CC BY
192
УДК 612.112.94+612.42
ТОЛЕРОГЕННЫЕ ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ -СОЗРЕВАНИЕ И ФУНКЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO
М.Э. Цатуров, В.Ю. Талаев, А.В. Матвеичев, М.В. Талаева О.Н. Бабайкина,
И.Е. Заиченко, М.А. Ломунова, ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора»
Талаев Владимир Юрьевич - e-mail: talaev@inbox.ru
Одной из интенсивно изучаемых областей иммунологии является учение о механизмах иммунной толерантности организма к собственным антигенам. Представления о роли дендритных клеток в этом процессе носят зачастую противоречивый и неясный характер. В данной работе представлены исследования механизмов влияния дендритных клеток с толерогенными свойствами, полученных при культивировании с синтетическим глюкокортикоидом дексаметазоном, на ответ аллогенных лимфоцитов в смешанной лимфоцитарной реакции. Изучались конкурентные взаимодействия обычных и толерогенных дендритных клеток.
Ключевые слова: толерантность, дендритные клетки, дексаметазон, иммунный ответ.
One of intensive explored immunologic area is theory of the works of immune tolerance to self antigens. The idea of function of dendritic cells in this process frequently bear discrepant and unclear disposition. In this study viewes an investigation of arrangement of dendritic cells influence which has tolerogenic properties and derived in synthetic glucocorticoid dexamethasone presence to response of allogenic lymphocytes in mixed lymphocyte reaction. Was searched competitive interaction of conventional and tolerogenic dendritic cells.
Key words: ralerance, dendritic cell, dexamethasone, immune response.
Введение
Одним из самых важных звеньев в механизме иммунного ответа и регуляции гомеостаза иммунной системы являются дендритные клетки (ДК). Термином дендритные клетки объединяются несколько субпопуляций клеток иммунной системы с различными, а порой и кардинально противоположными свойствами [1, 2]. Важнейшей функцией ДК является презентация антигена Т-лимфоцитам. Показано, что ДК в отличие от других антигепрезентирующих клеток способны праймировать наивные Т-лимфоциты, вовлекая последние в процесс первичного иммунного ответа [3]. Кроме презентации антигена, «на плечи» ДК ложится ряд регуляторных функций. Наибольший интерес среди них представляет собой функция, противоположная индукции иммунного ответа - а именно, формирование толерантности - специфической неотвечаемости иммунной системы на антиген. Считается, что толерогенными свойствами обладают незрелые ДК, а также клетки, созревшие в отсутствии инфекционных агентов под действием противовоспалительных цитоки-нов и гормонов [4]. Толерогенная функция ДК также неоднородна, как и сама популяция ДК. Сюда можно включить, например, толерантность к тканям собственного организма, предотвращающая запуск аутоиммунных процессов. Такое важное явление, как сохранение полуаллогенного плода, при нормальном протекании беременности также не обходится без вмешательства ДК со специфическими свойствами. И наконец, заслуживают внимания механизмы выработки толерантности к определенным антигенам при их искусственном введении в организм, а также толерогенный эффект некоторых препаратов со способностью модулировать свойства дендритных клеток [2].
Материалы и методы. Дендритные клетки получали из моноцитов пуповинной крови здоровых доношенных ново-
рожденных и венозной крови здоровых доноров. Из проб стерильной гепаринизированной крови выделяли монону-клеарные клетки над слоем Hystopaque-1077 (Sigma, USA). Для индукции созревания дендритных клеток в лунки с моноцитами добавляли рекомбинантный ГМ-КСФ (80 нг/ мл, Biosource, USA) вместе с ИЛ-4 (20 нг/мл, Sigma, USA) при засеве культур и повторно - на 3-и сутки культивирования. В отдельные лунки с указанными выше стимуляторами при засеве культур вносили натриевую соль фосфата декса-метазона (ДЕКС) (0,4 мкг/мл, KRKA, Slovenia). Моноциты, росшие без всех цитокинов и ДЕКС, использовались в качестве контроля. В культуры с незрелыми ДК добавляли стимуляторы созревания: липополисахарид (ЛПС) Salmonella typhi (1 мкг/мл, ГИСК им. Тарасевича, Москва) или рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли - (ФНО-а) (10 нг/мл, Sigma, USA). Клетки с ФНО-а и ЛПС инкубировали еще одни сутки, затем собирали и использовали для оценки фенотипа и для стимуляции смешанной лимфоцитарной реакции (СЛР).
Функциональные свойства ДК определяли по их способности стимулировать пролиферацию аллогенных лимфоцитов взрослых здоровых доноров в СЛР. В отдельные варианты микрокультур лимфоцитов одновременно вносили обычные зрелые ДК и ДК, росшие в присутствии ДЕКС. Соотношение каждого типа ДК и лимфоцитов составляло 1:25. Лунки без добавления ДК использовались в качестве контрольных. Клетки культивировали в течение 3 суток, затем пробы среды собирали для определения содержания в ней ИФН-7 с помощью иммуноферментных тест-систем «гамма-ИФН-ИФА-Бест» (Вектор-Бест, Новосибирск). Продукция ИФН7 измерялась в пг/мл, а затем расчитывалась в относительных единицах - индексах подавления, при этом за 1 принимались значения продукции ИФН7,
индуцированной обычными зрелыми ЛПС-стимулированными ДК. Для определения пролиферации в лунки вносили меченный тритием метилтимидин («Изотоп», Санкт Петербург) по 0,5 мкКюри на лунку на срок 24 часа.
0,42% Б 91,96%
0,21 % ■' '.'-7,41% : ™
10 10 10 10 10 HLA-DR
« 1СТ
8,86% Г 87,35%
1,97% 1,83%
10 10 10 10 10
CD80
0,02% Д ■ ' 60,72%
0,50% 38,76%
0,23% Е 93,82%
0,17% 5,77%
10 10 10 10 104 10 10
10
HLA-DR
10
HLA-DR
10 10
РИС. 1.
Экспрессия мембранных молекул CD14 (B), CD80 (Г), CD83 (Д) и CD86 (E), а также HLA-DR на дендритных клетках взрослых доноров после стимуляции ИЛ-4 и ГМ-КСФ и последующей активацией ФНО-а и ЛПС. Б - экспрессия CD14 на моноцитах. На рис. А исследуемые клетки выделены в гейт 1 по их способности рассеивать пучок света лазера в соответствии с их размерами и гранулиро-ванностью.
Для исследования экспрессии мембранных маркеров использовали моноклональные антитела к молекулам HLA-DR, CD14 (Сорбент, Москва), CD80, CD83 и CD86 (Caltag, USA), меченные ФИТЦ или фикоэритрином.
Результаты и обсуждение
В данной работе моноциты периферической крови взрослых доноров и пуповинной крови новорожденных при культивировании в течение 7 суток в среде со стимуляторами дифференцировки ИЛ-4 и ГМ-КСФ, а затем, в течение 1 или 2 суток - с ЛПС и ФНОа приобретали характерные морфологические признаки моноцитарных ДК. Размер клеток увеличивался в 1,5-2 раза, при этом клетки теряли адгезивные свойства, становились более округлыми, заметно увеличивалось количество гранул в цитоплазме. По краям плазма-леммы появлялись видимые в микроскоп короткие тонкие отростки. Некоторые клетки распластывались по пластику, образуя длинные крупные отростки. Клетки, культивировав-
шиеся с добавлением в среду дексаметазона, имели такие же размеры что и обычные ДК, однако такие клетки сильно распластывались по пластику и прочно адгезировались с поверхностью, приобретая при этом морфологию, схожую с макрофагальной.
Анализ фенотипа полученных клеток с использованием лазерной проточной цитофлюориметрии показал, что при культивировании с ИЛ-4 и ГМ-КСФ с последующей активацией липополисахаридом и ФНО-а в культуре увеличивается процент клеток, несущих молекулы костимуляции и возрастает плотность экспрессии молекул антигенпрезентации и костимуляции (рис. 1). Так, экспрессия CD80, CD83 и CD86 обнаружена на 87, 60 и 93% дендритных клеток моноцитар-ного происхождения, соответственно. Экспрессия моноци-тарного маркера - молекулы CD14, напротив, резко снижается, и, как правило, проявляется не более чем на 3-4% клеток. На моноцитах, не подвергшихся стимуляции ИЛ-4 и ГМ-КСФ, сохраняется экспрессия CD14 на 90% клеток (рис. 1Б). Присутствие дексаметазона при созревании дендритных клеток приводит к формированию так называемого толеро-генного фенотипа: уже на 3-и сутки культивирования клетки обладают достоверно меньшим уровнем экспрессии кости-мулирующей молекулы CD86, на части клеток сохраняется моноцитарный маркер CD14 (рис. 2) [7, 8]. Данные особенности экспрессии мембранных молекул сохраняются в течение всего срока созревания ДК.
изотипическии контроль -ЙК+ДЕКС
10 CD86
изотипический контроль
—Лк+дис
РИС. 2.
Фенотип ДК, созревание которых проходило в присутствии ДЕКС. Вверху показано рассеивание пучка света лазера в зависимости от гранулированности и размера клеток. Нижние гистограммы показывают экспрессию молекул CD14 и CD86 на ДК. Маркеры М1 и М2 отграничивают светимость клеток, окрашенных маркерами от клеток, к которым были добавлены антитела изотипического контроля.
Проводился анализ функциональных свойств ДК, диффе-ренцировка которых проходила под влиянием модуляторов (индукторов толерогенности). Оценка осуществлялась по
4
4
HLA-DR
4
Û
результатам смешанной лимфоцитарной реакции (СЛР). Аллогенные лимфоциты венозной крови здоровых взрослых доноров культивировались одновременно с ДК двух типов: обычными ДК, культивирование которых проходило в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ, с последующей активацией незрелых ДК липополисахаридом и ФНОа, а также с модулированными ДК, в культуру которых помимо цитокинов был добавлен ДЕКС. В СЛР наблюдались ярко выраженные изменения функциональных свойств ДК, культивировавшихся в присутствии модулятора. При этом влияние ДЕКС на ДК новорожденных и взрослых существенно не различалось. Как и следовало ожидать, наибольший стимулирующий эффект на пролиферацию лимфоцитов оказывали зрелые ДК, культивировавшиеся без модуляторов (рис. 3). Несколько слабее проявляли стимулирующую функцию незрелые ДК.
Влияние ДЕКС на процесс созревания ДК приводило к полной потере ими митогенной активности. Пролиферативный ответ оставался на уровне лимфоцитарного контроля, как для ДК взрослых, так и детей, независимо от типа активаторов ДК. Концентрация ИФН7 в СЛР, стимулированных с помощью ДК-ДЕКС новорожденных и взрослых, при использовании в качестве активатора ФНОа, была в среднем в 5,8 раза ниже по сравнению с обычными ДК. Применение ЛПС в качестве активатора не приводило к повышению митогенной активности и стимуляции продукции ИФН7 (рис. 3).
Кроме прямого воздействия модулированных ДК на алло-генные лимфоциты, нами изучалось конкурентное взаимодействие стимулирующих ДК и ДК, имеющих толерогенные свойства. В вариантах культур СЛР, в которых одновременно применялись обычные и модулированные ДК, картина была несколько иной. Пролиферативный ответ в таких культурах при использовании ДК новорожденных, активированных ФНОа или ЛПС был статистически достоверно снижен в 2,4 и 4,5 раза соответственно. Причем, необходимо отметить, что наибольший эффект подавления пролиферации лимфоцитов достигается при использовании обычных ДК и ДК-ДЕКС, активированных на втором этапе созревания ЛПС. Снижение пролиферации при ответе лимфоцитов в культуре с ДК и ДК-ДЕКС взрослых было отмечено только при активации дендритных клеток ФНОа, однако это статистически не подтверждается в парном т-тесте.
ДК-ДЕКС новорожденных при одновременном использовании с обычными ДК при активации ФНОа снижают продукцию ИФН7 лимфоцитами в 2 раза, однако сравнение с обычными ДК в парном т-тесте не выявило статистической достоверности. При использовании дендритных клеток новорожденных, активированных липополисахаридом, наблюдается стойкое снижение продукции ИФН7 во всех экспериментах (рис. 3). В вариантах культур с использованием конкурирующих ДК взрослых отмечены более низкие значения продукции ИФН7, это характерно для обоих типов активаторов ДК. При этом сильнее всего эффект достигается при использовании ФНОа (продукция ИФН7 ниже более чем в 2 раза) (рис. 3 - продукция ИФН7).
Механизмы конкурентного взаимодействия стимулирующих и толерогенных ДК могут быть различными. Возможно эффект подавления связан с конкуренцией при физическом контакте ДК и лимфоцитов. Однако, скорее всего, в данных процессах задействованы более специфичные активные механизмы. Так, это в первую очередь может быть связано с продукцией ИЛ-10 дендритными клетками, подвергшимися воздействию ДЕКС, а также и продукцией ИЛ-10 самими Т-лимфоцитами [5, 6]. Этот противовоспалительный цито-кин может напрямую подавлять активацию Т-лимфоцитов в культуре. Кроме того, до конца не ясен вклад факторов созревания дендритных клеток - микробных паттернов и провоспалительных цитокинов в процессы выработки толе-рогенных свойств ДК. В работе показан неоднозначный эффект при использовании ЛПС и ФНОа в качестве активаторов ДК.
Заключение
Применение ДЕКС на стадии начального созревания ДК из моноцитов периферической крови взрослых доноров и новорожденных детей приводит к полному подавлению стимулирующих свойств ДК. Если ДК, модулированные дек-саметазоном внести в культуру аллогенных лимфоцитов одновременно с обычными ДК в тех же пропорциях, имеет место конкуренция за образование иммунного синапса
РИС. 3.
Ответ аллогенных лимфоцитов на одновременную стимуляцию обычными ДК и ДК, созревание которых проходило в присутствии индукторов толерогенности. Верхняя диаграмма - пролиферативный ответ, нижняя - продукция ИФН7. Звездочкой отмечены статистически достоверные отличия от ДК в парном т-тесте (р<0,05).
между обычными стимулирующими ДК и модулированными ДК. В результате чего количество детектируемого ИФН-у в
таких культурах снижается, а также это негативно влияет на пролиферативный ответ. Важным отличием свойств ДК новорожденных от ДК взрослых является более выраженное подавление митогенной активности в культурах с конкурентным влиянием обычных и модулированных ДК. И
ЛИТЕРАТУРА
1. Banchereau J., Briere F., Caux C., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2000. № 18. Р. 767 - 811.
2. Steinman R.M., Hawiger D., Nussenzweig M.C. Tolerogenic dendritic cells. Annu Rev Immunol. 2003. № 21. Р. 685 - 711.
3. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L et al. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cell. Annu. Rev. Immunology. 2002. Vol. 20. P. 621 - 667.
4. Ureta G., Osorio F., Morales J., Rosemblatt M., Bono M.R., Fierro J.A. Generation of dendritic cells with regulatory properties. Transplant Proc. 2007. Apr. № 39 (3). Р. 633 - 637.
5. Esther C. de Jong, Pedro L. Vieira, Pawel Kalinski, and Martien L. Kapsenberg. Corticosteroids inhibit the production of inflammatory mediators in immature monocyte-derived DC and induce the development of tolerogenic DC3. Journal of Leukocyte Biology. 1999. 66 р.
6. Bosma B.M., Metselaar H.J., Nagtzaam N.M. et al. Dexamethasone transforms lipopolysaccharide-stimulated human blood myeloid dendritic cells into myeloid dendritic cells that prime interleukin-10 production in T cells. Immunology. 2008. № 125. Р. 91-100.
7. Талаев В.Ю., Цатуров М.Э., Бабайкина О.Н., Ломунова М.А., Никонова М.Ф., Талаева Е.Б., Матвеичев А.В. Действие интерлейкина-7 и дексаметазона на созревание моноцитарных дендритных клеток новорожденных. Иммунология. 2007. Т. 28. № 4. С. 208-211.
8. В.Ю. Талаев, И.Е. Заиченко, О.Н Бабайкина, М.А. Ломунова, М.Э. Цатуров, Е.Б. Талаева. Совместное действие дексаметазона и интерлейкина-7 на созревание Т-лимфоцитов и дендритных клеток новорожденных и взрослых in vitro. Тезисы доклада на VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов и III Конференции по иммунотерапии, Москва 11 - 13 сентября 2006. С. 183.
