CC BY
74
Физиология и иммунология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2012, № 2 (3), с. 280-284
УДК 615.371.014.2
ДЕЙСТВИЕ ВАКЦИНЫ БЦЖ НА ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ НОВОРОЖДЕННЫХ IN VITRO
© 2012 г. М.В. Плеханова, В.Ю. Талаев, Е.И. Ефимов, О.Н. Бабайкина, И.Е. Заиченко
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной
talaev@inbox. rn
Поступила в редакцию 10.04.2012
Показано, что вакцина БЦЖ in vitro индуцирует фенотипическое созревание дендритных клеток новорожденных и взрослых и усиливает их способность стимулировать лимфоциты к продукции ин-терферона-у. БЦЖ увеличивает способность дендритных клеток взрослых стимулировать продукцию фактора некроза опухолей-а и практически не влияет на данный параметр у дендритных клеток новорожденных.
Ключевые слова: вакцины, дендритные клетки, лимфоциты, цитокины.
Введение
Совершенствование вакцин, как основных средств иммунопрофилактики, является актуальной задачей современной иммунологии. Как известно, эффективность вакцин определяется их способностью активировать специфичные к антигенам инфекционного агента лимфоциты, вызывая их размножение и созревание в клетки иммунологической памяти. Активацию Т-лим-фоцитов антигенами осуществляют специализированные антигенпрезентирующие клетки (АПК), причем при индукции первичного иммунного ответа эту роль должны выполнять самые активные АПК, именуемые дендритными клетками (ДК) [1, 2]. Следует отметить, что ДК различаются по своим функциональным свойствам в зависимости от стадии зрелости. Незрелые ДК эффективно поглощают антигенный материал, но являются слабыми стимуляторами лимфоцитов. Провоспалительные цитокины, а также некоторые типичные для инфекционных агентов молекулы (т.н. молекулярные паттерны патогенов - МПП) вызывают созревание ДК, значительно усиливая их способность стимулировать Т-лимфоциты к дифференцировке в клетки-эффекторы и клетки иммунологической памяти.
Известно, что вакцина БЦЖ, содержащая живую бациллу Calmette-Guerin (Mycobacterium bovis), является мощным стимулятором АПК [3, 4]. В то же время способность микобактерий к внутриклеточному паразитизму существенно затрудняет защиту от туберкулеза. В связи с этим, от эффективной вакцины требуется мобилизовать разнообразные клетки иммунной системы, включая Т-хелперы первого типа (Тх1) и
цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты, поскольку именно эти клетки обеспечивают успешную элиминацию внутриклеточных инфекций [1]. В то же время известно, что Т-лимфоциты новорожденных отличаются рядом функциональных особенностей. В частности, Тх1 новорожденных являются слабыми продуцентами их ключевого цитокина - интерферона-у (ИНФ-Y) [5].
Для увеличения эффективности вакцины и обеспечения ее большей безопасности в настоящее время в мире проводится разработка новых противотуберкулезных вакцин на основе очищенных, рекомбинантных или синтетических антигенов и паттернов M. tuberculosis. Найдено и синтезировано множество иммуностимулирующих молекул микобактерий, по своим характеристикам подходящих для использования в качестве адъюватного компонента вакцин [6, 7]. Однако недавние исследования показали, что паттерны M. tuberculosis могут как стимулировать, так и подавлять продукцию ИНФ первого типа дендритными клетками и связанную с ней перекрестную презентацию антигенов на молекулах главного комплекса гистосовместимости первого типа [8]. Таким образом, для совершенствования вакцин и, в частности, для поиска новых адъювантных компонентов целесообразно использовать модельные эксперименты с применением ДК.
В данной работе с помощью модельных экспериментов in vitro исследовались особенности действия вакцины БЦЖ на свойства ДК новорожденных и, в частности, на способность ДК стимулировать лимфоциты к продукции цито-кинов.
Материалы и методы
ДК получали из моноцитов пуповинной крови здоровых новорожденных и венозной крови взрослых здоровых доноров. Для этого из проб стерильной гепаринизированной крови выделяли мононуклеарные клетки над слоем Hys-topaque-1077 (Sigma, USA), отмывали и готовили суспензию c концентрацией 5 • 106 клеток/мл на среде DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Санкт-Петербург). Клетки засевали в 24-луночные планшеты (Costar, USA), инкубировали 2 часа при +37 оС и 5% СО2, затем удаляли неприлипающие лимфоциты. Для получения незрелых ДК (нДК) к моноцитам в лунки добавляли рекомбинантные ГМ-КСФ (80 нг/мл, Biosource, USA) и ИЛ-4 (20 нг/мл, Invitrogen, USA). Клетки инкубировали 6 суток (для оценки функциональных свойств ДК) или 7 суток (для оценки фенотипа) при +37 оС и 5% СО2, повторно добавляя ГМ-КСФ и ИЛ-4 на третьи сутки культивирования. По истечении срока культивирования среду в лунках заменяли и добавляли стимуляторы созревания или вакцину БЦЖ. В качестве контрольных стимуляторов созревания использовали липополисахарид (ЛПС) Salmonella typhi (1 мкг/мл, ГИСК им. Тара-севича, Москва) и рекомбинантный ФНО-a (10 нг/мл, Sigma, USA). В другие лунки вносили вакцину БЦЖ в концентрациях 0.2, 0.02 и 0.002 детские дозы/мл. В контрольные лунки с нДК не вносили стимуляторов.
Через 24 ч ДК собирали и оценивали их функциональные свойства по способности стимулировать продукцию цитокинов аллогенны-ми лимфоцитами. Для этого лимфоциты засевали в 96-луночные планшеты в среде DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки по 2-105 клеток на лунку. Затем в лунки вносили исследуемые ДК в количестве 1, 2 и 4% от числа лимфоцитов. Лунки без ДК использовались в качестве контрольных. Конечный объем среды в лунках составлял 200 мкл. Планшеты инкубировали 72 ч при +37оС и 5% СО2 и отбирали пробы надосадков для иммуноферментного определения ИНФ-у и ФНО-a с помощью тест-системы производства Вектор-Бест (Новосибирск).
Для оценки действия вакцин на экспрессию мембранных молекул нДК культивировали с вакцинами, со смесью ЛПС и ФНО-a или без стимуляторов в течение 48 ч. Затем клетки собирали и определяли экспрессию молекул HLA-DR, CD14, CD80, CD83 и CD86 с помощью 2-цветной проточной лазерной цитометрии. Для этого использовали меченные фикоэритрином (РЕ) ан-
титела к CD 14 (Сорбент, Россия), CD83 (BD Biosciences, США) и CD86 (Beckman Coulter Corp., Франция), а также меченные флюо-ресцеинизотиоционатом (FITC) антитела к CD80 (Beckman Coulter Corp., Франция) и HLA-DR (Сорбент, Россия). Пробы анализировали на проточном цитофлюориметре FacsCan-to II (BD Biosciences, USA) с помощью программы FacsDiva и оценивали процент несущих маркер клеток и геометрическую среднюю яркости свечения.
Статистический анализ проводили с использованием t-теста Стьюдента для зависимых и независимых выборок.
Результаты и их обсуждение
В предварительно проведенных исследованиях показано, что полученные in vitro ДК новорожденных демонстрируют определенные фенотипические признаки незрелости по сравнению с ДК взрослых. Часть из них, даже после созревания, индуцированного ЛПС и ФНО-a, сохраняла моноцитарный маркер CD14, а также имела низкий уровень экспрессии CD 80 и CD83 (табл. 1). Существенных различий уровня экспрессии костимулирующей молекулы CD86 и молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR на ДК детей и взрослых не обнаружено.
Добавление вакцины БЦЖ к незрелым ДК взрослых эффективно индуцировало созревание этих клеток, что проявлялось в увеличении плотности экспрессии HLA-DR (на рис. 1 -сдвиг пика окрашенных клеток вправо по оси яркости флюоресценции) и увеличении доли клеток, экспрессирующих CD83 и CD86 (рис. 1).
Незрелые ДК новорожденных под действием вакцины БЦЖ также усиливали экспрессию молекул, необходимых для презентации антигенов и стимуляции Т-лимфоцитов (табл. 2). БЦЖ в концентрации 0.2 дозы/мл достоверно увеличивала среднюю геометрическую яркости окрашивания молекул HLA-DR, CD83 и CD86, что говорит об увеличении плотность экспрессии этих молекул на мембране. Кроме того, возрастало количество клеток, экспрессирующих молекулы костимуляции. Так, яркость свечения окрашенных молекул HLA-DR возрастала в 1.53 ± 0.16 раза, а количество клеток, несущих CD83 и CD86, возрастало в 2.03 ± 0.19 и 1.91 ± 0.16 раз соответственно. Вакцина БЦЖ в концентрации 0.02 дозы/мл не оказывала статистически достоверного влияния на экспрессию исследуемых молекул (данные не приведены).
Рис. 1. Экспрессия мембранных молекул на ДК взрослых: тонкая сплошная линия - незрелые ДК, толстая серая линия - ДК, смулированные ЛПС и ФНО-а, толстая черная линия - ДК, смулированные 0.2 дозами/мл БЦЖ, гистограмма с закрашенным полем - изотипический контроль. Названия определяемых молекул - под гистограммами. Репрезентативный результат 1 из 4 экспериментов
Функциональные свойства ДК оценивали по их способности стимулировать продукцию ци-токинов аллогенными лимфоцитами. Одним из цитокинов, которые определялись в данной работе, был ИНФ-у - цитокин, продуцируемый Тх1, естественными киллерами и CD8+ Т-лимфоцитами с Тх1-профилем цитокинопродукции. ИНФ-у критически необходим для эффективного развития клеточной формы адаптивного иммунного ответа, важнейшего для защиты от туберкулеза. Показано, что вакцина БЦЖ дозозависимо усиливает способность ДК детей и взрослых стимулировать продукцию ИНФ-у отвечающими лимфоцитами. После культивирования с высокой концентрацией БЦЖ (0.2 дозы/мл) ДК детей запускали достоверно большую продукцию ИНФ-у, чем нДК и ДК, смулированные ЛПС и ФНО-а (ДК-ЛПС). ДК, обработанные БЦЖ в концентрации 0.02 дозы/мл, вызывали продукцию ИНФ-у, сходную с действием ДК-ЛПС, и значительно превышающую уровень секреции ИНФ-у, индуцированный нДК. БЦЖ в концентрации 0.002 дозы/мл не оказывала значимого ИНФ-индуцирующего эффекта (рис. 2).
Следует отметить, что концентрации ИНФ-у в культурах лимфоцитов детей, стимулированных дендритными клетками детей (рис. 2а), были значительно ниже, чем в культурах клеток взрослых (рис. 2б). Это различие продукции ИНФ-у наблюдалось при использовании как нДК, так и ДК, стимулированных БЦЖ. Для
выяснения, с какими именно клетками смешанной культуры (с лимфоцитами или ДК) связана слабость продукции интерферона у детей, мы использовали вариант смешанной культуры, в которой лимфоциты взрослых активировались дендритными клетками новорожденных. Эксперименты показали, что продукция ИНФ-у в таких культурах оказалась столь же мощной (рис. 2в), как и в обычных смешанных культурах клеток взрослых. Таким образом, слабость продукции ИНФ-у в смешанных культурах клеток детей обусловлена функциональными особенностями детских лимфоцитов, но не ДК.
Несмотря на низкие абсолютные значения концентраций ИНФ-у, кратность усиления продукции этого цитокина под действием БЦЖ в смешанной культуре лимфоцитов детей и ДК детей превышала таковую в смешанных культурах, где отвечающими клетками являются лимфоциты взрослых. Так, концентрация ИНФ-у в культурах детских лимфоцитов с 4% детских ДК, обработанных 0.2 дозами/мл БЦЖ, превышала аналогичные значения смешанных культур с нДК в 5.80 ± 1.65 раз. Для культур лимфоцитов взрослых, стимулированных дендритными клетками взрослых, соответствующий показатель составлял 2.92 ± 0.79, а для культур лимфоцитов взрослых, стимулированных ДК детей, - 3.48 ± 0.78.
Известно, что слабость продукции ИНФ-у лимфоцитами новорожденных связана с гиперметилированием промоторного участка гена
Таблица 1
Экспрессия мембранных молекул на незрелых и стимулированных ЛПС и ФНО-а дендритных клетках детей и взрослых (доля клеток, экспрессирующих соответствующую молекулу, %)
Молекула нДК ДК, стимулированные ЛПС и ФНО-a
новорожденных взрослых новорожденных взрослых
HLA-DR 97.3S ± 0.77 92.08 ± 6.04 94.78 ± 2.83 93.77 ± 1.64
CD14 29.97 ± 7.62 * 11.84 ± 5.35 29.99 ± 7.1 * 9.39 ± 4.06
CDS0 13.39 ± 4.77 39.69 ± 3.24 22.42 ± 2.73 * 50.90 ± 7.28
CDS3 10.38 ± 1.64 * 14.9 ± 1.99 16.48 ± 2.28 * 33.32 ± 5.38
CDS6 45.03 ± 6.74 46.25 ± 6.22 59.91 ± 6.77 70.77 ± 8.07
Молекула Доля клеток, экспрессирующих молекулу, в % Г еометрическая средняя яркости свечения клеток, несущих маркер
нДК ДК с ЛПС и ФНО-a ДК с БЦЖ, 0.2 дозы/мл нДК ДК с ЛПС и ФНО-a ДК с БЦЖ, 0.2 дозы/мл
HLA-DR 93.2 ± 4.1 91.4 ± 3.2 94.9 ± 2.6 20028 ± 402 1978±338 2912±465 *
CD14 29.1 ± 10.7 29.7 ± 8.9 24.9 ± 7.2 518 ± 75 605 ± 64 * 504 ± 36
CDS3 11.2 ± 1.7 20.6 ± 3.5 * 21.1 ± 1.5 * 692 ± 66 841±77 * 758 ± 72 *
CDS6 38.0 ± 2.8 52.4 ± 4.7 70.8 ± 3.5 * 916±224 1421±478 * 1377±260 *
* Отличия от нДК достоверны прир < 0.05 в парном f-тесте.
Рис. 2. Дозовая зависимость действия ДК, стимулированных БЦЖ, на продукцию ИНФ-у (а, б и в) и ФНО-а (г, д и е) лимфоцитами. По оси Х - количество ДК в культуре. По оси У - продукция ИНФ-у и ФНО-а. Типы ДК обозначены под графиком: 1 - незрелые ДК, 2 - ДК, стимулированные ЛПС и ФНО-а, 3, 4 и 5 - ДК, стимулированные БЦЖ в концентрациях 0.002; 0.02 и 0.2 дозы/мл соответственно. Рис. а и г - культуры лимфоцитов детей с ДК детей, б и д - лимфоциты взрослых с ДК взрослых, в и е - лимфоциты взрослых с ДК детей. Белыми стрелками обозначены достоверные отличия от нДК (р < 0.05), черными стрелками - отличия от ДК-ЛПС (р < 0.05)
этого цитокина в CD4+ Т-клетках новорожденных. Тем не менее, известно, что вакцина БЦЖ в организме детей индуцирует ответ Тх1, сравнимый с таковым у взрослых [5]. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ограничение продукции ИНФ-у у лимфоцитов новорожденных может быть, по крайней мере, частично снято при использо-
вании мощных активаторов, таких как ДК, обработанные БЦЖ.
Другим цитокином, оцениваемым в данной работе, был ФНО-a. Этот провоспалительный цитокин продуцируется клетками врожденного иммунитета, Тх1, цитотоксическими CD8+ Т-клетками и естественными киллерами. Подобно ИНФ-у, уровень продукции ФНО-a в
смешанных культурах лимфоцитов и ДК детей был существенно ниже, чем в культурах клеток взрослых (рис. 2г и 2д). При использовании ДК и лимфоцитов взрослых БЦЖ вызывала мощное дозозависимое усиление продукции ФНО-а. В то же время БЦЖ не увеличивала способность ДК детей стимулировать продукцию ФНО-а лимфоцитами детей. Дефицит продукции ФНО-а, который наблюдается в смешанных культурах ДК и лимфоцитов новорожденных детей, полностью не исчезал при замене лимфоцитов детей на лимфоциты взрослых (рис. 2е).
Заключение
Показано, что обработка незрелых ДК вакциной БЦЖ в условиях in vitro эффективно индуцирует созревание ДК, увеличивая экспрессию мембранных молекул HLA-DR, CD83 и CD86. Инкубация незрелых ДК детей и взрослых с вакциной БЦЖ значительно увеличивает их способность стимулировать лимфоциты к продукции ИНФ-у. Обработанные вакциной БЦЖ ДК взрослых значительно усиливают свою способность стимулировать продукцию ФНО-а. Инкубация ДК новорожденных с вакциной БЦЖ приводит лишь к небольшому усилению ФНО-индуцирующей способности, причем это усиление проявляется только при воздействии на лимфоциты взрослых, но не новорожденных. Лимфоциты новорожденных, в от-
личие от лимфоцитов взрослых, являются слабыми продуцентами ИНФ-у и ФНО-а.
Список литературы
1. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР Мед., 2010. 970 с.
2. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells // Annu. Rev. Immunology. 2002. V. 20. P. 621-667.
3. Maartens G., Wilkinson R.J. Tuberculosis // Lancet. 2007. V. 370. Р. 2030-2043.
4. Trunz B.B., Fine P., Dye C. Effect of BCG vaccination on childhood tuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness // Lancet. 2006. V. 367. P. 1173-1180.
5. Marchant A., Goldman M. T-cell-mediated immune responses in human newborns: ready to learn? // Clin. Exp. Immunol. 2005. V. 141. P. 10-18.
6. Andersen C.S., Agger E.M., Rosenkrands I. et al. A simple mycobacterial monomycolated glycerol lipid has potent immunostimulatory activity // J. Immunol. 2009. V. 182. Р. 424-432.
7. Sprott G.D., Dicaire C.J., Gurnani K., Sad S., Krishnan L. Activation of dendritic cells by liposomes prepared from phosphatidylinositol mannosides from Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin and adjuvant activity in vivo // Infect. Immun. 2004. V. 72. Р. 5235-5246.
8. Simmons D.P., Canaday D.H., Liu Y. et al. Mycobacterium tuberculosis and TLR2 agonists inhibit induction of type I IFN and class I MHC antigen cross processing by TLR9 // J. Immunol. 2010. V. 185. Р. 2405-2415.
THE ACTION OF BCG VACCINE ON NEONATAL DENDRITIC CELLS IN VITRO M. V. Plekhanova, V.Yu. Talaev, E.I. Efimov, O.N. Babaikina, I.E. Zaichenko
The BCG vaccine in vitro has been shown to induce the phenotypic maturation of adult and neonatal dendritic cells and to increase their ability to stimulate interferon-y production by lymphocytes. The BCG vaccine enhances the ability of adult dendritic cells to stimulate tumor necrosis factor-a production and has almost no effect on this parameter in neonatal dendritic cells.
Keywords: vaccines, dendritic cells, lymphocytes, cytokines.
