Научная статья на тему 'Исследования толерогенных дендритных клеток новорожденных и взрослых в моделях иммунного ответа in vitro'

Исследования толерогенных дендритных клеток новорожденных и взрослых в моделях иммунного ответа in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
194
46
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ТОЛЕРАНТНОСТЬ / ТОЛЕРОГЕННЫЕ ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ / ДЕКСАМЕТАЗОН / МОЛЕКУЛЫ КОСТИМУЛЯЦИИ / ИЛ-10 / TOLERANCE / TOLEROGENIC DC / DEXAMETASONE / CO-STIMULATORY MOLECULES / IL-10

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Цатуров Максим Эдуардович, Матвеичев Алексей Валерьевич, Плеханова Мария Владимировна, Заиченко Ирина Евгеньевна, Бабайкина Ольга Николаевна

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками иммунной системы, выполняющие две важные функции индукция Т-клеточного иммунного ответа и толерантности. Степень зрелости дендритных клеток зависит от условий культивирования и микроокружения. В данной работе нами исследовались свойства толерогенных ДК, полученных из моноцитов пуповинной крови новорожденных и венозной крови взрослых. Нами показано, что полученные ДК новорожденных обладают рядом особенностей, отличающих их от ДК взрослых

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Цатуров Максим Эдуардович, Матвеичев Алексей Валерьевич, Плеханова Мария Владимировна, Заиченко Ирина Евгеньевна, Бабайкина Ольга Николаевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

The examinations of tolerogenic dendritic cells of the newborn and adults in the models of the immune response in vitro

Dendritic cells (DC), professional antigenpresenting cells of the immune system, exert important functions both in induction of T cell immunity, as well as tolerance. DC maturation depends from condition of cultivation and microenvironment. In this study we research features of monocyte-derived tolerogenic DC of neonates and adults that made with dexametasone and interleukin-10. It was shown that tolerogenic DC of neonates possess some interesting property.

Текст научной работы на тему «Исследования толерогенных дендритных клеток новорожденных и взрослых в моделях иммунного ответа in vitro»

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Эпидемиология

IVh

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

УДК 611.018.83:612.017.1

ИССЛЕДОВАНИЯ ТОЛЕРОГЕННЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ И ВЗРОСЛЫХ В МОДЕЛЯХ ИММУННОГО ОТВЕТА IN VITRO

М.Э. Цатуров, А.В. Матвеичев, М.В. Плеханова, И.Е. Заиченко,

О.Н. Бабайкина, М.А. Ломунова, В.Ю. Талаев,

^ ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной»

Цатуров Максим Эдуардович - e-mail: [email protected]

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентируюшими клетками иммунной системы, выполняющие две важные функции - индукция Т-клеточного иммунного ответа и толерантности. Степень зрелости дендритных клеток зависит от условий культивирования и микроокружения. В данной работе нами исследовались свойства толерогенных ДК, полученных из моноцитов пуповинной крови новорожденных и венозной крови взрослых. Нами показано, что полученные ДК новорожденных обладают рядом особенностей, отличающих их от ДК взрослых.

Ключевые слова: толерантность, толерогенные дендритные клетки, дексаметазон, молекулы костимуляции, ИЛ-10.

Dendritic cells (DC), professional antigenpresenting cells of the immune system, exert important functions both in induction of T cell immunity, as well as tolerance. DC maturation depends from condition of cultivation and microenvironment. In this study we research features of monocyte-derived tolerogenic DC of neonates and adults that made with dexametasone and interleukin-10. It was shown that tolerogenic DC of neonates possess some interesting property.

Key words: tolerance, tolerogenic DC, dexametasone, co-stimulatory molecules, IL-10.

Э п и де м и о ло ги я

Введение

Функционирование иммунной системы в ходе иммунного ответа и вне его находится под контролем многих молекулярных и клеточных систем. Эти системы призваны обеспечить оптимальный запуск и протекание реакции на антиген и при этом, не дать перейти этому процессу в русло различных системных отклонений, результатом которых может стать развитие аутоиммунной агрессии к собственным клеткам и тканям [1]. Центральную роль в инициации первичного иммунного ответа играют дендритные клетки (ДК) - наиболее активные и высокоспециализированные антигенпрезен-тирующие клетки организма [2, 3]. Кроме инициации иммунных реакций немаловажной является роль ДК в обеспечении толерантности к собственным антигенам и поддержания гомеостаза иммунокомпетентных клеток.

Исследования механизмов контроля процессов созревания ДК при различных условиях культивирования необходимы как для последовательного понимания отклонений в работе иммунной системы человека, так и для разработки способов лечения иммунопатологии. В частности, изучение механизмов выработки толерогенных свойств позволяет оценить возможность применения ДК с модулированными в ходе созревания свойствами при решении ряда проблем, возникающих в клинической практике при лечении аутоиммунных заболеваний и предотвращении отторжения трансплантированных органов.

Известно, что процессы иммунного ответа и подержания клеточного гомеостаза лимфоцитов в раннем постнатальном периоде существенно отличаются от аналогичных процессов у взрослых. В этой связи, особенно интересным аспектом исследования функциональной значимости ДК является изучение последних на ранних этапах развития, т.е. с позиций онтогенетической зрелости иммунной системы [4].

Целью данного исследования явилось изучение индуцированных толерогенных свойств дендритных клеток новорожденных детей и взрослых в моделях иммунного ответа in vitro.

Материалы и методы

Дендритные клетки получали из моноцитов пуповинной крови здоровых доношенных новорожденных и венозной крови здоровых доноров. Из проб стерильной гепаринизи-рованной крови выделяли мононуклеарные клетки над

слоем Hystopaque-1077 (Sigma, USA), клетки отмывали средой DME (Sigma, USA) и готовили суспензию клеток с концентрацией 3,5 - Б^Ю6 клеток/мл на среде DME с 10%

эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Санкт Петербург). Клетки засевали в 24-луночные планшеты (Costar, USA) и инкубировали 3 часа при +37°С и 5% СО2. Затем неадгезировавшиеся клетки осторожно смывали с поверхности пластика тремя порциями среды DME, в лунки с моноцитами вносили среду DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамином, р-меркаптоэтанолом и пируватом натрия. С помощью микроскопии контролировали чистоту удаления неадгезировавшихся клеток и плотность засева моноцитов. Для индукции созревания дендритных клеток в лунки добавляли рекомбинантный ГМ-КСФ (100 нг/мл, Biosource, USA) вместе с ИЛ-4 (20 нг/мл, Sigma, USA). В отдельные лунки с указанными выше стимуляторами вносили натриевую соль фосфата дексаметазона (0,4 мкг/мл, KRKA, Slovenia), рекомбинантный человеческий ИЛ-10

(100 нг/мл) (Biosource, USA). Моноциты, росшие без всех цитокинов и дексаметазона, использовались в качестве контроля. Клетки инкубировали в течение 3 и 8 суток при +37оС и 5% СО2. Затем из культур отбирали среду для определения содержания цитокинов. В культурах клеток меняли среду DME на новую, также с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамином, пируватом натрия и р-меркаптоэтанолом.

В среду с незрелыми обычными и модулированными ДК добавлялись активаторы терминального созревания липо-полисахарид (ЛПС) Salmonella typhi (1 мкг/мл, Отраслевой стандарт образца пирогена, ГИСК им. Тарасевича, Москва), рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли а (ФНОа) (10 нг/мл, Sigma, USA), растворимая форма рекомбинантной молекулы CD40L (Biosource, USA). Клетки с активаторами инкубировали еще одни сутки. Функциональные свойства модулированных дендритных клеток определяли по их способности стимулировать продукцию ИФН7 и пролиферацию у аллогенных лимфоцитов взрослых здоровых доноров. Пролиферацию оценивали по включению меченного тритием метилтимидина («Изотоп», Санкт Петербург), который добавляли в лунки по 0,5 мкКюри через 3 суток после начала культивирования второго этапа стимуляции на срок 24 ч. Лунки без добавления моноцитов и дендритных клеток использовались в качестве контрольных. Каждый вариант микрокультуры засевался в трех повторах. После культивирования планшеты замораживали, размораживали, хроматин клеток переносили на стекловолокнистые фильтры (Titertek, USA) и анализировали с помощью р-сцинцилляционного счетчика СБС-2. Результаты выражали в импульсах в минуту (имп./мин.). Среду из культур кле- ^ ток собирали для определения содержания в ней ИФН-7 с помощью иммуноферментных тест-систем «ИФА-ИФН7» (Вектор-Бест, Новосибирск).

Для исследования экспрессии мембранных маркеров использовали моноклональные антитела к молекулам HLA-DR, СD14 (Сорбент, Москва), CD83 и CD86 (Caltag, USA), меченные ФИТЦ или фикоэритрином. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитофлюориметре FacsCalibur (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA) в режиме двухцветной цитометрии. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения CellQuest и WinMDI 2.8. Оценивался процент несущих маркер клеток и яркость свечения окрашенных клеток - геометрическая средняя пика окрашенных клеток (показатель GMean).

Результаты и их обсуждение

В ходе работы изучались особенности созревания ДК новорожденных и взрослых в зависимости от изменения условий культивирования, а также исследовались функцио- ^ нальные свойства полученных клеток в моделях межклеточного взаимодействия in vitro. В качестве модуляторов созревания использовались агенты, обладающие выраженными иммуносупрессорными свойствами - интерлейкин-10 и дек-саметазон, синтетический аналог глюкокортикоидов.

В ходе работы были выявлены статистически значимые отличия между фенотипическими и функциональными свойствами ДК, полученным из моноцитов пуповинной крови новорожденных и венозной крови взрослых здоровых доноров. Показана различная динамика экспрессии функционально значимых маркеров у дендритных клеток

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Э п и де м и о логи я

ivk

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

новорожденных и взрослых. Молекула СЭ14 - моноцитар-ный маркер, сохраняется на большей части дендритных клеток новорожденных на ранних этапах культивирования. К восьмым суткам количество СЭ14+ ДК новорожденных снижается и достигает уровня взрослых. Количество СЭ86+ ДК новорожденных в культурах, напротив, с течением времени снижается (рис. 1).

вание Т-лимфоцитов, особенно Т-хелперов первого типа [5, 6]. Дефицит продукции ИЛ-10 незрелыми ДК новорожденных

может являться одним из факторов, создающих основу процесса развертывания периферического отдела иммунной системы - бурной поликлональной посттимической пролиферации Т-клеток, регистрируемой в раннем детском возрасте [4].

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

щ

A-DR CD14 CD86 ФНО

ШМЖ С014 С086 ни^ С014 С086

ФНО ЛПС

■ДК оДК-ДЕКС □ДК-ИЛ-10

РИС. 1.

Фенотип ДК новорожденных и взрослых.

Верхний ряд диаграмм - сравнение фенотипа обычных ДК взрослых и детей при культивировании в течение 3 (серые диаграммы) и 8 суток (черные диаграммы).

Нижняя диаграмма - количество обычных ДК и ДК, модулированных в ходе созревания дексаметазоном и ИЛ-10 (представлен фенотип ДК новорожденных детей). ★ - статистически достоверные отличия фенотипа трехсуточных ДК от восьмисуточных, * - отличие модулированных ДК от обычных. Достоверность результатов при р<0,05 в парных и непарных т-тестах.

При действии модулирующих агентов на созревание ДК новорожденных и взрослых происходит значительная перестройка мембранного репертуара функциональных молекул. На рисунке 1 представлен фенотип модулированных и обычных ДК новорожденных. Как при активации ФНОа, так и ЛПС, культуры ДК, обработанные дексаметазоном, характеризуются резким увеличением содержания СЭ14+ клеток и снижением количества СЭ86+ клеток. Проявление супрессорной активности ИЛ-10 по отношению к молекулам кости-муляции выявило неожиданные результаты. Установлено, что при активации ЛПС, количество СЭ86-позитивных клеток в культуре ДК, обработанных ИЛ-10, выше, чем в культурах обычных ДК.

Также выявлены различия в продукции цитокинов дендритными клетками в зависимости от стадии созревания и условий культивирования. Показан сложный характер влияния синтетического глюкокортикоида дексаметазона на уровень продукции интерлейкина-10 дендритными клетками.

Модуляция свойств ДК веществами с иммуносупрессор-ными свойствами приводит к колоссальным изменениям в морфологии, фенотипе и функции получаемых ДК. Эти изменения ярко выражены уже на начальных этапах созревания моноцитов в дендритные клетки и выявляются в трехсуточной системе культивирования. Наиболее существенные отличия дендритных клеток новорожденных и взрослых проявляются в продукции дендритными клетками ИЛ-10. Незрелые трехсуточные ДК взрослых продуцируют значительные количества ИЛ-10, при этом наибольшая концентрация этого цитокина обнаруживалась в двухсуточных культурах незрелых ДК (рис. 2). В то же время, моноциты и незрелые ДК новорожденных оказались чрезвычайно слабыми продуцентами ИЛ-10. Как известно, ИЛ-10 является фактором, сдерживающим пролиферацию и функциониро-

600

- 500

Ё400

CD14 CD86 2 с к

ЛПС ^СК'

Взрослые

л

3 с.к. без 3 с.к. ФНО 3 c.K.sCD40L 3 с.к. ЛПС 3 с.к. смесь стимула стимуляторов

□ Моноциты нДК оДК-ДЕКС

600

500

400

300

200

100

0

РИС. 2.

Новорожденные дети

1

rfl ^ J J

2 с.к. 3 с.к. без 3 с.к. ФНО 3 c.ksCD40L 3 с.к. ЛПС 3 с.к. смесь стимула стимуляторов

□ Моноциты ■ ДК □ ДК-ДЕКС

Продукция ИЛ-10 моноцитами и дендритными клетками взрослых и новорожденных детей в течение 2 и 3 суток культивирования.

ДК - обычные дендритные клетки, культивировавшиеся в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ, ДК-ДЕКС - дендритные клетки, культивировавшиеся в присутствии ИЛ-4, ГМ-КСФ и дексаметазона. Значимые различия показателей детей и взрослых обозначены - ♦ (при p<0,05 в непарном т-тесте); отличия ДК от нестимулированных моноцитов - ★; достоверный эффект действия дексаметазона - О (р<0,05 в парном т-тесте).

Выводы

1. Дендритные клетки, полученные из моноцитов пуповинной крови новорожденных обладают рядом отличительных черт при сравнении с дендритными клетками, полученными из моноцитов венозной крови взрослых доноров. Фенотипическое созревание ДК новорожденных характеризуется медленной утратой моноцитарного маркера CD14 и нестойкой экспрессией костимуляторной молекулы CD86.

2. Действие ИЛ-10 на дендритные клетки новорожденных при созревании приводит к повышению уровня экспрессии CD86.

3. Незрелые дендритные клетки новорожденных в отли-

чие от ДК взрослых слабо продуцируют ИЛ-10. Модулирование дексаметазоном ДК новорожденных после активации резко увеличивают продукцию ИЛ-10 уже в трехсуточных культурах. [р

ЛИТЕРАТУРА

1. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 2006. № 27 (6). С. 368-378.

2. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L et al. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunology. 2002. № 20. Р. 621-667.

Эпидемиология

3.Hart J.P., Michael D. Gunn and Salvatore V. Pizzo A CD91-Positive Subset of CD11c+ Blood Dendritic Cells: Characterization of the APC that Functions to Enhance Adaptive Immune Responses against CD91-Targeted Antigens. The Journal of Immunology. 2004. № 172. P. 70-78.

4. Schonland S.O., Zimmer J.K., Lopez-Benitez C. M., Widmann T. et al. Homeostatic control of T-cell generation in neonates. Blood. 2003. № 102. P. 1428-1434.

5.Steinman R.M. Some interfaces of dendritic cell biology. APMIS. 2003. № 111 (7-8). P. 675-97.

6. Suciu-Foca N., Manavalan, J. S., Scotto, L. et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells//Int. Immunopharmacol. 2005. № 5. P. 7-11.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.