CC BY
157
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2012. Вып. 2. С. 219-225 Химия
УДК 543.07:579.22:543.9
Выделение фермента алкогольоксидазы из клеток метилотрофных дрожжей родов Pichia, Hansenula, Candida *
М. Г. Зайцев, В. И. Владимиров, Е. М. Журикова, М. Ю. Ильницкий
Аннотация. В работе предложена методика выделения и очистки ферментного препарата алкогольоксидазы из дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2518, Pichia angusta ВКМ Y-2559, Pichia angusta ВКМ Y-1397, Hansenula polymorpha NCYC 495 ln, Candida boidinii ВКМ Y-2356 с применением современного биоаналитического оборудования. Показано, что наибольшем значением удельной активности и максимальным содержанием белка в конечном препарате обладает алкогольоксидаза, выделенная из дрожжей Hansenula polymorpha NCYC 495 ln.
Ключевые слова: дрожжи, выделение и очистка фермента, активность фермента, алкогольоксидаза.
Введение
Для определения микроколичеств алифатических спиртов применяют в основном методы газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Реже используют методы спектрофотометрии, рефрактометрии. Однако, несмотря на низкие пределы обнаружения спиртов, общими недостатками этих методов являются сложность применяемого оборудования, в некоторых случаях — пробоподготовки, а также длительность анализа.
В то же время для определения спиртов успешно применяют ферментативные методы, сочетающие высокую чувствительность (пределы обнаружения спиртов 1 • 10-6 — 1 • 10-4 М) и селективность с простотой аппаратурного и методического оформления, экспрессностью и экономичностью.
В последние годы всё больше растёт интерес к перпективному направлению — биорецепторным элементам на основе фермента
* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», госконтракт № 16.740.11.0766.
алкогольоксидазы, что приводит к необходимости получения высококачественного биоматериала в достаточных количествах. Ферментные сенсоры для оценки содержания этанола могут быть основаны как на алкогольоксидазе (АО), так и на алкогольдегидрогеназе (АДГ), иммобилизованной на соответствующем преобразователе. Биосенсоры на основе АО в отличие от АДГ сенсоров не требуют добавления кофакторов, поскольку кофермент ФАД связан с АО. Источником АО, как правило, служат дрожжи Candida boidini, Pichia pastories, Pichia angusta, Hansenula polymorpha и некоторые другие [1]. В связи с этим актуальной задачей является отработка методики выделения и очистки алкогольоксидазы из метилотрофных дрожжей с применением современного и экономичного биоаналитического оборудования на основе автоматизированной модульной системы для разделения и очистки белков, которую можно использовать для масштабного получения биопрепарата.
В данной работе было проведено выделение и очистка фермента алкогольоксидазы изклеток метилотрофных дрожжей родов Pichia, Hansenula и Candida.
Материалы и методы
В работе были использованы 5 штаммов метилотрофных дрожжей: Pichia angusta ВКМ Y-2518, Pichia angusta ВКМ Y-2559, Pichia angusta ВКМ Y-1397, Hansenula polymorpha NCYC 495 ln, Candida boidinii ВКМ Y-2356 Все используемые микроорганизмы были предоставлены лабораторией Биосенсоров ИБФМ РАН (г. Пущино). Клетки были выращены на богатой среде по методике, описанной в [2]. Собранную биомассу хранят при 4°С. Алкогольоксидаза была выделена из клеток метилотрофных дрожжей согласно модифицированной методике, представленной в [3].
Методика определения концентрации белка
Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда на спектрофотометре СФ-103 при длине волны 595 нм [4]. Для построения градуировочного графика использовали серию растворов БСА известной концентрации. Определение активности алкогольоксидазы проводили по модифицированной методике [4].
В измерительную кювету вносили 990 мкл рабочего реактива, 5 мкл раствора фермента, приготовленного в растворе фосфатного буфера, рН = 7.6, и 5 мкл 10М метанола.
Методика определения удельной ферментативной активности
Измерения активности АО проводили спектрофотометрически на СФ-103, интегрированном с ПК, при длине волны 420 нм. В кювету помещали
2,85 мл рабочего реактива и 5 мкл исследуемого раствора белка. Затем приливали 10 мкл водного раствора метанола и включали режим измерения.
Получали кинетические кривые окисления хромогена АБТБ для всех исследуемых образцов. Затем находили тангенс угла наклона линейного участка и вычисляли активность по следующей формуле
tg а • V
Е / мг белка =
е ■ l ■ Шф ’
где tg а — тангенс угла наклона линейного участка; V — объем раствора в кювете, см3; е — молярный поглощения, равный для АБТБ = 43,2 ммоль-1 см-1; I — толщина кюветы, см; т,ф — масса общего белка в пробе, мг.
Результаты и обсуждение
Для выделения алкогольоксидазы в работе использовали 5 штаммов метилотрофных дрожжей P. angusta Y-2518, P. angusta Y-1397, P. angusta Y-2559, H. polymorpha NCYC495 ln, C. boidinii ВКМ Y-2356.
Клетки метилотрофных дрожжей были выращены на богатой среде. В качестве ростового субстрата на начальном этапе роста использовался глицерин. Собранная биомасса представляла собой суспензию светло желтого цвета без посторонних включений с характерным дрожжевым запахом.
Дрожжевые клетки были разрушены на ультразвуковом дезинтеграторе. В результате был получен гомогенат биомассы бледно-желтого цвета. Полученную суспензию центрифугировали при температуре 8°C и 8000 об/мин, с целью получения бесклеточного экстракта (супернатанта), который ступенчато фракционировали сульфатом аммония. После первого высаливания для дальнейшей работы отбирали надосадочную жидкость, а белковую пасту, содержащую осажденные белки — удаляли. При втором высаливании (60% от насыщенного содержания сульфата аммония) белковую пасту, содержащую целевой белок, осаждали центрифугированием и использовали для дальнейшей работы.
Очистку ферментного препарата от сторонних белков осуществляли на ионообменной колонке с использованием автоматической хроматографической установки Biologic LP. Препарат АО наносят на колонку со скоростью 0,5мл в минуту 60 мМ калий фосфатным буфером, pH 7.6 в течение 25 минут. Через колонку с адсорбированными белками пропускают смесь буферного раствора и 1M KCl с линейно возрастающей концентрацией хлорида калия.
На рис.1 представлен график зависимости изменения показаний УФ и кондуктометрических датчиков при увеличении концентрации KCl в растворе. На графике по шкале X откладывается время в минутах, а также специальными точками отмечается номер пробирки, в которую в данный момент времени отбирается проба. На шкале Y
Рис. 1. Зависимость показаний УФ и кондуктометрических датчиков от концентрации КС1 в промывном растворе
слева откладывается показания УФ датчика — оптическая плотность, а справа — показания кондуктометрического датчика. Для данной хроматограммы интервалу времени 42 - 63 минут соответствует пик показаний УФ-датчика — резкое изменение оптической плотности. Наблюдается линейное увеличение показаний кондуктометрического детектора, скачка показаний не происходит, это обусловливается тем, что влияние на электропроводность раствора оказывает только содержание ионов солей. С помощью специального программного обеспечения, установленного на установке Biologic LP, можно устанавливать скорость подачи растворов и объём, отбираемый в каждую из пробирок. Зная условия проводимого процесса хроматографии (в данном случае градиент концентрации KCl, в приделах от 0 до 100% исходного раствора KCl (1M)) можно вычислить интервал концентрации KCl, соответствующий скачку оптической плотности и соответственно десорбции целевого белка. Для последующего сбора фермента отобрали пробирки, которые входили в область скачка оптической плотности на хроматограмме, — 10 пробирок, по 2 мл раствора в каждой.
Поскольку молекулярная масса алкогольоксидазы составляет более 600 кДа [5], собранный фермент можно дополнительно сконцентрировать, с использованием концентрирующих центриконов с фильтром на 100 КДа на центрифуге при 13400 об/мин, в течение 30 минут. Сконцентрированный фермент представляет собой вещество светло — желтого цвета.
На разных стадиях процесса выделения алкогольоксидазы определяли концентрацию фермента в пробах по методу Бредфорда. Используя серию
стандартных растворов БСА, построили градуировочную зависимость оптической плотности от содержания белка в анализируемой пробе
Полученное уравнение зависимости оптической плотности от концентрации растворов БСА: у = 0,157 + 0, 0005ж.
Значение оптической плотности определяли для ферментных препаратов, выделенных из каждого штамма метилотрофных дрожжей, используемых в работе, и, исходя из уравнения зависимости, рассчитали содержание белка по следующей формуле ^ 0 157
С == .
0,0005
Для определения активности алкогольоксидазы измеряли скорость окисления метанола. В ходе реакции выделяется пероксид водорода, который окисляет краситель ЛБТ8(2,2’-азинобис-3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) Окисление красителя регистрировали спектрофотометрически при длине волны 420 нм. Для полученных зависимостей оптической плотности от времени, определяли тангенс угла наклона линейного участка 0^ а).
Значения удельной активности ферментного препарата вычисляли по формуле
л і ^ tgа ■ 3 см3
А/мг белка = --------к------- ------------- ■ 1000.
43, 2 см2/ммоль/л ■ 1 см ■ тф мг
Значения удельной активности и содержание белка в ферментных препаратах алкогольоксидазы, выделенной из различных дрожжевых штаммов представлены в табл.1.
Таблица 1
Значения удельной активности и содержание белка в ферментных препаратах алкогольоксидазы , выделенной из различных штаммов метилотрофных дрожжей
№ Название штамма-продуцента АО Содержание белка, мг/мл Удельная активность фермента, Е/мг белка
1 РіеНіа аидивЬа ВКМ У-2518 42 46
2 РіеНіа аидивЬа ВКМ У-2559 25 17
3 РіеНіа аидивЬа ВКМ У-1397 35 15
4 Иапвєпиіа ро1утогрЬ,а NCYC 495 1п 50 55
5 Єаиіііа Ьвіііиіі ВКМ У-2356 38 5
Таким образом, удельная активность АО, выделенной из штамма Иапзепп1а ро1ушотрЬа КСУС 495 1п выше удельной активности АО, выделенной из других исследуемых штаммов. Большое содержание белка и высокая активность выделенного фермента свидетельствуют о
переспективности использования данного штамма для получения препарата алкогольоксидазы.
Выводы
• В ходе работы была выделена алкогольоксидаза из 5 штаммов метилотрофных дрожжей: P. angusta Y-2518, P. angusta Y-1397, P. angusta Y-2559, H. polymorpha NCYC495 ln, C. boidinii ВКМ Y-2356.
• Определены содержание белка и удельная активность для выделенного фермента. Полученные значения удельной активности хорошо согласуется с литературными данными [5,6].
• На основании величины значения удельной активности выделенного фермента, а также максимального содержания белка в конечной ферментном препарате, наиболее подходящим штаммом для выделения алкогольоксидазы можно считать Hansenula polymorpha NCYC 495 ln.
Список литературы
1. Metabolically engineered methylotrophic yeast cells and enzymes as sensor biorecognition elements / M. Gonchar [et al.] // FEMS Yeast Research. 2002. V.2. P.307-314.
2. Yeast Biotechnology: Diversity and Applications / edited by. Satyanarayana T., Kunze G. 2009. 744 p.
3. Ashin V.V., Trotsenko Y.A. Alcohol oxidase of the methylotrophic yeasts: new findings // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2000. V.10, №1-3. P.295-303
4. Справочник биохимика: Пер.с англ. / Р. Досон [и др.]. М.: Мир, 1991.
5. Павлишко Г.Н., Гайда Г.З., Гончар М.В. Алкогольоксидаза и ее биоаналитическое применение // Вестник. Львов УН-ТУ. Биологическая серия. 2004. Т.35. С.3-2.
6. Bystrykh L.V., Dvorakova J., Volfova O. Alcohol oxidase of methylotrophic thermo-and acidotolant yeast Hansenula sp. // Folia Microbol. 1989 V.34, №1. P.233-237.
Зайцев Максим Геннадьевич (bergamot86@mail.ru), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Владимиров Василий Игоревич, студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Журикова Елена Михайловна, студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.
Ильницкий Максим Юрьевич, студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Isolation of the alcohol oxidase from the methylotrophic yeast cells genera Pichia, Hansenula, Candida
M. G. Zaitsev, V. I. Vladimirov, E. M. Zhurikova, M. Yu. Ilnitskiy
Abstract. This paper proposed a method for the isolation and purification of the enzyme preparation alcohol oxidase from Pichia angusta BKM Y-2518, Pichia angusta BKM Y-2559, Pichia angusta BKM Y-1397, Hansenula polymorpha NCYC 495 ln, Candida boidinii BKM Y-2356 with modern bioanalytical equipment. The preparation Alcohol oxidase, isolated from the yeast Hansenula polymorpha NCYC 495 ln has an the the greatest value of the specific activity and the maximum protein concentration.
Keywords: yeasts, isolation and purification of enzyme, enzyme activity, alcohol oxidase.
Zaitsev Maxim (bergamot86@mail.ru), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Vladimirov Vasiliy, student, department of chemistry, Tula State University.
Zhurikova Elena, student, department of biotechnology, Tula State University.
Ilnitskiy Maxim, student, department of chemistry, Tula State University.
Поступила 25.06.2012
