Действие вакцин против туберкулеза и гепатита в на созревание дендритных клеток новорожденных и взрослых in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

IVh

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

УДК 616-002.5+616.36-002:616.9881:615.371.015.1

ДЕЙСТВИЕ ВАКЦИН ПРОТИВ ТУБЕРКУЛЕЗА И ГЕПАТИТА В НА СОЗРЕВАНИЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ И ВЗРОСЛЫХ IN VITRO

М.В. Плеханова, М.Э. Цатуров, А.В. Матвеичев, О.Н. Бабайкина,

И.Е. Заиченко, Е.И. Ефимов, В.Ю. Талаев,

ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной»

Плеханова Мария Владимировна - e-mail: marya.talaeva@yandex.ru

Исследовали действие вакцины БЦЖ и рекомбинантной вакиины против гепатита В (ВГВ) на фенотипическое и функциональное созревание дендритных клеток (ДК) новорожденных и взрослых in vitro. Показано, что живая вакцина БЦЖ индуцирует фенотипическое созревание ДК

и усиливает продукцию ими фактора некроза опухолей-а (ФНО). ДК, обработанные вакциной БЦЖ, эффективно стимулируют продукцию интерферона-7 (ИНФ-7) Т-лимфоцитами. ВГВ стимулирует фенотипическое созревание ДК, усиливает продукцию этими клетками ФНО и угнетает продукцию ИЛ-10. В то же время, ДК, обработанные ВГВ, слабее стимулируют продукцию ИНФ-7 и ИЛ-5 Т-лимфоцитами.

Ключевые слова: вакцина, новорожденные, дендритные клетки, Т-лимфоциты, цитокины.

We investigate in vitro action of BCG and recombinant hepatitis B vaccine (HBV) upon phenotypic and functional maturation of adult and newborn dendritic cells (DC). It was shown, that BCG induced phenotypic maturation of DC and enhanced production of tumor necrosis factor-а (TNF) by DC. BCG treated DC stimulated strong production of interferon-7 (INF-7) by T-lymphocytes. HBV induced phenotypic maturation of DC, enhanced TNF production and decrease IL-10 production by DC. At the same time, HBV treated DC stimulated weak 1NF-7 and IL-5 production by T-lymphocytes.

Key words: newborns, dendritic cells, T-cells, cytokines.

Введение

Актуальной задачей современной иммунологии является совершенствование вакцин, как основных средств иммунопрофилактики. По современным представлениям распознавание как возбудителей инфекционных заболеваний, так и вакцин, происходит с помощью двух различных молекулярных механизмов. Взаимодействие возбудителей с клетками врожденного иммунитета основано на идентификации паттернов патогенов - ограниченного набора консервативных молекул, качественно отличающихся от молекул человека [1].

Следствием этого распознавания является активация анти-генпрезентирующих клеток, в первую очередь, дендритных клеток (ДК) [2-5]. После активации ДК мигрируют в лимфатические узлы для последующей, более точной идентификации микроорганизмов Т-лимфоцитами. Возможность распознавания микроорганизмов у Т-лимфоцитов значительно шире, чем у дендритных клеток, поскольку они распознают антигены - любые генетически чужеродные молекулярные структуры [6]. Активация лимфоцитов ведет к запуску иммунного ответа, целью которого является не только

уничтожение чужеродных микроорганизмов, но и формирование группы клеток памяти, необходимой для быстрой реакции при повторном инфицировании [6]. Как известно, формирование иммунологической памяти и является целью вакцинации. Таким образом, для изучения механизмов действия вакцин на иммунную систему целесообразно раздельно оценивать эффекты распознавания вакцин дендритными клетками и Т-лимфоцитами.

Цель исследования

В данной работе мы рассматривали влияние живой вакцины BCG и рекомбинантной вакцины против гепатита В на способность дендритных клеток стимулировать Т-лимфоциты у новорожденных и взрослых. Научная новизна работы: впервые исследовали действие вакцин на дендритные клетки новорожденных детей in vitro. Практическое значение: результаты исследования лягут в основу методических подходов для анализа действия новых вакцин на дендритные клетки человека.

Материалы и методы

В работе использовали вакцину туберкулезную (БЦЖ) «Микроген» и рекомбинанатную дрожжевую вакцину против гепатита В (ВГВ) «Шанвак-В». ДК получали из моноцитов пуповинной крови здоровых новорожденных и венозной крови взрослых здоровых доноров. Для этого выделяли мононуклеарные клетки над слоем Hystopaque-1077 (Sigma, USA) традиционным способом. Затем с помощью адгезии на 24-луночных планшетах (Costar, USA) выделяли прилипающие моноциты. В лунки вносили среду DME (Sigma, USA) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Санкт Петербург), L-глютамином, p-меркаптоэтанолом и пирува-том натрия. Для получения из моноцитов незрелых ДК в лунки добавляли рекомбинантные человеческие ГМ-КСФ (80 нг/мл, Biosource, USA) и ИЛ-4 (20 нг/мл, Invitrogen, USA). Клетки инкубировали 6 суток при +37°С и 5% СО2, повторно добавляя ГМ-КСФ и ИЛ-4 на третьи сутки культивирования. Через 6 суток среду в лунках заменяли на новую и в лунки добавляли стимуляторы созревания или исследуемые вакцины. Для получения зрелых ДК, используемых в качестве стандарта, в лунки вносили липополисахарид (ЛПС) Salmonella typhi (1 мкг/мл, Отраслевой стандарт образца пирогена, ГИСК им. Тарасевича, Москва) и рекомбинантный фактор некроза опухоли-а (ФНО) (10 нг/мл, Sigma, USA). В другие лунки вносили исследуемые вакцины: БЦЖ (и-т им. Гамалеи, Москва) и ВГВ в концентрациях 0,2; 0,02 и 0,002 дозы/мл. Для получения незрелых ДК в лунки не вносили стимуляторов.

Через 24 ч культивирования ДК собирали и проводили сравнение стандартных зрелых ДК, стимулированных ЛПС и ФНО, незрелых ДК и ДК, стимулированных вакцинами. Фенотип дендритных клеток оценивали по экспрессии молекул HLA-DR, CD14, CD80, CD83 и CD86 с помощью 2-цветной проточной лазерной цитометрии. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения FacsDiva. Для оценки функциональных совйств ДК определяли продукцию этими клетками цитокинов ФНО, ИЛ-1р и ИЛ-10 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа надосадков из культур с использованием тест-систем производства «Вектор-Бест». Кроме того, функциональные свойства дендритных клеток оценивали по способности стимулировать продукцию цитокинов аллогенными лимфоцитами.

Для этого лимфоциты засевали в лунки 96-луночных планшетов в среде DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и L-глютамином в концентрации 106 клеток/мл (2 • 105 клеток/лунку). Затем в лунки вносили исследуемые ДК в количестве 1, 2 и 4% от числа лимфоцитов. Лунки без ДК использовались в качестве контрольных. Каждый вариант микрокультуры засевался в трех повторах. Планшеты инкубировали 72 ч. при +37°С и 5% СО2 и отбирали пробы надосадков для иммуноферментного анализа продукции цитокинов. Продукцию лимфоцитами интерферона-7 (ИНФ-7) и ИЛ-5 определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа надосадков из смешанных культур. Для определения концентрации ИНФ-7 использовали тест-системы производствава «Вектор-Бест» для определения ИЛ-5 - производства R&D (France).

Для уменьшения влияния индивидуальных особенностей доноров на оценку свойств ДК мы применили метод обработки данных, при котором концентрации цитокинов выражались в относительных единицах (%), причем за 100% принималась концентрация цитокинов, продуцируемая стандартными зрелыми ДК. При анализе продукции цитокинов лимфоцитами, стимулированными ДК в смешанной культуре применяли аналогичный подход. При этом за 100% принималась концентрация соотв. цитокина, продуцируемая лимфоцитами в ответ на стимуляцию максимальной используемой дозой стандартных зрелых ДК.

Результаты и их обсуждение

Вакцина БЦЖ дозозависимо усиливала продукцию ФНО дендритными клетками (рис. 1), не оказывая влияния на

Под действием БЦЖ дозозависимо усиливалась экспрессия молекул, необходимых для презентации антигенов и стимуляции Т-лимфоцитов. В результате, под действием БЦЖ в концентрации 0,2 дозы/мл плотность экспрессии Н_А^ (средняя геометрическая яркости свечения окрашенных клеток) возрастала в 1,71 раза, а количество клеток, несущих СЭ80, СЭ83 и СЭ86, возрастала в 1,64 , 2,57 и 1,44

секрецию ими ИЛ-1р (данные не приведены).

%

120

100

80

60

40

20

0

□ незрелые ДК и ДК - БЦЖ 0,002 дозы/мл □ ОС - ВГВ 0,002 дозы/мл

а зрелые ДК (ЛПС+ФНО) □ ДК - БЦЖ 0,02 дозы/мл □ ОС - ВГВ 0,02 дозы/мл в ДК - БЦЖ 0,2 дозы/мл в ОС - ВГВ 0,2 дозы/мл

РИС. 1.

Дозозависимое действие вакцин БЦЖ и ВГВ на секрецию ФНО-а дендритными клетками. По оси ординат - концентрация ФНО-а в относительных единицах. ★ - достоверные различия с незрелыми ДК (р<0,05, парный Т-тест).

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

раза, соотв. Тем не менее, ДК, инкубированные с БЦЖ, по уровню экспрессии данных молекул уступали стандартным зрелым ДК, стимулированным ЛПС и ФНО. В то же время, ДК детей и взрослых, стимулированные БЦЖ, обладали чрезвычайно сильной способностью стимулировать продукцию ИНФ-у Т-лимфоцитами. После культивирования с высокой концентрацией БЦЖ (0,2 дозы/мл) ДК новорожденных детей запускали достоверно большую продукцию ИНФ-у чем стандартные зрелые ДК (рис. 2).

-о-незрелые ДК

-•-зрелые ДК (ЛПС+ФНО) -^ДК - БЦЖ 0,02 дозы/мл -^ДК - БЦЖ 0,002 дозы/мл -^ДК - БЦЖ 0,2 дозы/мл

РИС. 2.

Продукция ИНФ-у лимфоцитами, стимулированными ДК, созревшими под действием БЦЖ (А) и ВГВ (Б). По оси ординат -концентрация ИНФ-у представлена в относительных единицах.

★ - достоверные различия с незрелыми ДК (р<0,05, парный Т-тест).

* - достоверные различия со стандартными зрелыми ДК (р<0,05, парный Т-тест).

Соотношение ДК и отвечающих лимфоцитов -о-незрелые ДК -о-ДК- БЦЖ 0,002 дозы/мл

-*-ДК-ЛПС+ФНО -Д-ДК- БЦЖ 0,02 дозы/мл

—А—ДК - БЦЖ 0,2 дозы\мл

РИС. 3.

Продукция ИЛ-5 лимфоцитами, стимулированными ДК, созревшими под действием вакцины БЦЖ. По оси ординат -концентрация ИЛ-5 представлена в относительных единицах. * - достоверные различия со стандартными зрелыми ДК (р<0,05, парный Т-тест).

ДК, обработанные БЦЖ в концентрации 0,02 дозы/мл, вызывают продукцию ИНФ-у сходную с действием стандартных зрелых ДК. БЦЖ в концентрации 0,002 дозы/мл не

оказывает ИНФ-индуцирующего эффекта. Как известно, ИНФ-у является ключевым цитокином Т-хелперов первого

типа (ТХ1) [7], которые управляют клеточными формами адаптивного иммунного ответа, важнейшего для защиты от туберкулеза. ДК, стимулированные вакциной БЦЖ в концентрации 0,2 дозы/мл, приобретали способность запускать продукцию ИЛ-5 Т-лимфоцитами. ИЛ-5-индуцирующая способность таких ДК у новорожденных соответствовала уровню стандартных зрелых ДК (рис. 3). Меньшие концентрации вакцины не приводили к стимуляции продукции ИЛ-5. Как известно, ИЛ-5 является стимулятором продукции антител и секретируется Т-хелперами второго типа (ТХ2). Таким образом ДК приобретали способность эффективно стимулировать ТХ1 в ответ на меньшие дозы БЦЖ, тогда как для стимуляции ТХ2 им требуется большие концентрации вакцины.

Вакцина ВГВ дозозависимо усиливала продукцию ФНО дендритными клетками (рис. 1), не изменяла секрецию ИЛ-1р и дозозависимо подавляла секрецию ИЛ-10 (рис. 4). ВГВ так же, как и БЦЖ, дозозависимо усиливала экспрессию на ДК молекул, необходимых для презентации антигенов и стимуляции Т-лимфоцитов. После инкубации ДК с 0,2 дозами/мл ВГВ плотность экспрессии H_A-DR возрастала в 1,53 раза, а количество клеток, несущих CD80, CD83 и CD86, увеличивалось в 1,24 , 2,3 и 1,38 раза, соотв.

160

140

120

100

60

40

20

О незрелые ДК

I зрелые ДК (ЛПС+ФНО)

ЕЭ ОС - ВГВ 0,002 дозы/мл [3 ОС - ВГВ 0,02 дозы/мл И ОС - ВГВ 0,2 дозы/мл

РИС. 4.

Продукция ИЛ-10 ДК, созревшими под действием вакцины ВГВ.

По оси ординат - концентрация ИЛ-10 представлена в относительных единицах. ★ - достоверные различия с незрелыми ДК (р<0,05, парный Т-тест).* - достоверные различия со стандартными зрелыми ДК (р<0,05, парный Т-тест).

После обработки ВГВ в концентрациях 0,2 и 0,02 дозы/ мл ДК приобретали способность эффективно стимулировать продукцию ИНФ-у (рис. 2). Эти ДК продуцировали ИНФ-у на уровне стандартных зрелых ДК, но достоверно

слабее, чем Д^ стимулированные соответствующей концентрацией БЦЖ. ^льтивирование обработанных ВГВ, с

лимфоцитами не приводило к значительной продукции ИЛ-Б. Секреция ИЛ-Б такими лимфоцитами была достоверно ниже, чем у культур стимулированных БЦЖ.

Выводы

1. Показана возможность использования ДK для оценки действия вакцин в функциональных тестах in vitro и предложена методика анализа результатов.

2. С использованием этой методики показано, что живая вакцина БЦЖ индуцирует фенотипическое созревание Д1< и эффективно стимулирует их способность запускать продукцию ИНФ-у.

3. Рекомбинантная вакцина против гепатита В слабее сти-

мулирует способность ДK новорожденных запускать продукцию ИНФ-7 и ИЛ-Б Т-лимфоцитами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Janeway C. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp.Quant.Biol. 19B9. № Б4. Р. 1-13.

2.Steinman R.M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu. Rev. Immunol. 1991. № 9. Р. 271-29б.

3.Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunology. 2002. № 20. Р. б21-бб7.

4. Wu L., Dakie A. Development of dendritic cell system. Cell. Mol. Immunol. 2004. № 1. Р. 112-11B.

5.Пащенков М.В., Пинегин Б. В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 200б. № 27. С. 36B-37B.

6. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР Медиа, 2010. С. 970.

7. Amsen D., Spilianakis G., Flavell R.A. How are Th1 and Th2 effector cell made? Cur. Opin. Immunol. 2009. № 21 (2). Р. 1Б3-1б0.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ