CC BY
29
СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ МИКРОБНОГО БИОСЕНСОРА НА ОСНОВЕ КЛЕТОК МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ И ОЦЕНКА ЕЕ
СЕЛЕКТИВНОСТИ
Воронова Е.А., Ильясов П.В., Решетилов А.Н.
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН E-mail: anatol(a),ibpm.pushchino. ru
Annotation
An evaluation of the possibility of the use of four methylotrophic yeast strains as the base of the biosensor receptor has been carried out. The optimal growth time characterizing the most active state of the cells has been determined. The selectivity of the sensor based on the strain Pichia augusta VKM Y-2518 was found to be comparable to the selectivity of the alcohol oxidase based sensor indicating that the sensor could be used for the selective ethanol assay.
Обеспечение материальных и социальных потребностей людей, охраны и получения природных богатств невозможно без использования микроорганизмов - живых «химических фабрик», которые способны превращать простые вещества в самые разнообразные продукты. Такая способность микроорганизмов, как и всех живых клеток обусловлена наличием в них различных ферментов. Так, в пероксисомах клеток метилотрофных дрожжей присутствует фермент алкогольоксидаза (АО), способный окислять первичные алифатические спирты до перекиси водорода и соответствующего альдегида. Клетки метилотрофных дрожжей могут служить биорецептором для биосенсора для анализа спиртов, при этом не уступать по специфичности ферментному сенсору на основе АО.
Целью данной работы является создание, исследование и сравнение каталитических свойств биорецепторов микробных сенсоров на основе клеток четырех штаммов метилотрофных дрожжей и ферментного сенсора на основе фермента АО.
В настоящей работе с целью оценки алкогольокисляющей активности клеток на различных стадиях культивирования штаммов-продуцентов АО были построены кривые роста для метилотрофных дрожжей Pichia augusta ВКМ Y-1397, Р. augusta ВКМ Y-2518, Р. augusta ВКМ Y-2559 и получены зависимости ответа от времени роста клеток для двух преимущественных субстратов АО - метанола и этанола.
Результаты проведенного исследования показали, что оптимальное время роста клеток, составило 27 часов для Р. augusta ВКМ Y-1397 (что соответствует стадии замедления роста), 14 часов - для Р. augusta ВКМ Y-2518 (соответствует экспоненциальной стадии роста) и 25 часов - для Р. augusta ВКМ Y-2559 (соответствует стадии замедления роста).
Была произведена оценка субстратной специфичности сенсоров на основе 4-х штамов микроорганизмов и на основе фермента АО. Сенсоры на основе штаммов Р. augusta ВКМ Y-2559, Y-1397, Hansenula polymorpha NCYC 495 ln давали ответ, помимо целевых субстратов (метанола и этанола), на бутанол, пропанол, изопропанол, глюкозу, глицерин. Штамм Р. augusta ВКМ Y-1397 также характеризовался чувствительностью к сорбиту и сорбозе. Наиболее узкой субстратной специфичностью в сочетании с высокими абсолютными значениями ответа на этанол обладал штамм Р. augusta ВКМ Y-2518. Кроме того, для него было отмечено минимальное время роста клеток. Указанные параметры делают данный штамм наиболее перспективным и обуславливают его выбор для дальнейших исследований.
Сенсор на основе препарата АО имеет довольно узкую субстратную специфичность. Основными определяемыми субстратами для него являются метанол и этанол; сенсор также дает незначительный ответ на пропанол, бутанол и глицерин и нечувствителен к присутствию глюкозы. Таким образом, селективность сенсора на основе АО сопоставима с селективностью сенсора на основе Р. augusta Y-2518. Таким образом, сенсор на основе клеток метилотрофных дрожжей может быть использован для клинических (определение спирта в крови и сыворотке, а также в парах выдахаемого воздуха), наркологических и природоохранных целей.
