Научная статья на тему 'Использование электродов, полученных трафаретной печатью и модифицированных берлинской лазурью и алкогольоксидазой, в биосенсорной системе для определения спиртов'

Использование электродов, полученных трафаретной печатью и модифицированных берлинской лазурью и алкогольоксидазой, в биосенсорной системе для определения спиртов Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

CC BY
880
93
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Аннотация научной статьи по химическим наукам, автор научной работы — Блохин И. В., Понаморева О. Н., Чупарнов А. А., Решетилов А. Н., Алферов В. А.

Разработан макет амперометрического биосенсора для определения спиртов на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью и алкогольоксидазой. Выявлено, что ответ биосенсора не зависит от концентрации буферного раствора в интервале концентрации солей от 5 до 70 мМ. Оптимальное значение рН для функционирования биосенсора составило 7,6-7,8. Построены калибровочные зависимости ответа биосенсора для различных субстратов: метанол, этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол-1, глицерин. Установлено, что биосенсор на основе печатного электрода с иммобилизованной алкогольоксидазой наиболее специфичен к метанолу. Экспериментально рассчитаны значения констант Михаэлиса для исследованных субстратов, которые совпадают с литературными данными. Установлены нижние пределы обнаружения спиртов. С помощью макета биосенсорной установки проведен анализ содержания этанола в винах, полученные данные хорошо согласуются с референтным методом.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по химическим наукам , автор научной работы — Блохин И. В., Понаморева О. Н., Чупарнов А. А., Решетилов А. Н., Алферов В. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Использование электродов, полученных трафаретной печатью и модифицированных берлинской лазурью и алкогольоксидазой, в биосенсорной системе для определения спиртов»

Известия Тульского государственного университета Серия Естественные науки 2008. Выпуск 1. С. 177-186

ХИМИЯ

V. IК 543.9:547.26

И.В. Блохин, О.Н. Понаморева, A.A. Чупарнов,

А.Н. Решетилов, В.А. Алферов

Тульский государственный университет

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ

ТРАФАРЕТНОЙ ПЕЧАТЬЮ И МОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕРЛИНСКОЙ ЛАЗУРЬЮ И АЛКОГОЛЬОКСИДАЗОЙ, В БИОСЕНСОРНОЙ СИСТЕМЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПИРТОВ

Аннотация. Разработан макет амперометрического биосенсора для определения спиртов на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью и алкогольоксидазой. Выявлено, что ответ биосенсора не зависит от концентрации буферного раствора в интервале концентрации солей от 5 до 70 мМ. Оптимальное значение pH для функционирования биосенсора составило 7, б-7,8. Построены калибровочные зависимости ответа биосенсора для различных субстратов: метанол, этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол-1, глицерин. Установлено, что биосенсор на основе печатного электрода с иммобилизованной алкогольоксидазой наиболее специфичен к метанолу. Экспериментально рассчитаны значения констант Михаэлиса для исследованных субстратов, которые совпадают с литературными данными. Установлены нижние пределы обнаружения спиртов. С помощью макета био-сенсорной установки проведен анализ содержания этанола в винах, полученные данные хорошо согласуются с референтным методом.

Введение. Одним из перспективных направлений развития биосенсор-ных технологий является использование электродов, полученных методом трафаретной печати (screen-printed электроды, печатные электроды). Преимущество рассматриваемой технологии состоит в миниатюрности создаваемых датчиков, их многофункциональности, низкой себестоимости и, следовательно, возможности их одноразового применения. В связи с этим они уже заняли достойное место на рынке. Печатные электроды используется, например, в коммерческих глюкометрах - биосенсорах для определения

© Блохин И.В., Понаморева О.Н., Чупарнов A.A., Решетилов А.Н., Алферов В.А., 2008

содержания глюкозы в крови, которые в настоящее время являются приборами индивидуального пользования. Основными производителями этих анализаторов являются четыре компании (Roche, LifeScan, Abbot, Bayer), их оборот в 2006 году составил приблизительно $4,2 биллиона.

Для придания печатным электродам селективности проводят их модификацию ферментами - оксидоредуктазами, например при производстве печатных электродов для глюкометров используют глюкозооксидазу. Подобные биосенсорные системы на основе других ферментов могут быть успешно применены для детекции других соединений. Так, определение содержания спиртов важно для спиртопроизводства и пищевой промышленности, для оптимизации ферментационных процессов, в клинических анализах, для решения задач судебно-медицинской экспертизы, служб обеспечения безопасности движения [1] и т.д.

Часто в амперометрических биосенсорах в качестве распознающих элементов используют оксидазы. Этот класс ферментов катализирует окисление субстратов с переносом электронов на кислород с образованием окисленной формы субстрата и пероксида водорода. Авторы [2] представили обзор по современному состоянию проблемы определения этанола с помощью биосенсорных систем на основе алкогольоксидазы (КФ 1.1.3.13) (АО). В обзоре рассмотрены различные типы и конструкции электродов, в том числе, полученные методом трафаретной печати. Исследователи отмечают, что одним из распространенных подходов к определению этанола служит метод, основанный на детекции пероксида водорода. Однако, для окисления пероксида водорода необходимо высокое значение потенциала ( 0.7В отн. Ag/AgCl), при котором многие посторонние вещества, содержащиеся в реальных образцах, являются электроактивными и также могут окисляться и вносить вклад в аналитический сигнал.

Этот недостаток может быть устранен в биосенсорах на основе электродов, модифицированных берлинской лазурью (БЛ) и оксидазами. Берлинская лазурь является катализатором разложения пероксида водорода на электроде при 0 В относительно хлоридсеребрянного электрода, что позволяет значительно снизить фоновые сигналы от элекроактивных примесей и увеличить чувствительность всех методов анализа, связанных с детекцией пероксида водорода [3, 4]. В обзорной статье [5], посвященной проблемам изготовления, оптимизации и применения электродов, модифицированных берлинской лазурью, представлены самые современные результаты применения биосенсоров на основе специфических оксидаз для экологии и пищевой промышленности, а также обсуждается коммерческий потенциал таких биосенсоров. Важно отметить, что публикации с описанием печатных электродов на основе Б Л и алкогольоксидазы малочисленны, а в российской научной печати отсутствуют.

В связи с этим, целесообразно проведение в России собственных исследований и выполнение работ, создающих основу для расширения спектра анализируемых веществ с помощью экспрессных биосенсорных систем. Разработка амперомерического биосенсора на основе печатных электродов, модифицированных БЛ, с иммобилизованной алкогольоксидазой для определения содержания этанола является актуальной задачей.

Экспериментальная часть. В работе использовали электроды для определения содержания пероксида водорода, изготовленные на малом инновационном предприятии МГУ им. М.В. Ломоносова ООО «Русенс». Планарные электроды (10 мм х 28 мм х 0.35 мм), производимые методом трафаретной печати, состоят из рабочего графитового электрода, поверхность которого модифицирована нанослоями БЛ, хлорсеребряного электрода сравнения и графитового вспомогательного электрода. Для определения зависимости силы тока от времени использовали универсальный потенциостат 1РС (ООО «Кронас», Россия). Препарат дрожжевой АО из НапвепиЫ ро1утог-рЬа ХСУС 495 1п был любезно предоставлен лабораторией биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Концентрация белка по Лоури в препарате фермента - 11 мг/мл. Удельную активность алкогольоксидазы определяли спектрофотометрическим методом [6], она составляла 10 Е/мг белка.

Определение содержания метанола с использованием печатных электродов «в капле». Для определения «в капле» печатный электрод закрепляли горизонтально. На поверхность электрода наносили 100 мкл буферного раствора таким образом, чтобы поверхность была закрыта каплей. Через 30 сек. добавляли 5 мкл препарата АО. Через 1 минуту в каплю добавляли 5, 10 и 20 мкл 0,1 М раствора метанола. За ответ биосенсора принимали амплитуду отклика в нА при постоянном приложенном потенциале 0 мВ.

Иммобилизация алкогольоксидазы.

Иммобилизация адсорбцией. На поверхность рабочего электрода наносили 5 мкл препарата АО. После подсушивания в течение 1 часа при температуре 22°С электрод использовали для измерений. Между сериями измерений электрод хранили в буферном растворе при 4°С. Использовали фосфатный буферный раствор (pH 7.2). приготовленный по методике [7].

Иммобилизация с использованием полимерной мембраны. Наносили раствор фермента объемом 5 мкл на поверхность рабочего электрода. После подсушивания добавили 5 мкл 1% раствора перфторсульфоната (нафион) (Иика, 1071002, с/|°=0,87). Электрод хранили в буферном растворе при 4° С.

Иммобилизация ковалентным кроссшиванием глутаровым альдегидом. К 10,2 мг бычьего сывороточного альбумина добавляли 50 мкл фосфатного

буферного раствора и 30 мкл ферментного препарата. После перемешивания добавляли 20 мкл 2,5% раствора глутарового альдегида. Реакционную массу выдерживали при 4 с С в течение 4 часов. Полученную смесь объемом 7 мкл наносили на поверхность рабочего электрода и подсушивали в течение 40-50 минут.

Определение содержания спиртов модифицированным печатным электродом с иммобилизованным ферментом. Определение с помощью биосенсора проводили кюветным способом. В кювету при непрерывном перемешивании добавляли 2,00 мл буферного раствора, затем аликвоту анализируемых растворов спиртов (0,1М или 0,01М). За ответ принимали амплитуду отклика биосенсора в нА.

Результаты и обсуждение. Для установления возможности использования АО для определения спиртов с использованием печатных электродов, модифицированных БЛ, использовали метод анализа «в капле», при котором биокомпонент не иммобилизован на поверхности электрода, а добавляется в виде рабочего раствора. Изменение силы тока во времени регистрировали при постоянном приложенном потенциале 0 мВ. Ответы биосенсора приведены на рис. 1.

*

г

пГ

«

о

н

я

и

300

Рис. 1. Вид ответов биосенсора при добавлении 5, 10 и 20 мкл 0,1М раствора метанола при измерении «в капле»

Одна из проблем анализа в «капле» - низкая воспроизводимость результатов, что связано с форматом проведения анализа, и, прежде всего, с применением биокомпонента в растворе на поверхности печатного электрода.

Для получения коммерциализуемого в дальнейшем продукта необходимо создать стабильно работающие печатные электроды с закрепленным на поверхности ферментом АО. Для решения этой задачи применили различные методы иммобилизации АО: адсорбция белковых молекул фермента на поверхность электрода, ковалентное кроссшивание глутаровым альдегидом и капсулирование при формировании полимерной мембраны на рабочей поверхности электрода.

Биосенсорная система на основе печатного электрода с рецепторным элементом из адсорбированной АО работала нестабильно. Капсулирование АО с помощью создания на поверхности электрода полимерной пленки нафи-она также приводило к неудовлетворительным результатам, уже после 2-7 последовательных измерений полностью отсутствовал ответ биосенсора на спирт. Наилучшие результаты по сходимости и долговременной стабильности были получены для электродов, поверхность которых модифицировали гелем, образующимся в ходе кросс-сшивки белковых молекул фермента и бычьего сывороточного альбумина (БСА) глутаровым альдегидом. Возможно, это связано с высокой адгезионной способностью образовавшегося геля.

Для выбора рабочих условий функционирования биосенсора была определена зависимость ответа биосенсора от концентрации солей буферного раствора. В диапазоне рабочих значений концентрации солей буферного раствора от 5 до 70 мМ ответ биосенсора с учетом доверительных интервалов на эквивалентное содержание метилового спирта (0,12 мМ) оставался величиной постоянной.

Зависимость ответа биосенсора от pH буферного раствора представлена на рис. 2.

Для устойчивого функционирования электродов с БЛ производитель рекомендует использовать диапазон pH близкий к 7,0. Как видно из рис. 2, наибольшие ответы электрода, модифицированного АО, были получены при значениях pH 7,6-7,8.

Таким образом, в качестве рабочего раствора при проведении измерений рекомендуется использовать фосфатный буферный раствор с концентрацией солей от 5 до 70 мМ и pH 7,6-7,8.

Селективность биосенсорного анализа определяется, прежде всего, специфичностью биокомпонента. Известно, что дрожжевая алкогольоксидаза катализирует превращение целого ряда спиртов [8]. В работе была выполнена сравнительная характеристика параметров калибровочных зависимостей биосенсора по отношению к спиртам: метанолу, этанолу, пропанолу-1, пропанолу-2, буча 1 юлу-1. глицерину. Калибровочные зависимости ответов

3

й

н

и

я

н

о

ей

350

300 -

250 -

200 -

150 -

100 -

50 -

6,5

7,0 7,5

Величина pH

8,0

Рис. 2. Зависимость ответа биосенсора от значения pH фосфатного буферного раствора (концентрация метанола в кювете 0,12 мМ)

биосенсора (/) от концентрации спиртов (С) в аналитической кювете представлены на рис. 3.

Полученные калибровочные зависимости имели сигмоидальный вид. Из закона Фарадея следует, что сила тока пропорциональна скорости ферментативной реакции, поэтому для аппроксимации экспериментальных данных было применено трехпараметрическое уравнение Хилла, подобное уравнению ферментативной кинетики аллостерических ферментов:

т _ ^тах ‘ С

- КН + с1г ,

М

где I - ответ биосенсора (нА); с - концентрация спирта (мМ); Км — константа Михаэлиса ферментного электрода (мМ); 1тах — максимальный ответ биосенсора (нА); Ь — коэффициент Хилла или коэффициент кооператив-ности (для уравнения зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в описании кинетики ферментативных реакций).

300

1 0

• Метанол

о Этанол

▼ Пропанол-1

А Бутанол-1

■ Пропанол-2

Рис. 3. Калибровочные зависимости ответов биосенсора от концентрации спиртов в измерительной кювете

Нижние пределы обнаружения (в мМ) метанола, этанола, пропанола-1, бутанола-1, пропанола-2 составили соответственно 1.2-10-5,4.7-10_5,5-10-4, 1.1-10“3 и1.2-10“2.

Как и следовало ожидать, наибольшей чувствительностью биосенсор обладал по отношению к метанолу, который является природным субстратом дрожжевой алкогольоксидазы. При увеличении числа атомов углерода в первичных одноатомных спиртах наблюдали снижение специфической активности биосенсора. Значительно более низкие ответы получали при внесении в аналитическую систему вторичного спирта, а окисление многоатомного спирта - глицерина под действием алкогольоксидазы практически отсутствовало.

Одним из важных параметров калибровочных зависимостей биосенсоров являются константы Михаэлиса ферментных электродов (кажущиеся константы Михаэлиса), которые характеризуют свойства иммобилизованных ферментов, а также ограничивают линейный участок калибровочной зависимости сверху. В табл. 1 приведены рассчитанные из экспериментальных данных значения констант Михаэлиса ферментного электрода в сравнении со значениями констант Михаэлиса дрожжевой алкогольоксидаза, опубликованных другими авторами [9].

Таблица 1

Сравнение констант Михаэлиса ферментного электрода и дрожжевой

алкогольоксидазы в растворе

Субстрат а природным субстратом для этого фермента является метанол Константа Михаэлиса (Км), мМ

Ферментный электрод Литературные данные [9]

Метанол 4,0±0,6 2,15

Этанол 21±3 16,2

Пропанол-1 90±10 66

Пропанол-2 240І30 Нет данных

Бутанол-1 150І20 166

Таким образом, константы Михаэлиса ферментного электрода для спиртов различного строения близки по значениям константам фермента алкогольоксидазы в гомогенных условиях протекания реакции.

Одним из важнейших параметров биосенсора является его операционная стабильность. Биосенсоры, модифицированные Б Л и АО, показывали стабильные ответы на метанол. Стандартное отклонение для 12 последовательных измерений составило 15% (концентрация метанола в кювете 0,12 мМ).

В качестве перспективы практического использования на заключительном этапе исследования были проведены измерения содержания этанола в реальных образцах вин. Для анализа использовали 2 вида вин: красное «Кагор-32» (ООО «Витал», Ставропольский край) и белое «Улыбка Кубанки» (виноградное специальное десертное, ООО «POPO», PCO Алания, г. Владикавказ).

В качестве референтного метода использовали метод определения по ГОСТ [10], основанный на пикнометрическом определении объемной доли этилового спирта в винах (табл. 2).

Таблица 2

Результаты определения этанола в винах

Объект исследования Объемная доля этанола, %

Заявлено производите- лем Референтный метод Ферментный биосенсор

Вино белое «Улыбка Кубанки» 15-17 15,0±0,1 14,7±0,7

Вино виноградное красное «Кагор-32» 16 Нет данных 15,8±0,9

Таким образом, определение содержания этанола в винах с помощью биосенсора хорошо согласуются с референтным методом.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Выводы. Разработан макет амперометрического биосенсора для определения содержания спиртов на основе печатных электродов, модифицированных берлинской лазурью и алкогольоксидазой. Выявлено, что ответ биосенсора не зависит от концентрации буферного раствора в интервале концентрации солей от 5 до 70 мМ. Установлено оптимальное значение pH для функционирования биосенсора, которое составило 7,6-7,8. Показано, что биосенсор является селективным по отношению к первичным спиртам. Экспериментально рассчитанные значения констант Михаэлиса ферментного электрода близки по значениям к константам Михаэлиса дрожжевой алкогольоксидазы. Установлены нижние пределы обнаружения спиртов (в мМ), которые составили для метанола, этанола, пропанола-1, бутанола-1, пропанола-2 соответственно 1.2-10-5, 4.7-10-5, 5-10-4, 1.1-10-3 и1.2-10-2.

С помощью макета биосенсорной установки проведен анализ содержания этанола в винах, полученные данные хорошо согласуются с референтным методом. Таким образом, показано, что макет установки может быть полезен для создания в перспективе опытного образца биосенсора для определения спиртов.

Библиографический список

1. Мизгунова У.М. Ферментативные методы определения алифатических спиртов / У.М. Мизгунова, Т.Н. Шеховцова, И.Ф. Долманова. // Журнал аналитической химии. -1998. -Т. 53. № 10. -С. 1014-1029.

2. Azevedo A.M. Ethanol biosensors based on alcohol oxidase / A.M. Azevedo [etc.]. // Biosens. Bioelectron. -2005. -V. 21. -№ 2. -P. 235-247.

3. Karyakin A.A. Optimal Environment for Glucose Oxidase in Periluorosulfonated Ionomer Membranes: Improvement of First-Generation Biosensors / A.A. Karyakin [etc.]. // Anal. Chemistry. -2002. -V. 74. -№ 7. -P. 1597-1603.

4. Karyakin A. A. Prussian Blue Based Nanoelectrode Arrays for H2O2 Detection / A.A. Karyakin [etc.], // Anal. Chemistry. -2004. -V. 76. № 2. -P. 474-478.

5. Ricci F. Sensors and biosensor preparation, optimization and applications of Prussian Blue modified electrodes / F. Ricci, G. Palleschi. // Biosens. Bioelectron. -2005. -V. 21. № 3. -P. 389-407.

6. Verduyn C. Colorimetric alcohol assays with alcohol oxidase / Verduyn C., van Dijken J.P., Scheffers W.A. // J. Microbiol. Methods. -1984. -V. 2, -P. 15-25.

7. Справочник химика. В б т. Т. 3. Химическое равновесие и кинетика. Свойства растворов. Электродные процессы. 2-е изд., перераб. и доп. - Л.: Химия, 1964. - 1008с.

8. Грузман М.Б. Множественные молекулярные формы алкогольоксидазы метило-трофных дрожжей Pichia methanolica / М.Б.Грузман, В.И. Титоренко, В.В. Ашин и др. // Биохимия. -1996. -Т. 61. № 12. -С. 2131-2139.

9. Badea М. Catalytic properties of alcohol oxidase to oxidize aliphatic and aromatic alcohols / M. Badea, M.L. Arsene. // Prog. Catal. - 1996. - V. 5. -P. 45-50.

10. ГОСТ P 51653-2000. Алкогольная продукция и сырье для ее производства, основанный на пикнометрическом определении объемной доли этилового спирта. Метод определения объемной доли этилового спирта. -М. Изд-во стандартов, 2000. -5с.

Поступило 08.02.2008

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.