вещества и ожидали завершения изменений, после чего находили тангенс угла наклона кривой.

Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость развития сигнала. После каждого измерения осуществляли промывание электрода буферным раствором в течение 2-3 мин.

Результаты и их обсуждения

Метилотрофные дрожжи Иатвпи1а ро!утогрИа КСУС 495 1п при росте на глицерине с индукцией метанолом являются эффективными продуцентами алкогольоксидазы, которая может составлять до 37-40 % от суммарного клеточного белка [6]. Биомассу выращивали до экспоненциальной стадии роста на глицерине, затем индуцировали алкогольоксидазный промотор добавлением в культуральную среду метанола. Биомассу дрожжей использовали как источник целевого фермента- алкогольоксидазы после разрушения клеток ультразвуком. Для грубой очистки фермента использовали метод ступенчатого высаливания сульфатом аммония в диапазоне концентраций (30-100 % от насыщения).

Метод ступенчатого высаливания часто используют для выделения целевого фермента, если его содержание в клетках преобладает над другими белками. Для очистки фермента методом ионнообменной хроматографии была выбрана фракция (70 % от насыщения) с максимальной удельной активностью (8 Е/мг).

АО при нейтральном значении рН имеет суммарный отрицательный заряд, поэтому для отделения этого фермента от других белков часто используют метод ионообменной хроматографии [3]. На рис. 1 представлен типичный вид хроматограммы при проведении разделения белковой смеси с использованием полуавтоматизированной системы. На диаграмме отображены показания УФ-датчика.

Рис. 1. Зависимость показаний УФ-датчика от времени прохождения промывного раствора в процессе разделения белковой смеси. Ферментный препарат из Hansenula polymorpha NCYC 495 1п

На хроматограмме можно отметить три пика показания УФ-датчика, которые соответствуют фракциям с значительным содержанием белка. Время выхода первого пика составило 75-95 мин, второго пика-100-108 мин, третьего пика- 110-120 мин. Для определения участка хроматограммы, соответствующего десорбции АО, определяли удельную активность АО в отобранных фракциях. В первых двух фракциях активность отсутствовала.

Ферментный препарат АО после анионообменной хроматографии представляет собой сильно разбавленный раствор и требует дополнительного концентрирования. Процедуру проводили с использованием концентрирующих центриконов с размером пор 100 кДа

(МПНроге). В сконцентрированном образце фракции, соответствующей третьему пику удельная активность составила 2 Е/мг.

Для биохимической характеристики ферментов используют кинетические параметры, которые можно определить из уравнения ферментативной кинетики Михаэлиса-Ментен. Зависимость скорости ферментаивной реакции от концентрации субстрата определяли спектрофотометрическим методом. Типичная зависимость представлена на рис. 2 для метанола.

Рис. 2. Зависимость скорости увеличения оптической плотности

от концентрации метанола

В табл. 1 представлены параметры кинетических уравнений, полученных для метанола и этанола.

Таблица 1

Субстрат К , мМ м' Стандартное отклонение

Метанол 0,34 0,05

Этанол 2,2 0,3

Выделенный нами фермент алкогольоксидаза обладает наибольшим сродством к метанолу, что хорошо согласуется с литературными данными: Км для метанола и этанола- 0,71 мМ и 2,7 мМ соответственно [3]. Значения констант Михаэлиса могут отличаться в зависимости от фермента и условий проведения анализа, поэтому наблюдается некоторое несоответствие с абсолютными значениями, представленными в литературных источниках.

Очищенный фермент использовали для разработки биосенсора для определения спиртов. Для формирования рецепторных элементов выбран способ ковалентного связывания фермента. Метод ковалентного связывания биоматериала с поверхностью преобразователя позволяет создавать биосенсоры, в которых биокомпонент остается иммобилизованным в течение всего срока эксплуатации сенсора. В качестве носителя использована нитроцеллюлозная мембрана. Взаимодействие безохинона с гидроксильными группами нитроцеллюлозной мембраны приводит к появлению на ее поверхности активированных функциональных групп, способных взаимодействовать с аминогруппами белков или гидроксильными группами декстрана (рис. 3).

2.

3.

Ч^Ч

I

о

о

он

Ч/Ч

Г1

он

1ЧН

но.

он

Рис. 3. Схема иммобилизации алкогольоксидазы на нитроцеллюлозной мембране, активированной бензохиноном

В результате процесса активации нуклеофильной атаки, гидроксильные группы нитроцеллюлозной мембраны связываются с молекулой бензохинона с получением 2-замещенной молекулы гидрохинона, прикрепленной к мембране, согласно реакции 1. Водород

затем может быть удален в ходе реакции со второй молекулой бензохинона с получением 2-замещенного производного хинона, прикрепленного к мембране, как показано в реакции 2. Затем нуклеофильная группа белка вступает в реакцию с мембраной, которая связана хиноном и, таким образом, белок ковалентно связывается с мембраной через гидрохинон, в соответствии с реакцией 3 [7].

Макет биосенсора представлял собой систему, в которой на поверхности кислородного электрода в термооксиметре Эксперт-001 закрепляли мембрану с иммобилизованной дрожжевой АО. Макет биосенсора использовали для определения рН-оптимума биорецепторного элемента. Максимальная величина отклика сенсора наблюдается при использовании в качестве рабочего раствора рН=7,6. Полученное значения рН оптимума совпадает с рН для буферного раствора, используемого при работе с АО [4, 8].

Важной характеристикой любого анализа является его селективность, которая в случае биохимических методов анализа определяется специфичность биорецептора. Наибольшая окислительная способность отмечена по отношению к метанолу, формальдегиду и этанолу среди других разветвленных и неразветвленных одноатомных и многоатомных низших спиртов.

Операционная стабильность сенсоров характеризуется изменением активности (в % от исходной) биосенсора после нескольких последовательных измерений в течение определенного периода времени. Для определения операционной стабильности было проведено 15 последовательных измерений ответа сенсора на метанол (0,5 мМ) и этанол (0,5 мМ). На протяжении 15 измерений ответы биосенсора остаются стабильными. При использовании метанола и этанола в качестве определяемого субстрата относительное стандартное отклонение составило 4% и 6% соответственно.

Для построения градуировочной зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата проводили ряд измерений сигнала сенсора при внесении различных концентраций субстрата. Для описания кинетики ферментативных реакций в гомогенных условиях используют гиперболическое уравнение Михаэлиса-Ментен с двумя параметрами.

Параметры градуировочных зависимостей величин ответа биосенсора от концентрации метанола и этанола приведены в табл. 2.

Сравнивая Км, полученные спектрофотометрическим и биосенсорным методом, можно заметить расхождения в результатах. Так, при использовании метанола в качестве определяемого субстрата Км, определенная спектрофотометрическим методом составила 0,34 мМ, а с помощью биосенсора - 0,82 мМ. Иммобилизация фермента оказывает влияние на кинетику функционирования ферментных систем, и приводит к увеличению интервала определяемых содержаний, в котором скорость

ферментативной реакции линейно зависит от концентрации спирта, что важно для снижения ошибок анализа.

Таблица 2

Параметры уравнения Михаэлиса-Ментен градуировочных зависимостей ответа сенсора на метанол и этанол

Субстрат Vmax, мгО2/дм3*с KM, ммоль/л R

Метанол 0,123±0,003 0,82±0,07 0,9918

Этанол 0,0219±0,0007 1,07±0,1 0,9847

Для определения предела обнаружения и коэффициента чувствительности биосенсора выделены линейные участки градуировочных зависимостей ответов сенсора от концентраций определяемых веществ. Из линейных зависимостей рассчитаны коэффициенты чувствительности и пределы обнаружения (табл. 3).

Таблица 3

Параметры сенсора при определении метанола и этанола

Определяемое вещество Коэффициент чувствительности, мг/дм -с^мМ Предел обнаружения, мМ

Метанол 0,081±0,006 0,004

Этанол 0,0137±0,0005 0,02

Чувствительность биорецептора по отношению к этанолу составило 17% от чувствительности к метанолу. Таким образом, содержание метилового и этилового спирта нельзя определять точно при их совместном присутствии. На основе АО из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha ранее разрабатывали макеты биосенсоров проточного [9, 10] и кюветного [9] типов. При этом использовали гальвано-потенциостаты серии IPC (Вольта). Чувствительность разработанного макета на основе серийно выпускаемого термооксиметра «Эксперт-001» не меньше, чем чувствительность разработанных ранее алкогольоксидазных биосенсоров.

Макет биосенсора применили для определения содержания этилового спирта на разных этапах процесса спиртового брожения.

Концентрацию определяемого вещества устанавливали с использованием уравнения для линейного участка градуировочной зависимости величины отклика биосенсора от концентрации этилового спирта в растворе: y = (0,0137± 0,0005)-x + 0,0015± 0,0001.

Концентрация этанола в процессе брожения изменяется с течением времени. На четвертые сутки брожения концентрация этанола достигла максимума и составила 0,3 %. Таким образом, разработанный биосенсор

позволяет определять небольшие концентрации этанола и может быть использован для мониторинга процессов спиртового брожения.

Заключение

В результате проведенных исследований выделен фермент алкогольоксидаза из метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495 ln, который применили для разработки стабильного биорецепторного элемента биосенсора путем иммобилизовации на нитроцеллюлозной мембране в присутствии бензохинона. На основе серийно выпускаемого термооксиметра «Эксперт-001» разработан макет биосенсора кюветного типа, чувствительность которого не уступает ранее разработанным аналогом. Это важно, поскольку расширяет возможности имеющейся инструментальной базы многих аналитических лабораторий. Показано, с помощью разработанного биосенсора можно определять низкие содержания метанола и этанола в водных средах: наибольшую чувствительность проявляется при определении метанола, чувствительность определения этанола в три раза меньше. Показаны возможности применения алкогольоксидазного биосенсора для мониторинга процессов спиртового брожения.

Библиографический список

1. Современные методы анализа формальдегида, метанола и этанола с использованием микробных и ферментных систем / В.А. Сибирный, М.В. Гончар, О. Б. Рябова [и др.] // Микробиол. журн. 2005. Т. 67. С. 85-110.

2. A rapid and sensitive alcohol oxidase/ catalase conductometric biosensor for alcohol determination / M. Hnaien, F. Lagarde, N. Jaffrezic-Renault [et al.] // Talanta. 2010. V. 81. P. 222-227.

3. Purification and Characterization of Alcohol Oxidase from a Genetically Constructed Over-producing Strain of the Methylotrophic Yeast Hansenula polymorpha / S.V. Shleev, G.P. Shumakovich, O.V. Nikitina [et al.] // Biochemistry. 2006. V. 71. P. 245-250.

4. A Simple Visual Ethanol Biosensor Based on Alcohol Oxidase Immobilized onto Polyaniline Film for Halal Verification of Fermented Beverage Samples / B. Kuswandi, T. Irmawati, M. A. Hidayat [et al.] // Sensors. 2014. V. 14. P. 2135-2149.

5. Справочник биохимика: пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир. 1991. 554 с.

6. Алкогольоксидаза и ее биоаналитическое применение / Г.Н. Павлишко, Г.З. Гайда, М.В. Гончар [и др.] // Вестник. Львов УН-ТУ. Биологическая серия. 2004. Т. 35. С. 3-22.

7. Covalent attachment of proteins to polysaccharide carriers by means of benzoquinone / J. Brandt , L.O. Andersson, J. Porath [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. 1975. V. 386. P. 196-202.

8. Bekir H., Toppare L. Biosensing approach for alcohol determination using immobilized alcohol oxidase // Biosensors and Bioelectronics 21. 2006. P. 2306-2310.

9. Характеристика биокатализаторов на основе иммобилизованных дрожжевых алкогольоксидаз как основы рецепторных элементов биосенсоров для определения содержания спиртов / М.Г. Зайцев, В.А. Алферов, Т.А. Кузнецова [и др.] / Известия ТулГУ. Естественные науки. Вып. 2. Тула: Изд-во ТулГУ. 2008. С. 200-207.

10. Электрохимический сенсор на основе алкогольоксидазы для экспресс-определения содержания низших спиртов / В. А. Алферов, М.Г Зайцев, О.Н. Понаморева [и др.] // Журн. аналит. химии. 2011. Т. 66. Вып. 12. С. 1322-1329.

Зайцева Дарья Юрьевна, магистрант, [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Зайцев Максим Геннадьевич, канд. хим. наук, доц., [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Мингалимов Марат Рифкатович, студент, mingalimovm@,mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет

ALCOHOL OXIDASE BASED BIOSENSOR FOR METHANOL AND ETHANOL DETERMINATION

D.Y. Zaytseva, M.G. Zaytsev, M.R. Mingalimov

Alcohol oxidase isolated from Hansenula polymorpha NCYC 495 ln methylotrophic yeast and purified by salting out fractional and ion-exchange chromatography. An isolated enzyme used to development of lower alcohols determine biosensor. Enzyme covalent binding method have been used for the development of a bio sensing element of the biosensor. The detection limit for methanol and ethanol - 0.004 and 0.02 mM respectively. The relative standard deviation (for 15 consecutive measurements and confidence level of 0.95) is equal to 4% and 6% for methanol and ethanol, respectively, and biosensor long-term stability - 15 days.

Key words: alcohol oxidase, biosensor, methylotrophic yeasts, methanol, ethanol.

Zaytseva Daria Yuryevna, master student, Department of Chemistry, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,

Zaytsev Maxim Gennadievich, candidate of chemical sciences, associate professor, [email protected], Russia, Tula, Tula State University,

Mingalimov Marat Rifkatovich, student, Department of Chemistry, [email protected], Russia, Tula, Tula State University