CC BY
35
УДК 615.371:616-097
РАЗРАБОТКА СПОСОБА ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ВАКЦИН НА ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ in vitro
В.Ю. Талаев, Е.И. Ефимов, М.В. Талаева, А.В. Матвеичев,
М.Э. Цатуров, О.Н. Бабайкина, И.Е. Заиченко, ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора»
Талаев Владимир Юрьевич - e-mail: talaev@inbox.ru
Исследовали действия вакцин на созревание ДК новорожденных и взрослых in vitro на примере живой вакцины БЦЖ и рекомбинантной вакцины гепатита В. Показано, что ДК, обработанные вакциной БЦЖ, демонстрируют умеренно-зрелый фенотип, но чрезвычайно эффективно стимулируют продуцию ИНФ-g Т-лимфоцитами. В то же время, вакцина гепатита В, стимулирует ИНФ-индуцирующую способность только у ДК взрослых, не оказывая существенного действия на аналогичный функциональный параметр ДК новорожденных.
Ключевые слова: вакцина, новорожденные, дендритные клетки, Т-лимфоциты, интерферон-g
We investigate in vitro action of vaccines upon dendritic cells of newborns and adults using live BCG vaccine and recombinant hepatitis B vaccine. It was shown, that dendritic cells, treated with BCG vaccine, demonstrated semi-mature phenotype, but stimulated interferon-g production by T-lymphocytes very efficiently. At the same time, hepatitis B vaccine stimulated interferon-g-stimulating capacity of dendritic cells only in adults, with no significant action upon this feature in newborns.
Key words: newborns, dendritic cells, T-cells, interferon-g.
Введение
Важнейшим свойством иммунной системы является способность отличать чужеродные структуры, в частности, макромолекулы инфекционных агентов от молекул собственного организма. Долгое время считалось, что эта функция различения «своего» и «чужого» осуществляется исклю-
чительно лимфоцитами. Роль антигенпрезентирующих клеток сводилась лишь к сбору доступного для фагоцитоза и пиноцитоза материала, а затем, пассивному представлению полученной смеси Т-лимфоцитам - клеткам, в функцию которых входит поиск чужеродных молекул - антигенов. Однако исследования последних лет показали, что первичное
распознавание инфекционных агентов осуществляет особая группа антигенпрезентирующих клеток - дендритные клетки (ДК). Эти клетки с помощью своих толл-подобных рецепторов могут обнаружить ограниченное количество наиболее типичных для микроорганизмов молекул - т. н. молекулярных паттернов патогенов (МПП) [1, 2]. При обнаружении МПП миелоидные дендритные клетки покидают место своей первичной локализации в дерме, слизистой и других тканях организма и мигрируют в региональный лимфоидный орган, где вовлекают в иммунный ответ Т-лимфоциты, распознавшие принесенные антигены [3, 4]. Т-лимфоциты размножаются и участвуют в устранении инфекции, а оставшиеся после этого лимфоциты обеспечивают иммунологическую память [5].
Распознавание различных МПП дендритными клетками запускает продукцию ими различных наборов мембранных молекул и интерлейкинов (ИЛ), что определяет направление
дифференцировки распознавших антиген Т-лимфоцитов. Так, наивный CD4+ Т-лимфоцит может дифференцироваться в Т-хелпер первого типа (Тх1), Тх2 или Тх17 [5, 6]. От этого, в свою очередь, будет зависеть тип иммунного ответа - пойдет ли он по пути стимуляции клеточных иммунных реакций, продукции антител или запустит хроническое воспаление [5]. Незрелые ДК, не контактировавшие с МПП, являются слабыми индукторами иммунного ответа, а при определенных обстоятельствах могут подавлять ответ на антиген [7, 8]. Таким образом, распознавание инфекционных агентов осуществляется в несколько этапов с использованием двух принципиально различных систем поиска «чужого» дендритными клетками и лимфоцитами. При этом, характер иммунного ответа зависит от результата работы обеих этих систем.
Эти положения становятся чрезвычайно актуальными при разработке новых вакцин, особенно вакцин, основанных на рекомбинантных антигенах. Вакцины, представляющие собой убитые или живые аттенуированные микроорганизмы, имеют не только богатый антигенный состав, но и полноценный набор МПП. Введение таких вакцин вызывает реакцию иммунной системы, весьма точно моделирующую развитие иммунного ответа на инфекцию, начиная с процесса созревания поглотивших вакцину дендритных клеток. Однако свойства некоторых микроорганизмов не позволяют создавать на их основе живые или убитые корпускулярные вакцины. В связи с этим создаются вакцины на основе очищенных, в том числе, рекомбинантных антигенов микроорганизмов. Эти вакцины содержат наиболее иммуногенные антигены, но могут вовсе не содержать МПП, необходимых для полноценной стимуляции ДК. В связи с этим существует насущная необходимость исследования реакции ДК детей и взрослых на вакцины и их потенциальные компоненты, в частности, МПП и синтетические лиганды толл-подобных рецепторов. Такие исследования позволят разработать методы оценки действия новых вакцин на созревание ДК и поляризацию иммунного ответа, а в будущем позволят разрабо-
тать вакцины, не только несущие антигенную информацию,
но и направляющие иммунный ответ по пути, наиболее выгодному для защиты от конкретной инфекции.
Целью данной работы было исследование действия вакцин на созревание ДК новорожденных и взрослых in vitro на примере живой вакцины БЦЖ и вакцины гепатита В (ВГВ), представляющей собой рекомбинантный HBs антиген, сорбированный на оксиде алюминия.
Материал и методы
ДК получали из моноцитов пуповинной крови здоровых новорожденных и венозной крови взрослых здоровых доноров. Для этого выделяли мононуклеарные клетки над слоем
Hystopaque-1077 (Sigma, USA) традиционным способом. Затем с помощью адгезии на 24-луночных планшетах (Costar, USA) выделяли прилипающие моноциты. В лунки вносили среду DME (Sigma, USA) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Санкт Петербург), L-глютамином, ß-меркаптоэтанолом и пируватом натрия. Для индукции созревания ДК добавляли рекомбинантные человеческие rM-КСФ (80 нг/мл, Biosource, USA) и ИЛ-4 (20 нг/мл, Invitrogen, USA). Клетки инкубировали 6 суток при +37оС и 5% СО2, повторно добавляя rM-КСФ и ИЛ-4 на третьи сутки культивирования. Через 6 суток среду в лунках заменяли на новую. Для получения зрелых ДК, используемых в качестве стандарта, в лунки вносили липополисахарид (ЛПС) Salmonella typhi (1 мкг/мл, Отраслевой стандарт образца пирогена, ГИСК им. Тарасевича, Mосква) и рекомбинантный фактор некроза опухоли-g (ФНО) (10 нг/мл, Sigma, USA). В другие лунки вносили исследуемые вакцины: БЦЖ (Институт им. Гамалеи, г. Mосква) и ВГВ в концентрациях 0,2; 0,02 и 0,002 дозы/мл. Для получения незрелых ДК в лунки не вносили стимуляторов. Через 24 часа культивирования ДК собирали. Функциональные свойства полученных клеток определяли по их способности стимулировать пролиферацию аллогенных лимфоцитов и продукцию ими ИНФ-g. Для этого лимфоциты засевали в лунки 96-луночных планшетов в среде DME с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и L-глютамином в концентрации 106 клеток/мл (2 • 105 клеток/лунку). Затем в лунки вносили исследуемые ДК в количестве 1, 2 и 4% от числа лимфоцитов. Лунки без ДК использовались в качестве контрольных. Каждый вариант микрокультуры засевался в трех повторах. Планшеты инкубировали 72 ч. при +37оС и 5% СО2, отбирали пробы надо-садков для иммуноферментного анализа содержания интерферона-g (ИНФ-g) тест-системой Вектор-Бест и вносили в лунки по 0,5 мкКюри меченного тритием метилтимиди-на для оценки пролиферации. Планшеты культивировали еще 24 часа, замораживали, размораживали, хроматин клеток переносили на стекловолокнистые фильтры (Titertek, USA) и анализировали с помощью ß-сцинцилляционного счетчика Beckman. Результаты выражали в импульсах в минуту (имп./мин.). Для исследования экспрессии мембранных маркеров использовали моноклональные антитела
к молекулам HLA-DR (Сорбент, Москва), CD80, CD83 и CD86 (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA), меченные ФИТЦ или фикоэритрином. Окрашенные клетки анализировали на лазерном проточном цитофлюориметре FacsCantoIl (BD Biosciences Immunocytometry Systems, USA) в режиме двухцветной цитометрии. Результаты обрабатывали с помощью программного обеспечения FacsDiva.
Результаты и обсуждение
Цитометрический анализ показал, что БЦЖ дозозависимо усиливает экспрессию молекул, необходимых дендритным клеткам для презентации антигенов и стимуляции Т-лимфоцитов (рис. 1). После обработки БЦЖ на клетках увеличивается количество молекул главного комплекса гистосовместимости HLA-DR и костимулирующих молекул CD80. Рост плотности экспрессии этих молекул на гистограммах отражается смещением пика клеток вправо по шкале яркости окрашивания. Возрастает количество ДК, несущих костимулирующие молекулы CD83 и CD86, что проявляется в увеличении высоты пика окрашенных, отличающихся от изотипического контроля, клеток. В результате ДК, стимулированные БЦЖ, превосходят незрелые ДК по экспрессии исследуемых молекул, однако уступают по этому параметру стандартным зрелым ДК, полученным с помощью ЛПС и ФНО.
35
30
25
■¡=20
3
° 15 10 5 0
10“ 101 1C2 103 104 105
PE-A HLA-DR
iDC_Isotype control.fcs - iDC CD86.fcs
-mDC_BCG002_CD86.fcs mDC_BCG02_CD86.fcs ■mDC CD86.fcs
РИС. 1.
Экспрессия CD80, HLA-DR, CD83 и CD86 на незрелых ДК, ДК, стимулированных БЦЖ, и стандарнтых зрелых ДК. Результат цитометри-ческого анализа. Названия исследуемых молекул - под осью Х, справа. По оси X - яркость окрашивания, по оси Y - количество клеток. Отрезок М1 обозначает клетки, экспрессирующие соотв. молекулы.
ДК взрослых доноров, обработанные БЦЖ, также занимают промежуточное положение между незрелыми ДК и стандартными зрелыми ДК по способности стимулировать пролиферацию лимфоцитов (рис. 2).
PE-A
-о- незрелые ДК -«-зрелые ДК (ЛПС+ФНО)
-Д-ДК-БЦЖ 0,002 -й-ДК - БЦЖ 0,02
-*-ДК - БЦЖ 0,2
РИС. 2.
Дозовая зависимость действия ДК, стимулированных БЦЖ, на пролиферацию лимфоцитов. По оси Х - доля ДК в культуре от количества лимфоцитов (%). По оси Y - пролиферация лимфоцитов (имп./мин.). Типы ДК обозначены под графиком.
-п- незрелые ДК зрелые ДК (ЛПС+ФНО)
-Д- ДК - БЦЖ 0,002 -А- ДК - БЦЖ 0,02
-*-ДК - БЦЖ 0,2
РИС. 3.
Дозовая зависимость действия ДК, стимулированных БЦЖ, на продукцию ИНФ-у лимфоцитами. Верхний график - в абсолютных значениях (пг/мл ИНФ-у), нижний график - в относительных значениях (объяснение в тексте). По оси Х - количество ДК в культуре. По оси Y - продукция ИНФ-у. Типы ДК обозначены под графиком. Значком * обозначены достоверные отличия от зрелых ДК (р<0,05), значком ф - отличия от незрелых ДК (р<0,05).
В то же время, ДК, стимулированные БЦЖ, демонстрируют чрезвычайно сильную способность стимулировать продукцию ИНФ-у Т-лимфоцитами. Так, ДК, стимулированные
высокой концентрацией БЦЖ, превосходят по своей ИНФ-индуцирующей способности не только незрелые ДК, но и стандартные зрелые ДК. Однако при статистическом анализе данных, выраженных в абсолютных единицах (пг/мл) нам не удалось выявить статистической достоверности этих различий в связи с большим разбросом индивидуальных значений продукции ИНФ-у лимфоцитами различных доноров (рис. 3, верхний график).
Для уменьшения влияния индивидуальных особенностей доноров на оценку свойств ДК мы применили метод обработки данных, при котором концентрации ИНФ-у выражались в относительных единицах (%), причем за 100% принималась концентрация ИНФ-у, продуцируемая лимфоцитами донора в ответ на стимуляцию максимальной используемой дозой стандартных зрелых ДК. Результат такой обработки данных представлен на нижнем графике рис. 3. Как видно из рис. клетки, стимулированные БЦЖ в концентрациях 0,2 и 0,02 дозы/мл достоверно превосходят незрелые ДК по своей ИНФ-индуцирующей способности, причем максимальный выход ИНФ-у наблюдается при использовании клеток, стимулированных высокой дозой БЦЖ, а не при использовании стандартных зрелых ДК. Существенных различий ответа ДК взрослых и новорожденных на вакцину БЦЖ не обнаружено.
моноциты -»-зрелые ДК (ЛПС+ФНО) -±-ДК ВГВ 0,2 дозы/мл
РИС. 4.
Действие ДК, стимулированных ВГВ, на пролиферацию лимфоцитов. По оси Х - доля ДК в культуре. По оси У - пролиферация лимфоцитов в относительных единицах. Типы ДК обозначены под графиком. Значком * обозначены достоверные отличия от зрелых ДК (р<0,05), звездочкой - отличия от контрольных лимфоцитов (р<0,05).
Таким образом показано, что ДК, стимулированные БЦЖ, обладают относительно слабо выраженными признаками фенотипической зрелости и умеренной способностью сти-
мулировать размножение лимфоцитов, но в то же время, имеют чрезвычайно выраженную способность стимулировать Т-лимфоциты к продукции ИНФ-у. Как известно, ИНФ-у является ключевым цитокином Тх1, которые управляют клеточными формами адаптивного иммунного ответа, важнейшего для защиты от туберкулеза.
ДК новорожденных детей после культивирования с ВГВ (0,2 дозы/мл) приобретали способность стимулировать пролиферацию лимфоцитов детей столь же эффективно, как и стандартные зрелые ДК (рис. 4).
Обработанные ВГВ дендритные клетки взрослых также эффективно стимулировали пролиферацию лимфоцитов взрослых и лишь незначительно уступали стандартным зрелым ДК. Достоверные различия между этими клетками наблюдались лишь при использовании среднего соотношения ДК и отвечающих лимфоцитов (рис. 4). Наряду со способностью стимулировать пролиферацию, ДК взрослых после обработки ВГВ приобретали способность эффективно стимулировать продукцию ИНФ-у (рис. 5).
зрелые ДК(ЛПС+ФНЮ -*-ДК-ВГВ0,2дозы
РИС. 5.
Действия ДК, стимулированных ВГВ, на продукцию ИНФ-у лимфоцитами. По оси У - продукция ИНФ-у в относительных единицах. Значком * обозначены достоверные отличия от зрелых ДК (р<0,05), звездочкой - отличия от нестимулированныхлимфоцитов (р<0,05).
Статистически достоверных различий этого параметра ВГВ-обработанных ДК и стандартных зрелых ДК у взрослых не обнаружено. Иные результаты продемонстрировал анализ ИНФ-индуцирующей способности ДК новорожденных. ВГВ практически не усиливает ИНФ-индуцирующую способность ДК новорожденных. Клетки после обработки вакциной запускают лишь незначительную продукцию ИНФ-у, достоверно не отличающуюся от контрольных значений культур лимфоцитов, росших без ДК. В то же время стандартные зрелые ДК дозозависимо индуцируют мощную
продукцию ИНФ-g, достоверно отличающуюся, как от контрольных значений нестимулированных лимфоцитов, так и от значений продукции этого цитокина, индуцированной ВГВ-стимулированными ДК (рис. 5).
Заключение
Показана возможность использования ДК для оценки действия вакцин в функциональных тестах in vitro и разработана методика анализа полученных результатов. С использованием этой методики показано, что живая вакцина БЦЖ индуцирует созревание ДК, проявляющееся в изменении фенотипа и функциональных свойств этих клеток. ДК, обработанные вакциной БЦЖ, наиболее эффективно запускают созревание Тх1 - клеток-продуцентов ИНФ-g и стимуляторов клеточных форм иммунных реакций. В то же время, рекомбинантная вакцина гепатита В, стимулирует ИНФ-индуцирующую способность только у ДК взрослых, не ока-
зывая существенного действия на аналогичный функциональный параметр ДК новорожденных. Щ
ЛИТЕРАТУРА
1. Janeway C. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp.Quant. Biol. 1989. № 54. Р. 1-13.
2. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета. Иммунология. 2005. № 26. С. 368-377.
3. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 2006. № 27. С. 368-378.
4. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunology. 2002. № 20. Р. 621-667.
5. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР Медиа, 2010. 970 с.
6. Wu L., Dakie A. Development of dendritic cell system. Cell. Mol. Immunol. 2004. № 1. Р. 112-118.
7. Steinman R.M., Hawiger D., Nussenzweig M.C. Tolerogenic dendritic cells. Annu. Rev. Immunology. 2003. № 21. Р. 685-711.
8. Wallet M.A., Sen P., Tisch R. Immunoregulation of Dendritic Cells. Clinical Medicine & Research. 2005. № 3. Р. 166-175.
