CC BY
41
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
27. Saito S., Sasaki Y., Sakai M. CD4+CD25high regulatory T cells in human pregnancy // J. Reprod. Immunol. - 2005. - Vol. 65. - P. 111-120.
28. Steinman R. M. The dendritic cell system and its role in immuno-genicity // Annu. Rev. Immunol. - 1991. - Vol. 9. - P. 271-296.
29. Tafuri A., Alfering J., MollerP. et al. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy // Science. - 1995. - Vol. 270. - P. 630-633.
30. Talayev V. Yu., MatveichevA. V., LomunovaM. A. et al. The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T-cell stimulating ability of dendritic cells in vitro // Clin. Exp.
Immunol. - 2010. - Vol. 162, N 1. - P. 91-99.
31. Tarrade A., Kuen R. L., Malassin@e A. et al. Characterization of human villous and extravillous trophoblasts isolated from first trimester placenta // Lab. Invest. - 2001. - Vol. 81. - P. 11991211.
32. Zenclussen A. C., Gerlof K., Zenclussen M. L. et al. Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion: adoptive transfer of pregnancy-induced CD4+CD25+ T regulatory cells prevents fetal rejection in a murine abortion model // Am. J. Pathol. - 2005. - Vol. 166. - P. 811-822.
Поступила 27.07.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.017.1.014.083
М. Э. Цатуров, В. Ю. Талаев, А. В. Матвеичев, М. В. Плеханова, И. Е. Зайченко,
О. Н. Бабайкина, М. А. Помунова
эффекты последовательного и конкурентного взаимодействия обычных моноцитарных дендритных клеток и дендритных клеток, обработанных индукторами толерогенности, с аллогенными лимфоцитами
ФБУН Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И. Н. Блохиной Роспотребнадзора (603950, Нижний Новгород, ул. грузинская, д. 44)
Работа поддержана РффИ, проект 10-04-00304
Показано, что инкубирование созревающих дендритных клеток (ДК) новорожденных детей с интерлейкином (ИЛ)-10 или с дексаметазоном (ДЕКС) приводит к частичному сохранению экспрессии CD14 и существенному снижению экспрессии молекул костимуляции. Модулированные ДЕКС и ИЛ-10 ДК детей и взрослых утрачивают способность стимулировать пролиферацию и продукцию интерферона (ИФН)^ аллогенными лимфоцитами, причем лимфоциты после контакта с такими клетками снижают свою способность отвечать на повторную стимуляцию теми же аллоантигенами. В то же время модулированные ДК детей не подавляют пролиферацию и цитокинопродукцию лимфоцитов при конкурентном взаимодействии с обычными ДК, тогда как модулированные ДЕКС ДК взрослых в аналогичных условиях угнетают продукцию ИФН-y.
Ключевые слова: дендритные клетки, толерогенность, глюкокортикоиды, Т-лимфоциты
Tsaturov ME., Talaev V.Yu., Matveichev A.V., Zaichenko I.E., Babaikina O.N., Lomunova M.A. EFFECTS OF COGNITIVE AND COMPETITIVE INTERACTIONS OF NATIVE MONOCYTE-DERIVED DENDRITIC CELLS AND DENDRITIC CELLS TREATED BY TOLEROGENIC INDUCERS WITH ALLOGENOUS LYMPHOCYTES
It has been shown that incubation of the maturing dendritic cells from the newborn infants with interleukin-10 or dexamethasone ensured partial preservation of CD14 expression and resulted in a significant decrease of the expression of co-stimulation molecules. Dendritic cells from the children and adult subjects lost the ability to stimulate proliferation and production of interferon-gamma in allogenous lymphocytes. The lymphocytes that had been in contact with such cells in their turn showed the impaired ability to respond to the repeated stimulation by the same allo-antigens. At the same time, the modulated dendritic cells of the children failed to suppress proliferation and cytokine production by lymphocytes under conditions of competitive interaction with their native counterparts whereas dexamethasone-modulated dendritic cells from adult subjects inhibited production of interferon-gamma in analogous conditions.
Key words: dendritic cells, tolerogenicity, glucocorticoids, T-lymphocytes
Одним из самых важных звеньев в механизме иммунного ответа и регуляции гомеостаза иммунной системы являются дендритные клетки (ДК). Термином ДК объединяются несколько субпопуляций клеток иммунной системы с различными, а порой и кардинально противоположными свойствами. Наиболее общей функцией ДК является презентация
Талаев Владимир Юрьевич - д-р мед. наук, зав. лаб.
антигена Т-лимфоцитам. Выполняя эту функцию, типичная зрелая ДК вовлекает антигенспецифические Т-лимфоциты и, в частности, наивные Т-лимфоциты в реакции иммунного ответа. В то же время ДК с определенными так называемыми толерогенными свойствами могут выполнять роль негативных регуляторов иммунного ответа и участвовать в формировании иммунологической толерантности, в первую очередь толерантности к тканям собственного организма. Такое важное явление, как сохранение полуаллогенного
- 29 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
плода при нормально протекающей беременности у млекопитающих, также не обходится без вмешательства ДК со специфическими свойствами. И наконец, заслуживают внимания механизмы выработки толерантности к определенным антигенам при их искусственном введении в организм, а также толерогенный эффект некоторых препаратов со способностью модулировать свойства ДК.
Существует несколько типов ДК, различие которых обусловлено тканевой локализацией, происхождением и условиями, в которых проходили диф-ференцировка и созревание ДК. В данной статье мы будем рассматривать ДК миелоидного ряда, дифференцировавшиеся из моноцитов. Как уже отмечалось выше, типичные миелоидные ДК играют ключевую роль в активации лимфоцитов. Это свойство ДК связано со способностью захватывать, процессировать и презентировать антигены в составе молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) II класса, а также перекрестно презентировать их в составе ГКГ I класса. Взаимодействие между костимуляторными молекулами CD80 и CD86 с молекулой CD28, экспрессируемой на мембране Т-лимфоцитов, является обязательным условием для оптимальной активации последних [8]. В незрелом состоянии ДК экспрессируют молекулы CD80 и CD86 на низком уровне. Активация ДК паттернами микробного происхождения, такими, как, например, липополисахарид (ЛПС), посредством tool-подобных рецепторов (TLR) приводит к промежуточному созреванию ДК, что проявляется существенным повышением экспрессии молекул костиму-ляции. Терминальное созревание ДК происходит при непосредственном контакте ДК с Т-лимфоцитами. Взаимодействие осуществляется через связывание CD40 и CD154 (CD40L). Созревание, индуцированное этими двумя механизмами, подразумевает вовлечение в эти процессы фактора транскрипции NF-кВ и р38 МАР-киназного пути [3, 10].
Помимо созревания типичных ДК со стимулирующими свойствами, путь развития части ДК может приводить к выработке у них толерогенных свойств. В результате такие ДК приобретают способность вызывать анергию и даже апоптоз контактирующих с ними Т-лимфоцитов, а также стимулировать созревание и активность регуляторных Т-клеток (Т-рег) - супрессоров иммунного ответа. Не совсем ясны механизмы, посредством которых презентация антигена ДК ведет к прямо противоположным эффектам на Т-лимфоциты. При этом не исключается зависимость этих процессов от стадии созревания ДК [4, 7, 9]. Ранее высказывались предположения о том, что индукция толерантности есть результат дефектного пути активации Т-лимфоцитов незрелыми ДК с низкой костимулирующей функцией, контакт с которыми приводит к выработке анергии у Т-лимфоцитов [2]. По-видимому, данный механизм имеет значение для толерантности, индуцированной незрелыми ДК в тканях, в которых отсутствует инфекция и не развилось воспаление. Более поздние исследования, однако, наводят на мысль о том, что индукция толерантности является активным процессом, требующим, по данным разных авторов, продукции ДК таких специфических молекул, как интерлейкин (ИЛ)-10, индоламин-2,3-диоксигеназа, В7-Н1, ILT3, индуцибельный костиму-
ляторный лиганд (ICOSL), PD-L1, и др. [8, 12, 14]. Такие молекулы могут продуцироваться при созревании ДК по альтернативному пути, приводящему к образованию так называемых полузрелых ДК. Эти процессы могут быть индуцированы локальной продукцией ИЛ-10, трансформирующего фактора роста в (ТФРв), введением в культуру моноцитов глюкокортикоидов или других индуцирующих толерогенность соединений. Значительный вклад в появление толерогенных свойств у ДК вносят Т-рег. Эти механизмы не взаимоисключаемы, поскольку ИЛ-10 и ТФРв продуцируются, в частности Т-рег [5, 9, 22].
В данной работе исследовали формирование толе-рогенных свойств у ДК новорожденных детей и взрослых под действием ИЛ-10 и синтетического глюкокортикоида дексаметазона (ДЕКС). Глюкокортикоиды - гормоны коры надпочечников с широким спектром биологической активности, включая противовоспалительное и иммуносупрессорное действие [2, 4]. Созданные на их основе медицинские препараты широко используются при различных отклонениях в работе иммунной системы, приводящих к неконтролируемой активации иммунокомпетентных клеток, особенно при аутоиммунных заболеваниях, аллергиях и реакциях отторжения аллотрансплантанта. Первоначально внимание исследователей было сфокусировано на эффекте глюкокортикоидов по отношению к Т-лимфоцитам, что объясняло их терапевтические свойства, но результаты более поздних исследований показали иннгибирующее воздействие также и на ДК. В частности, глюкокортикоиды изменяют ход созревания ДК при ответе на лиганды TLR и на CD40L. При этом они снижают экспрессию молекул CD80 и CD86, подавляют продукцию ИЛ-12 и стимулируют продукцию ИЛ-10 [13, 20, 21]. Синтетический аналог глюкокортикоидов ДЕКС оказывает действие на ЛПС-индуцированное созревание ДК. Особенно мощный эффект наблюдается при совместном использовании ДЕКС и 1а-дигидроксида витамина D3. Моноцитарные ДК, дифференцировка которых проходила в присутствии ДЕКС и 1а-дигидроксивитамина D3, после активации ЛПС имеют низкие стимулирующие свойства по отношению к аллогенным лимфоцитам, схожие со свойствами незрелых ДК, однако в отличие от последних они активно продуцируют ИЛ-10 и синтезируют мРНК молекул ILT4 [15, 18].
Материалы и методы. ДК получали из моноцитов пуповинной крови здоровых доношенных новорожденных и венозной крови здоровых взрослых лиц. Из проб стерильной гепаринизированной крови выделяли мононуклеарные клетки над слоем Hystopaque-1077 («Sigma», США), клетки отмывали средой DME («Sigma», США) и готовили суспензию клеток концентрацией 5 • 106 клеток/мл на среде DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («Биолот», Санкт-Петербург). Клетки засевали в 24-луночные планшеты («Costar», США) и инкубировали 3 ч при 37oC и 5% СО. Затем неадгезировавшиеся клетки осторожно смывали с поверхности пластика тремя порциями среды DME, в лунки с моноцитами вносили среду DME с 10% ЭТС, L-глутамином, в-меркаптоэтанолом и пируватом натрия. Для индукции созревания ДК в лунки добавляли рекомбинантные ГМ-КСФ (100 нг/мл; «Biosource», США) и ИЛ-4 (20 нг/мл; «Sigma», США). В отдельные лунки с указанными выше стимуляторами вносили натриевую соль фосфата ДЕКС (0,4 мкг/мл; KRKA, «Словения») или рекомбинантный человеческий ИЛ-10 (20 и 100 нг/мл; «Biosource», США). Моноциты, росшие без всех цитокинов и ДЕКС, использовали в качестве контро-
- 30 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ля. На 3-и сутки культивирования к созревающим ДК повторно добавляли ИЛ-4 и ГМ-КСФ и клетки культивировали еще 3 сут, в результате чего получали незрелые ДК.
Для постановки двухстадийной смешанной лимфоцитарной реакции (СЛР) незрелые ДК разделяли на две части: одна часть клеток (обычные ДК и ДК, которые культивировали в присутствии ДЕКС или ИЛ-10) в дальнейшем использовали для первого этапа стимуляции аллогенных лимфоцитов, другую (только обычные ДК) - для второго этапа. К ДК для первого этапа добавляли стимуляторы терминального созревания: ЛПС Salmonella typhi (1 мкг/мл; отраслевой стандарт образца пирогена, ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Москва) и/или рекомбинантный фактор некроза опухоли а (ФНОа) (10 нг/ мл; «Sigma», США). В культуры ДК для второго этапа вновь добавляли ИЛ-4 и ГМ-КСФ. ДК для первого этапа инкубировали с ФНОа и/или ЛПС 1 сут, затем собирали, дважды отмывали и добавляли к аллогенным лимфоцитам взрослых здоровых лиц. Для этого лимфоциты венозной крови засевали в лунки 24-луночных планшетов в среде DME с 10% ЭТС и L-глутамином в концентрации 1,5 • 106 клеток/мл и в часть лунок добавляли ДК в концентрации 6 • 104 клеток/ мл. Культивировали в течение 4 сут, затем клетки собирали, осаждали центрифугированием и пересевали в свежей среде в 96-луночные планшеты (содержимое 1 лунки 24-луночного планшета в 3 лунки 96-луночного) с добавлением новой порции ДК, предназначенных для второго этапа стимуляции. Для второго этапа использовали ДК, которые культивировали в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 10 сут плюс 1 сут в присутствии ЛПС и ФНОа.
По истечении 3 сут пробы среды из культур клеток собирали для определения содержания в ней интерферона (ИФН-у) и для оценки пролиферации в лунки добавляли по 0,5 мк Кюри меченного тритием метилтимидина («Изотоп», Санкт-Петербург) на 24 ч. После культивирования планшеты замораживали, размораживали, хроматин клеток переносили на стекловолокнистые фильтры («Titertek», США) и анали-
зировали с помощью р-сцинцилляционного счетчика СБС-2. Результаты выражали в импульсах в 1 мин (имп/мин). Продукцию ИФН оценивали с помощью иммуноферментных тест-систем ИФА-ИФН-у («Вектор-Бест», Новосибирск).
Наряду с описанным выше двухэтапным вариантом СЛР в работе также изучали вариант реакции, в которой к лимфоцитам одновременно добавляли как обычные ДК, так и ДК, модулированные ДЕКС или ИЛ-10. Для сравнения использовали варианты культур лимфоцитов без добавления ДК, а также с добавлением только обычных или только модулированных ДК. Все варианты ДК были получены инкубированием моноцитов с ИЛ-4 и ГМ-КСФ в течение 6 сут с модуляторами или без них, а затем стимуляцией ЛПС или ФНОа в течение 1 сут. При постановке СЛР концентрация лимфоцитов составляла 1,5 • 106 клеток/мл. Каждый из типов ДК вносили к лимфоцитам в концентрации 6 • 104 клеток/мл. Все варианты культур засевали в триплетах в 96-луночные планшеты. Пробы для определения содержания ИФН-у отбирали через 3 сут после засева и в лунки вносили меченный тритием метилтимидин на следующие 24 ч.
Для исследования экспрессии мембранных маркеров использовали обычные и модулированные ДК, росшие 7 сут с ИЛ-4 и ГМ-КСФ, а затем - 2 сут с ЛПС и ФНОа. Клетки окрашивали моноклональными антителами к HLA-DR, CD14 («Иммуносорбент», Москва), CD80, CD86 («Beckman Coulter Corp.», Франция) и CD83 («BD Biosciences Immunocytometry Systems», США), меченными ФИТЦ или фикоэритрином. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитоф-люориметре FacsCalibur («BD Biosciences Immunocytometry Systems», США) в режиме двухцветной цитометрии. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения CellQuest и WinMDI 2.8.
Результаты. В данной работе ДК получали из моноцитов венозной крови взрослых лиц и пуповинной крови новорожденных детей культивированием с ИЛ-4 и ГМ-КСФ, а затем с ЛПС и ФНОа. Далее такие клетки обозначены, как обычные ДК. В отдельные варианты культур в соответствии с задачами экспериментов, помимо стимулирующих цитокинов и активаторов созревания, добавляли вещества с модулирующей активностью: ИЛ-10 (далее эти клетки обозначены как ДК-ИЛ-10) или синтетический аналог глюкокортикоидов ДЕКС (клетки обозначены как ДК-ДЕКС).
Культивирование моноцитов при различных условиях приводило к приобретению характерных морфологических признаков, варьирующих в зависимости от использованных модуляторов (рис. 1, а). Практически во всех культурах размер клеток увеличивался в 1,5-2 раза, заметно возрастало количество гранул в цитоплазме. В культурах обычных ДК наблюдали кластерные скопления клеток, имеющих отчетливую дендритную морфологию (риа 1, б). По краям плазмалеммы клеток появлялись короткие тонкие отростки, видимые в микроскоп с модуляционным фазовым контрастом. Культуры ДК-ДЕКС существенно отличались от описанных
Рис. 1. Микрофотографии культур ДК, полученных из моноцитов культивированием в течение 7 сут в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ и активацией ФНОа ЛПС в течение 2 сут. а - моноциты, культивировавшиеся без стимуляторов созревания; б - обычные ДК; в - ДК-ДЕКС; г - ДК-ИЛ-10. Ув. 200, модуляционный фазовый контраст.
- 31 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
%
%
CD14 | CD83 | CD86 ИЛ-10
Обычные ДК
Модулированные ДК
Рис. 2. Количество (в %) обычных ДК детей и взрослых (верхняя диаграмма), несущих мембранные молекулы CD14, CD80, CD83, CD86 и HLA-DR, и нижняя диаграмма - фенотип модулированных ДК новорожденных детей.
Звездочка - статистически значимые отличия ДК новорожденных от ДК взрослых.
выше - абсолютно не наблюдали кластеров, при этом клетки крайне прочно адгезировались на пластике, имея, как правило, звездчатую или реже веретеновидную форму (рис. 1, в). Применение ИЛ-10 в качестве модулятора на этапе созревания ДК приводило к появлению большого количества веретеновидных клеток, прочно сцепленных с пластиком планшет (рис. 1, г).
В результате анализа фенотипа полученных клеток с использованием лазерной проточной цитофлюори-метрии установили, что на мембране обычных ДК детей и взрослых увеличивалась плотность экспрессии молекул антигенпрезентации и костимуляции (данные не приведены) и возрастал процент клеток, несущих молекулы CD80, CD83 и CD86 (рис. 2). Экспрессия моноцитарного маркера - молекулы CD14, напротив, резко снижалась и, как правило, проявлялась не более чем на 4% клеток. Существенных различий фенотипа ДК детей и взрослых не отметили, за исключением несколько меньшего уровня экспрессии CD86 на ДК новорожденных (см. рис. 2).
Культивирование созревающих ДК с ДЕКС или ИЛ-10 существенно изменяло фенотип клеток. Так, культуры ДК-ДЕКС новорожденных характеризовались повышенным содержанием CD14+-клеток (61,7 ± 7%). Уровень клеток, позитивных по данному маркеру в культурах ДК-ИЛ-10 при использовании ИЛ-10 в концентрации 100 нг/мл, также оказался повышенным, но был в 2 раза ниже, чем в ДК-ДЕКС. Культуры ДК-ИЛ-10 новорожденных не отличались от обычных ДК по содержанию СD86-позитивных клеток. Влияние ДЕКС на экспрессию этой костимулирующей молекулы, как и ожидалось, оказалось супрессорным, и доля CD86+ ДК-ДЕКС не превышала 45,3%. Экспрессия CD83 модулированными ДК новорожденных подчинялась иным закономерностям, и наибольший супрессивный эффект на экспрессию этой молекулы продемонстрировал ИЛ-10. При воздействии ИЛ-10 на стадии созревания ДК происходило резкое падение экспрессии CD83 до нескольких процентов, тогда как в культурах ДК-ДЕКС доля СD83+-клеток была достоверно снижена, но оставалась на уровне 15,6% (см. рис. 2).
Таким образом, инкубирование созревающих ДК с ИЛ-10 и ДЕКС замедляло созревание ДК, что проявлялось в сохранении CD14, и приводило к формированию так называемого толерогенного фенотипа, характеризующегося низким уровнем экспрессии молекул костимуляции.
С целью изучения функциональных особенностей обычных и модулированных ДК новорожденных и взрослых применяли СЛР с аллогенными лимфоцитами. Культивирование лимфоцитов с ДК проводили в течение 4 сут. Обычные ДК продемонстрировали мощную стимулирующую активность по отношению к аллогенным лимфоцитам, что проявлялось в значительном увеличении пролиферации и продукции ИФН-у (рис. 3). ДК-ДЕКС были практически лишены митогенной активности, а также способности к индукции ИФН-у, ДК-ИЛ-10 не обладали митогенной активностью, но сохраняли способность стимулировать продукцию ИФН-у. Такие особенности были характерны для модулированных ДК как взрослых, так и детей.
При совместном культивирование аллогенных лимфоцитов со смесью модулированных и обычных ДК выявили различия в свойствах ДК взрослых и детей. Показано, что при конкурентном взаимодействии модулированных и обычных ДК новорожденных детей не наблюдается подавления пролиферации и продукции ИФН-у лимфоцитами, тогда как ДК-ДЕКС взрослых при конкуренции с обычными ДК подавляли продукцию ИФН-у при использовании ФНОа в качестве активатора ДК (см. рис. 3). Подавления пролиферативного ответа в культурах, в которых конкурентно взаимодействовали модулированные и обычные ДК, как взрослых, так и детей, не выявили.
Для определения толерогенной функции мы применили оригинальную методику, позволяющую оценить степень влияния потенциально толерогенных модулированных ДК на способность лимфоцитов отвечать на повторную активацию тем же набором антигенов. Для этого проводили двухэтапную СЛР, в которой аллогенные лимфоциты венозной крови взрослых доноров последовательно стимулировали различными ДК. На первом этапе лимфоциты сокультивировали с модулированными ДК или обычными
- 32 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Взрослые
Дети
Рис. 3. Пролиферативный ответ и продукция (в пг/мл) ИФН-у в 4-суточной СЛР. ДК получали культивированием в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ с ДЕКС, ИЛ-10 или без них, а затем активировали ФНОа или ЛПС. Полученные варианты ДК вносили в СЛР по отдельности или в смеси.
Пролиферация представлена в индексах подавления (за единицу приняты значения СЛР с обычными ДК, активированными ЛПС). Здесь и на рис. 5: звездочка - статистически достоверное отличие от ДК (р < 0,05).
ДК, на втором во все эти культуры добавляли только обычные ДК, сингенные клеткам, которые использовали на первом этапе. Все ДК культивировали в идентичных условиях и соответственно презентировали одинаковый набор антигенов.
По нашему предположению, лимфоциты в ответ на стимуляцию аллоантигенами обычных ДК размножаются на первом этапе СЛР и при повторной стимуляции теми же антигенами на втором этапе реакции дают мощный ответ. В то же время после контакта с аллоантигенами модулированных ДК, обладающих то-
лерогенными свойствами, лимфоциты получают от этих клеток супрессорные сигналы и снижают свою способность отвечать на те же антигены при повторной стимуляции.
На рис. 4 представлены пролиферация и продукция ИФН-у лимфоцитами на втором этапе СЛР после добавления обычных стимулирующих ДК. Совместное культивирование модулированных ДК с аллогенными лимфоцитами на первом этапе накладывает отпечаток на функциональные свойства лимфоцитов. В результате лимфоциты, росшие на первом этапе с ДК-ДЕКС или с ДК, обработанными высокой концентрацией ИЛ-10, отвечали на повторную стимуляцию значительно слабее, чем лимфоциты, росшие с обычными ДК. Пролиферативный ответ в таких культурах был в 1,5 раза ниже, чем в культурах с обычными ДК. Неожиданные результаты получены при исследовании действия ДК новорожденных детей, модулированных низкой дозой ИЛ-10. Такие ДК не снижали, а достоверно усиливали пролиферативный ответ лимфоцитов на втором этапе СЛР. Аналогичные ДК взрослых не оказывали действия на способность лимфоцитов к пролиферации.
Контакт лимфоцитов с ДК-ДЕКС существенно снижал их возможность к продукции ИФН-у в ответ на обычные ДК: концентрация этого цитокина в культурах лимфоцитов, инкубированных на первом этапе СЛР с ДК-ДЕКС, была в 2 раза ниже, чем в культурах, росших с обычными ДК (см. рис. 3). Различий между модулированными ДК взрослых и новорожденных в плане стимуляции продукции ИФН-у в двухэтапной СЛР не выявили (данные не приведены).
Во всех описанных выше экспериментах, направленных на сравнение толерогенных свойств ДК детей и взрослых, в качестве отвечающих клеток мы использовали только лимфоциты взрослых лиц. В отдельном эксперименте с двухэтапной СЛР исследовали действие модулированных и обычных ДК детей на аллогенные лимфоциты новорожденных. Показано, что модулированные ДЕКС и ИЛ-10 ДК новорожденных при контакте с Т-лимфоцитами новорожденных демонстрируют ярко выраженные толерогенные свойства (рис. 5).
Обсуждение. Показано, что ДК новорожденных детей обладают рядом особенностей, отличающих их от ДК взрослых. Несмотря на то что модулированные ДК детей имеют толерогенный фенотип, они не подавляют пролиферацию и цитокинпродукцию лимфоцитов при конкурентном взаимодействии с обычными ДК, тогда как модулированные ДК взрослых в аналогичных условиях угнетают продукцию ИФН-у лимфоцитами. При последовательном влиянии модулированных и обычных ДК на лимфоциты установлено, что модулированные ДК как детей, так и взрослых снижают способность лимфоцитов пролиферировать и продуцировать ИФН.
- 33 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
имп/мин
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
ДК
Л*
,СЙ
&
«к
&
Взрослые
Дети
Рис. 4. Результат двухэтапной СЛР.
К лимфоцитам на первом этапе добавляли указанные под гистограммой варианты ДК, на втором - обычные ДК; контроль - лимфоциты без ДК.
Верхняя диаграмма - пролиферация (в имп/мин); нижняя - продукция ИФНу, представленная в индексах подавления (за единицу приняты значения культур, к которым на обоих этапах добавляли обычные ДК). Звездочка - достоверные отличия от культур, к которым на обоих этапах добавляли обычные ДК; стрелка - различия ДК детей и взрослых (р < 0,05).
Выявленные особенности ДК детей могут иметь непосредственное отношение к специфическим для периода новорожденности процессам формирования периферического отдела иммунной системы. В организме ребенка после рождения наблюдается сдвиг в механизме увеличения количества Т-клеток. Принципиальное изменение источника нарастания пула лимфоцитов происходит в результате уменьшения вклада внутритимусной пролиферации и значительного усиления пролиферации посттимических Т-клеток на периферии [16, 17]. Учитывая тот факт, что процессы посттимической пролиферации Т-лимфоцитов находятся под гомеостатическим контролем с непосредственным участием антигенпрезентирующих клеток, полагаем, что роль ДК является определяющей. Поскольку полученные нами модулированные ДК ново-
имп/мин
Рис. 5. Ответ аллогенных лимфоцитов новорожденного на обычные и модулированные ДК новорожденного в двухэтапной СЛР. Обозначения аналогичны рис. 4.
а - пролиферативный ответ (в имп/мин); б - продукция (в пг/мл) ИФН-у.
рожденных обладают менее выраженными супрессорными свойствами, можно предположить, что эта особенность отражается в реакциях гомеостатического контроля. Вероятно, у новорожденных детей имеет место так сказать лояльный контроль размножения Т-лимфоцитов на периферии иммунной системы со стороны ДК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Талаев В. Ю., Бабайкина О. К, Ломунова М. А. и др. Функциональные свойства моноцитарных дендритных клеток новорожденных в краткосрочных культурах // Иммунология. - 2008. - Т. 29, № 3. - С. 141-147.
2. Ahmadpoor P., Ghasemmahdi L., Makhdoomi К., Ghafari A. Effect of active vitamin D on expression of co-stimulatory molecules and HLA-DR in renal transplant recipients // Exp. Clin. Transplant. - 2009. - Vol. 2. - P. 99-103.
3. Caielli S., Conforti-Andreoni C., Di Pietro C. et al. On/off TLR signaling decides proinflammatory or tolerogenic dendritic cell maturation upon CD1d-mediated interaction with invariant NKT cells // J. Immunol. - 2010. - Vol. 185, N 12. - P. 7317-7329.
4. Cools N., Ponsaerts P., Van Tendeloo V., Berneman Z. Balancing between immunity and tolerance: an interplay between dendritic cells, regulatory T cells and effector T cells // J. Leukoc. Biol. -Vol. 82. - P. 567-573.
5. De Smedt Т., Van Mechelen M., De Becker G. et al. Effect of interleukin-10 on dendritic cell maturation and function // Eur. J. Immunol. - 1997. - Vol. 5. - P. 1229-1235.
6. Fujimoto Y., Tedder T. F. CD83: a regulatory molecule of the immune system with great potential for therapeutic application // J. Med. Dent. Sci. - 2006. - Vol. 53, N 2. - P. 85-93.
7. Gregori S. Dendritic cells in networks of immunological tolerance // Tissue Antigens. - 2011. - Vol. 77, N 2. - P. 89-99.
- 34 -
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
8. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L. et al. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 20. - P. 621-667.
9. Hu J., Wan Y. Tolerogenic dendritic cells and their potential applications // Immunology. - 2011. - Vol. 10. - P. 1365-2567.
10. Karakhanova S., MeiselS., RingS. et al. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets // Eur. J. Immunol. - 2010. - Vol. 40, N
1. - P. 254-266.
11. Mackall С. V., Bare L. A., Granger S. O., Sharrow J. A. Thymic-independent T cell regeneration occurs via antigen-driven expansion of peripheral T cells resulting in a repertoire that is limited in diversity and prone to skewing // J. Immunol. - Vol. 156. - P. 4609-4616.
12. Manavalan J. S., Rossi P. C., Vlad G. et al. High expression of ILT3 and ILT4 is a general feature of tolerogenic dendritic cells // Transplant. Immunol. - 2003. - Vol. 11. - P. 245-258.
13. MatyszakM.K., CitterioS., RescignoM., Ricciardi-CastagnoliP. Differential effects of corticosteroids during different stages of dendritic cell maturation // Eur. J. Immunol. - 2000. - Vol. 4. - P. 1233-1242.
14. Orabona C., Grohmann U. Indoleamine 2,3-dioxygenase and regulatory function: tryptophan starvation and beyond // Meth. Mol. Biol. - 2011. - Vol. 677. - P. 269-280.
15. PedersenA.E.,SchmidtE. G., GadM. et al. Dexamethasone/1alpha-25-dihydroxyvitamin D3-treated dendritic cells suppress colitis
in the SCID T-cell transfer model // Immunology. - 2009. - Vol. 127, N 3. - P. 354-364.
16. Schdnland S. O., Zimmer J. K., Lopez-Benitez С. М. et al. Homeostatic control of T-cell generation in neonates // Blood. -2003. - Vol. 102, N 4. - P. 1428-1434.
17. Sprent J., Lo D., Gao E. K., Ron Y. T cell selection in the thymus // Immunol. Rev. - 1988. - Vol. 101. - P. 173-190.
18. Steinman R. M., Hawiger D., Nussenzweig M. C. Tolerogenic dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. - 2003. - Vol. 21. - P. 685-711.
19. Taylor A., Verhagen J., Blaser K. et al. Mechanisms of immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-b: the role of T regulatory cells // Immunology. - 2006. - Vol. 117.
- P. 433-442.
20. Van den Heuvel M. M., van Beek N. M., Broug-Holub E. et al. Glucocorticoids modulate the development of dendritic cells from blood precursors // Clin. Exp. Immunol. - 1999. - Vol. 3. -P. 577-583.
21. Xia C. Q., Peng R., Beato F., Clare-Salzler M. J. Dexamethasone induces IL-10-producing monocyte-derived dendritic cells with durable immaturity // Scand J. Immunol. - 2005. - Vol. 1. - P. 45-54.
22. Zen M., Canova M., Campana C. et al. The kaleidoscope of glu-corticoid effects on immune system // Autoimmun. Rev. - 2011.
- Vol. 4. - P. 234-240.
Поступила 27.06.11
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
© с. ю. СМОЛЕНЦЕВ, 2012 УДК 615.276.4.03:619
С. Ю. Смоленцев
применение лечебно-профилактического иммуноглобулина для повышения врожденного и адаптивного иммунитета сельскохозяйственных животных
Кафедра генетики, селекции и воспроизводства животных ГОУ ВПО Марийский государственный университет (424000, г Йошкар-Ола, пл. Ленина, д. 1)
Результаты исследований показали, что наиболее значительное повышение показателей специфической и неспецифической резистентности организма отмечалось при применении препарата “Лечебнопрофилактический иммуноглобулин”. Рекомендуется его применение для повышения иммунитета и профилактики иммунодефицитных состояний животных.
Ключевые слова: иммунитет, повышение, показатель, лечебно-профилактический иммуноглобулин Smolentsev S.Yu.
the application of therapeutic-and- prophylactic immunoglobulin for THE improvement of congenital and adaptive immunity in agricultural animals
The results of relevant investigations give evidence that the application of the “therapeutic-and-prophylactic immunoglobulin” preparation considerably improves the parameters characterizing specific and non-specific resistance of the organism. This preparation can be recommended for the promotion of immunity and prevention of the development of immunodeficiency in agricultural animals.
Key words: immunity, promotion, characteristics, therapeutic-and-prophylactic immunoglobulin
Состояние иммунной системы, как и любого другого органа, характеризуется комплексом морфологических, функциональных и клинических по-
Смоленцев Сергей Юрьевич - ст. препод., e-mail: aft@marsu.ru
казателей, присущих иммунной системе в норме и они определяют иммунный статус [1, 3]. Изменение какого-либо одного или нескольких показателей свидетельствует о нарушении иммунного статуса, т. е. отклонении его от нормы, и трактуется как иммунодефицит [2].
- 35 -
