CC BY
79
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2013 УДК 615.371:579.873.21].015.4
В.Ю. Талаев, М.В. Плеханова, И.Е. Зайченко, О.Н. Бабайкина ДЕЙСТВИЕ ВАКЦИН НА ЭКСПРЕССИЮ ХЕМОКИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
дендритными клетками новорожденных и взрослых in VITRO
ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, 603950, г Нижний Новгород, РФ
Исследовали действие вакцин против туберкулеза и гепатита В на экспрессию хемокиновых рецепторов дендритными клетками (ДК), полученными из моноцитов крови новорожденных детей и взрослых. Показано, что живая туберкулезная вакцина БЦж индуцирует слабое, но достоверное усиление экспрессии хемокинового рецептора CCR7. Рекомбинантные дрожжевые вакцины против гепатита В, а также их компонент гель гидрооксида алюминия вызывают усиление экспрессии не только CCR7 , но и CXCR5 на ДК детей и взрослых. По нашему мнению, экспрессия CXCR5 на ДК может приводить к переадресации части потока антигенов вакцины из Т-клеточной зоны в фолликулы лимфатических узлов, способствуя развитию гуморального иммунного ответа.
Ключевые слова: вакцины, дендритные клетки, лимфоциты, миграция VYu. Talayev, M.V. Plehanova, I.Ye. Zaichenko, O.N. Babaykina
effect of vaccines on the expression of chemokine receptors on dendritic cells of newborns and adults in vitro.
Acad. I. N. Blokhina Nizhny Novgorod Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Federal Consumer Rights Protection and Human Health control Service, Nizhny Novgorod, Russian Federation
We studied the effect of vaccines against tuberculosis and hepatitis B on the expression of chemokine receptors on dendritic cells derived from blood monocytes of newborns and adults in vitro. It is shown that the live tuberculosis vaccine BCG induces a weak but statistically significant increase in the expression of the chemokine receptor CCR7. Recombinant yeast vaccines against hepatitis B, as well as its component - aluminum hydroxide gel cause increase not only of CCR7, but CXCR5 too expression on the dendritic cells of children and adults. In our opinion, CXCR5 expression on the dendritic cells may lead to redirection of the part of flow of vaccine antigens from the T-cell zones to lymphatic node follicles, promoting the development of a humoral immune response.
Key words: vaccine, dendritic cells, lymphocyte, migration
Введение
Миелоидные дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками, способными вовлекать наивные Т-лимфоциты в иммунный ответ [1]. Участие ДК в запуске иммунного ответа обеспечивается не только их способностью поглощать микроорганизмы и презентировать их антигены лимфоцитам, но и уникальными миграционными свойствами, которые позволяют этим клеткам собирать антигены в различных тканях организма и транспортировать их в региональные лимфоидные органы. Именно периферические лимфоидные органы, в первую очередь лимфатические узлы (ЛУ), являются местом инициации адаптивного иммунного ответа, поскольку лишь внутри этих органов формируются оптимальные соотношения антиген-презентирующих клеток, Т- и В-лимфоцитов, специфическая цитокиновая атмосфера, а также условия для межклеточных контактов и бурного размножения активированных лимфоцитов. Кроме того, наивные Т-лимфоциты до своего первого контакта с антигеном находятся в постоянной рециркуляции, но при этом практически не выходят из кровотока в нелимфоидную ткань. Лишь когда кровь приносит их в посткапиллярные венулы периферического лимфоидного органа, они взаимодействуют с эндотелием и под действием локально продуцируемых хемокинов CCL19 и CCL21 покидают кровяное русло. В лимфоидной ткани они контактируют с ДК в поисках клоноспецифичного антигена. Если антиген не обнаружен, они покидают лимфоидный орган с оттекающей лимфой и возвращаются в кровоток. При обнаружении антигена Т-лимфоцит активируется и начинает процесс размножения и созревания, в результате чего потомки активированного
Талаев Владимир Юрьевич (Talayev vladimir Yurevich), ta-laev@inbox.ru.;
лимфоцита приобретают функциональные свойства, необходимые для участия в иммунном ответе и формирования иммунологической памяти [2]. Таким образом, для эффективного запуска иммунного ответа на инфекцию или вакцину ДК должны не только поглотить антиген, но и перенести его из места внедрения в лимфоидный орган и при этом подвергнуться процессу функционального созревания.
Сигналом, индуцирующим миграцию и созревание ДК, является распознавание молекулярных признаков инфекции. Следует отметить, что ДК лишены антигенраспознающих рецепторов, подобных лимфоцитарным. Среди всего разнообразия молекул бактерий и вирусов ДК способны идентифицировать лишь наиболее типичные для больших групп микроорганизмов молекулы - так называемые молекулярные паттерны патогенов (МПП). Основным инструментом для распознавания МПП служат Toll-подобные рецепторы (TLR) [2]. Однако ДК могут быть мобилизованы к миграции в ЛУ не только с помощью TLR, но и через другие рецепторы, в первую очередь рецепторы провоспалительных цитокинов [3-5] и простагландина Е2 [4, 6].
Первой реакцией ДК на распознавание МПП (равно как и на распознавание других признаков инфекции и поражения ткани) является не сиюминутная стимуляция миграции, а временная утрата подвижности, связанная с быстрой реорганизацией актинового цитоскелета и разборкой подосом [7]. Это временное подавление подвижности используется клеткой для интенсификации сбора антигенов в момент обнаружения микроорганизмов и в месте их обнаружения. Однако уже через несколько часов эндоцитозная активность клеток вновь убывает, и подвижность восстанавливается [7]. На мембране ДК снижается количество рецепторов для хемоки-нов периферических и особенно воспаленных тканей (CCR1, CCR5 и CXCR1), а вместо них экспрессируются рецепторы хемокинов, направляющих клетки в лимфатические сосуды
- 318 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
и ЛУ Среди этих вновь экспрессируемых рецепторов ключевую роль отводят CCR7, взаимодействующему с хемокинами ccL19 и ccL21 [3, 8, 9]. На пути миграции ДК значимая продукция CCL21 начинается в эндотелии слепых начальных участков лимфатических капилляров. В нормальной ткани эта продукция невелика, но она существенно возрастает в зоне воспаления под действием интерлейкина-ф (ИЛ-ф) и фактора некроза опухолей а (ФНОа) [10]. В коже роль дополнительного хемоаттрактанта ДК в лимфатическое русло выполняет хемокин CXCL12, распознаваемый рецептором CXCR4 [11]. ДК, привлеченные этими хемокинами, через щелевые проходы между эндотелиальными клетками [8] попадают в лимфатические сосуды, и поток лимфы приносит их в краевой синус ЛУ Под действием градиента CCL19 и CCL21, мощная продукция которых происходит в паракор-тексе [12], ДК преодолевают барьер, состоящий из ретоте-лиальных клеток стенки синуса, слоя коллагенового матрикса и сети ретикулярных стромальных клеток, и мигрируют вглубь коры в Т-клеточную зону ЛУ Продуцентами CCL19 и CCL21 в коре являются клетки высокого эндотелия венул, пронизывающих кору, а также фибробластные ретикулярные клетки стромы ЛУ [3]. Кроме того, сами ДК продуцируют CCL19, который привлекает наивные Т-лимфоциты в непосредственную близость к ДК для презентации антигенов, а также может обеспечивать контакты вновь прибывающих и резидентных ДК для обмена антигенным материалом [13].
Следует отметить, что этот канонический путь миграции миелоидных ДК в Т-клеточные зоны ЛУ отнюдь не единственный. Так, показано, что некоторые ДК дермы кожи и маргинальной зоны селезенки экспрессируют хемокино-вый рецептор CXCR5 [14]. Как известно, этот рецептор и его лиганд CXCL13 играют ключевую роль в миграции CXCR5+ фолликулярных Т-хелперов (фТх) и В-лимфоцитов в перифоликулярные регионы и фолликулы ЛУ. Продуцентами CXCL13 являются фолликулярные ДК стромального происхождения [15] и маргинальные ретикулярные клетки
[16] , которые локализуются под субкапсулярным синусом внутри В-клеточных фолликулов, а также в перифолликуляр-ных регионах между В-клеточными фолликулами. cxcR5+ ДК кожи отвечают на CXCL13 и мигрируют в В-клеточную зону ЛУ при адаптивном переносе [14]. Физиологическая роль такой миграции была недавно доказана B. Leon и соавт.
[17] . Избирательно подавляя экспрессию гена CXCR5 в ДК, Т-лимфоцитах и В-клетках, эти авторы показали, что зависимая от cxcR5 миграция ДК в фолликулы брыжеечных ЛУ критически необходима для оптимального ответа фТх и Т-хелперов второго типа (Тх2) у мышей, инвазированных кишечной нематодой Heligmosomoides polygyrus.
В данной работе мы исследовали действие вакцин против туберкулеза и гепатита В (В! Д'В) на экспрессию хемокиновых рецепторов ДК, полученными из моноцитов крови новорожденных детей и взрослых. Показано, что живая туберкулезная вакцина БЦЖ индуцирует слабое, но достоверное усиление экспрессии хемокинового рецептора ccR7 на ДК взрослых. При стимуляции ДК детей данная вакцина не вызывает увеличения экспрессии этого рецептора на наружной мембране клетки, но приводит к повышению содержания этой молекулы внутри клеток. Рекомбинантные дрожжевые ВПГВ также вызывают небольшое достоверное усиление экспрессии ccR7 на наружной мембране ДК взрослых и внутри ДК новорожденных, но одновременно провоцируют значительное усиление экспрессии cxcR5 на мембране ДК детей и взрослых. Адъювантный компонент ВПГВ гидрооксид алюминия (AL3+), также индуцирует экспрессию cxcR5 на ДК. По нашему мнению, экспрессия cxcR5 на ДК может приводить к переадресации по крайней мере части потока антигенов вакцины из Т-клеточной зоны в фолликулы ЛУ, способствуя тем самым развитию гуморального иммунного ответа.
Материалы и методы. В работе использовали туберкулезную вакцину БЦЖ («Микроген», Москва) и две рекомбинантные ВПГВ: Шанвак-В (Шанта Биотекникс Лимитед, Индия) и ВПГВ производства ЗАО НПК «Комбиотех» (Мо-
сква), а также суспензию геля гидрооксида алюминия («Комбиотех», Москва). Перед использованием ВПГВ трижды отмывали от мертиолята средой для культивирования клеток с помощью центрифугирования. ДК получали из моноцитов пуповинной крови здоровых новорожденных и венозной крови взрослых здоровых доноров. Для этого из проб крови выделяли мононуклеарные клетки над слоем Hystopaque-1077 (Sigma, США). Из полученных клеток выделяли моноциты адгезией на пластике 24-луночных планшет (Costar, США). Для получения из моноцитов незрелых ДК (нДК) в лунки добавляли рекомбинантные человеческие ГМ-КСФ (100 нг/мл, Biosource, США или R&D, США) и ИЛ-4 (20 нг/ мл, Invitrogen, США или R&D, США). Клетки инкубировали 7 сут при 37оС и 5 % СО2, повторно добавляя ГМ-КСФ и ИЛ-4 на 3-и сутки культивирования. Затем к нДК добавляли вакцины в концентрации 0,2 и 0,02 детские дозы на 1 мл или суспензию Al3+ в эквивалентном количестве (50 и 5 мкг/ мл Al3+). Положительными контролями созревания служили ДК, инкубированные с 1 мкг/мл ЛПС E. coli, или с 1 мкг/мл ЛПС Salmonella typhi (ГИСК им. Тарасевича, Москва) и рекомбинантным ФНОа (10 нг/мл, R&D, США), или со смесью медиаторов воспаления следующего состава: 25 нг/мл ИЛ-ф (R&D, USA), 25 нг/мл ИЛ-6 (R&D, США), 50 нг/мл ФНОа (R&D, США), 1 мкг/мл простагландина Е2 (Sigma, США). Отрицательным контролем служили нДК без стимуляторов.
ДК культивировали еще 2 сут, отделяли от ВПГВ или Al3+ центрифугированием над слоем 85% перколла (Sigma, США) и собирали не менее 2-105 клеток для цитофлюориметриче-ского исследования. С помощью лазерной проточной цито-флюориметрии оценивали экспрессию HLA-DR, cD14, cD80, CD83, CD86 и хемокиновых рецепторов CCR2, CCR5, CCR7 и CXCR5. При этом использовали моноклональные антитела (АТ) к HLA-DR, конъюгированные с ФИТЦ и (АТ) к cD14, конъюгированные с фикоэритрином («Сорбент», Москва); АТ к CD80, CD83, СD86 и ^R7, конъюгированные с фикоэритрином (BD Immunocytometric, США); Ат к CXCR5 ^D185), конъюгированные с фикоэритрином (eBiosciences, США); АТ к CD86, конъюгированные с ФИТЦ (Caltag laboratories, USA); АТ к CCR2 (CD192) конъюгированные с AlexaFluor647 (BD Immunocytometric, США); АТ к CD195 (CCR5), конъюгированные с ФИТЦ (BD Immunocytometric, США); Иммунофлюоресцентное окрашивание молекул на наружной мембране проводили традиционным способом, согласно рекомендациям производителей АТ. При окрашивании хемокиновых рецепторов, локализованных внутри клетки, в процедуру вводили дополнительные этапы. Перед окрашиванием клетки переносили в 96-луночные круглодонные планшеты, отмывали фосфатным солевым буфером Дюльбекко А (PBS) с 0,9 % NaN3, надосадок сливали, осадок тщательно разбивали, осторожно постукивая ребром планшета о ладонь, и в лунки добавляли по 180 мкл холодного 4% раствора параформа на PBS. Клетки фиксировали 10 мин при 4°С на шейкере, осаждали и вновь отмывали PBS с NaN3. В лунки добавляли по 180 мкл приготовленного ex temporo 0,1% раствора сапонина и оставляли на 20 мин в темноте на шейкере при комнатной температуре. Затем клетки осаждали, осадок тщательно разбивали и к клеткам добавляли по 20 мкл 0,1% раствора сапонина (Sigma, США) и меченые АТ в количестве, рекомендованном производителем. Инкубировали на шейкере при комнатной температуре 30 мин. Затем добавляли в лунки по 120 мкл 0,1% раствора сапонина и клетки осаждали центрифугированием, отмывали 2 раза в PBS с NaN3, добавляли по 200 мкл 1% раствора параформа и полученную клеточную суспензию переносили в пробирки для цитометрии. Окрашенные клетки анализировали на лазерных проточных цитофлюориметрах FACSCalibur или FACSCantoII (BD Biosciences Immunocytometry Systems, США) в режиме двух- или трехцветной цитометрии. ДК выделяли в гейт по параметрам прямого и бокового светорассеивания.
Статистический анализ проводили с использованием t-теста Стьюдента для зависимых и независимых выборок. Данные представлены в виде M±m. Результаты проточной цитометрии обрабатывали с помощью программного обеспе-
- 319 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
% CCR7+ ДК 45 и 40 -
а
Рис. 1. Действие вакцин на экспрессию CCR7 (а) и CXCR5 (б) на ДК взрослых. Тип клеток обозначен под гистограммами. ДК-ЦТК - клетки, стимулированные смесью ИЛ-1Р, ИЛ-6, ФНОа и про-стагландина Е2, ДК-ЛПС - клетки, стимулированные ЛПС E. coli; концентрация БЦЖ, ВПГВ производства «Комбиотех» и геля A13+ эквивалентны 0,2 детским дозам в 1 мл.
Здесь и на рис. 2-4: * - отличия от нДК достоверны при р<0,05 в парном f-тесте.
Рис. 2. Экспрессия CCR2 и CCR5 на ДК новорожденных. а - экспрессия CCR5 на нДК (тонкая линия) и ДК, стимулированных ЛПС и ФНОа (толстая линия); гистограммы с закрашенным полем - изотипический контроль; б - изменение в динамике утраты CCR5 после активации нДК смесью ЛПС и ФНОа; по оси абсцисс - время (в ч) после активации; по оси ординат - процент CCR5+ ДК; в - средние значения экспрессии CCR2 и CCR5 на ДК, стимулированных вакцинами в концентрации 0,2 детские дозы на 1 мл.
чения CellQuest, FACS Diva и WinMDI 2.8. При этом оценивали процент клеток, несущих маркер и плотность экспрессии данного маркера по геометрической средней яркости свечения окрашенных клеток.
Результаты. Использованные в работе нДК взрослых демонстрировали типичную морфологию и фенотип моноритарных ДК. Это были крупные округлые клетки с овальным, полулунным или разделенным на лопасти ядром и множеством шипообразных отростков на мембране. Подавляющее
большинство клеток экспрессировало молекулу главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR и было лишено моноцитарного маркера CD14. Существенная часть клеток экспрессировала молекулы CD80 и CD86, необходимые для костимуляции Т-лимфоцитов (см. таблицу). Созревание ДК, индуцированное смесью ЛПС и ФНО-а, приводило к значительному увеличению экспрессии CD83 и CD86. Живая вакцина БЦЖ и рекомбинантные ВПГВ эффективно стимулировали фенотипическое созревание нДК взрослых, усиливая экспрессию CD83 и CD86 (см. таблицу).
Экспрессия мембранных молекул на ДК новорожденных детей и взрослых (доля клеток, экспрессирующих соответствующую молекулу в %)
Моле- кула ДК взрослых ДК новорожденных
нДК ДК с ЛПС и ФНОа ДК с БЦЖ* ДК с ВПГВ Шанвак В* нДК ДК с ЛПС и ФНОа ДК с БЦЖ* ДК с ВПГВ Шанвак В* ДК с ВПГВ (Комбиотех*)
HLA-DR 92,1±6,0 93,9±1,9 90,6±3,5 97,3±2,6 96,3±1,0 94,6±2,5 95,9±2,0 96,7±1,1 96,3±0,9
CD14 11,8±6,5 10,2±4,6 7,3±3,6 4,9±3,7 24,5± 8,2 27,6±6,7** 21,9±6,8 18,6±4,5** 17,4±6,4**
CD80 39,7±3,2 53,6±7,8*** Н.о. Н.о. 13,4±11,6 22,4±5,1** Н.о. Н.о. 22,2±13,7
CD83 14,9±2,0 30,8±5,4 *** 24,5±0,2 *** 30,2±4,7*** 14,8± 3,4 16,6± 3,9**** 25,8±4,1*** 27,3±6,0*** 33,2± 7,4***
CD86 46,2±6,2 76,7±5,7 *** 66,8±3,6 *** 74,6±9,4*** 45,0± 6,7 59 9± 7 з**,** 72,4±3,6*** 70,6±9,0 *** 86,8±5,0***
Примечание. * - вакцины в концентрации 0,2 детские дозы в 1 мл; ** - различия между показателями у детей и взрослых достовернь при р<0,05; *** - отличия от нДК достоверны при р<0,05 в парном /-тесте.
- 320 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Рис. 3. Экспрессия CCR7 на ДК новорожденных.
Сверху - пример экспрессии ccR7 на мембране и внутри ДК, стимулированных смесью ИЛ-1р, ИЛ-6, ФНОа и простагландина Е; CCR7+ ДК выделены в гейт R2; снизу - среднее количество (в %) CCR7+ ДК при внутриклеточном окрашивании; тип клеток обозначен под гистограммой.
ДК новорожденных отличались от ДК взрослых определенными фенотипическими признаками незрелости. Существенная часть ДК даже после стимуляции смесью ЛПС и ФНОа, сохраняла моноцитарный маркер CD14, а количество CD80+ и CD83+ клеток в культурах ДК детей было достоверно ниже, чем в культурах клеток взрослых (см. таблицу). Стимуляция нДК детей вакциной БЦЖ, ВПГВ Шанвак В и ВПГВ производства «Комбиотех» приводила к фенотипическому созреванию ДК, которое проявлялось в росте геометрической средней яркости окрашивания HLA-DR (данные не приведены), а также в увеличении количества CD83+ и CD86+ клеток до уровня, характерного для культур ДК взрослых (см. таблицу). Тем не менее содержание CD14+ клеток в культурах ДК детей после стимуляции вакцинами снижалось незначительно и существенно превышало соответствующие показатели культур ДК взрослых.
Стимуляция нДК взрослых вакциной БЦЖ и ВПГВ в концентрации 0,2 детские дозы в 1 мл в условиях in vitro индуцировала экспрессию на мембране клеток хемокинового рецептора CCR7, необходимого для миграции в Т-клеточные зоны ЛУ (рис. 1). Адъвантный компонент ВПГВ гель гидрооксида алюминия в концентрации 50 мкг/мл Al3+, эквивалентной 0,2 детским дозам вакцины на 1 мл, также вызывал слабое, но
достоверное увеличение экспрессии CCR7. Следует отметить, что эффект всех использованных вакцин достоверно не различался, соответствовал уровню действия ЛПС E. coli и существенно уступал эффекту действия смеси провоспалительных цитокинов и простагландина Е2 (см. рис. 1). Совершенно иные результаты получили при оценке действия вакцин и модельных индукторов созревания на экспрессию рецептора CXCR5, направляющего миграцию клеток в В-клеточные зоны ЛУ Показано, что наибольшую экспрессию этого хемокинового рецептора индуцировала инкубация нДК взрослых с ВПГВ или со смесью провоспалительных цитокинов и простагландина Е2, тогда как вакцина БЦЖ не влияла на экспрессию этого рецептора (см. рис. 1). Гель Al3+ также индуцировал экспрессию CxCR5 на мембране ДК.
При исследовании экспрессии хемокиновых рецепторов на ДК новорожденных мы изучали не только содержание CCR7 и CXCR5, но и экспрессию рецепторов CCR2 и CCR5, управляющих движением нДК и их предшественников в периферические ткани и очаги воспаления. Показано, что CCR5 присутствует на существенной части моноцитарных нДК новорожденных (рис. 2, а) и его экспрессия постепенно падает в течение 2 сут созревания, индуцированного смесью ЛПС и ФНОа (рис. 2, б). Количество клеток, несущих CCR2 на наружной мембране в культурах нДК новорожденных, оказалось невелико, и оно также снижалось в ходе созревания под действием ЛПС и ФНОа. Стимуляция нДК вакциной БЦЖ приводила к достоверному снижению экспрессии CCR2 и CCR5, тогда как ВПГВ индуцировала меньший и статистически недостоверный эффект (рис. 2, в).
Экспрессия CCR7 на наружной мембране ДК новорожденных была чрезвычайно низкой в большинстве полученных нами культур. Инкубация ДК детей с вакцинами, ЛПС E. coli или со смесью ЛПС и ФНОа не вызывала достоверного увеличения поверхностной экспрессии CCR7 (данные не приведены). Лишь стимуляция клеток смесью провоспалительных цитокинов и простагландина Е2 приводила к появлению значимого количества CCR7 на мембране, но низкая яркость его окрашивания не позволяла уверенно дифференцировать CCR7+ и CCR7" клетки (рис. 3). Для окрашивания CCR7, расположенного не только на поверхности, но и внутри клеток, мы использовали дополнительные этапы фиксации клеток и пермеабилизацию цитоплазматической мембраны сапонином. Внутриклеточное окрашивание позволило существенно увеличить как количество выявляемых CCR7+ клеток, так и яркость их флюоресценции (см. рис. 3). При таком способе окрашивания среднее количество CCR7+ клеток в культурах нДК новорожденных составило 10 % (см. рис. 3). Смесь провоспалительных цитокинов и простагландина Е2 вызвала значительное увеличение количества CCR7+ ДК (в 5,1 ± 1,9 раза) по сравнению с таковым нДК. ЛПС E. coli индуцировал лишь полуторократное увеличение доли CCR7+ клеток. Все использованные вакцины вызвали слабое, но статистически достоверное увеличение количества CCR7+ клеток (см. рис. 3). При стимуляции ДК вакциной Шанвак В и ВПГВ производства «Комбиотех» в концентрации 0,2 детские дозы в 1 мл зарегистрировали одинаковую кратность прироста экспрессии - в 1,4 ± 0,2 раза. Вакцина БЦЖ оказалась самым слабым стимулятором экспрессии CCR7 в детских ДК. Кратность увеличения экспрессии составила лишь 1,2 ± 0,1, но и такой слабый прирост оказался достоверным (р=0,033 в парном t-тесте).
Созревание ДК новорожденных, вызванное смесью медиаторов воспаления или обеими использованными ВПГВ в концентрации 0,2 детские дозы в 1 мл, сопровождалось существенным ростом экспрессии CxCR5 на поверхности клеток (рис. 4). При этом максимальные значения доли CXCR5+ клеток, а также яркости их флюоресценции наблюдали в культурах ДК, стимулированных ВПГВ производства «Комбиотех» в концентрации 0,2 детские дозы в 1 мл. Гель Al3+ также индуцировал экспрессию CxCR5 на мембране ДК, соизмеримую с действием ВПГВ. Вакцина БЦЖ в использованных концентрациях не оказывала никакого влияния на экспрессию CXCR5 (см. рис. 4).
- 321 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2013
Рис. 4. Сверху - пример экспрессии CXCR5 на ДК новорожденного; тип клеток обозначен в картушах над графиками dot plot; cxcR5+ ДК выделены в гейт R2; снизу - среднее количество (в %) cxcR5+ ДК; использованные стимуляторы и их концентрация (детские дозы в 1 мл) обозначены под гистограммой.
Обсуждение. В работе исследовалли действие на ДК вакцин, принципиально различающихся как по составу, так и по типу индуцируемой иммунной реакции. Одной из этих вакцин была живая туберкулезная вакцина БЦЖ - индуктор преимущественно клеточного иммунного ответа. Действующим началом этой вакцины является аттенуированная бацилла Calmette-Guerin (Mycobacterium bovis). Стимулирующее действие на ДК могут оказывать МПП этой микобактерии, в первую очередь компоненты ее своеобразной клеточной стенки: микобактериальный гликолипид корд-фактор (трегалозы 6,6’-димиколат), полярные фосфолипиды и фософогликолипиды и неполярный липид мономиколил глицерол [18, 19]. Другой использованной в работе вакциной была ВПГВ, представляющая собой рекомбинантные HBs-антигены, сорбированные на частицах Al3+. Считается, что именно частицы Al3+ отвечают за стимуляцию антигенпрезентирующих клеток, тогда как HBs-антиген не только не стимулирует ДК, но и, по некоторым литературным данным, даже подавляет их активность [20]. Описанный в литературе механизм действия частиц геля Al3+ на ДК подразумевает определенное деструктивное воздействие, а именно разрыв фагосомы, необходимый для выхода частиц геля в цитоплазму и активации инфламмасом - сенсорных ор-ганелл, предназначенных для распознавания сигналов опасности, в частности клеточных инфекций [21].
Показано, что стимуляция моноцитарных ДК взрослых живой туберкулезной вакциной БЦЖ и рекомбинантными ВПГВ в условиях in vitro эффективно индуцирует фенотипическое созревание ДК, но оказывает различное действие на экспрессию рецепторов хемокинов.
Вакцина БЦЖ вызывает относительно небольшое, но достоверное увеличение экспрессии рецептора CCR7 на ДК взрослых. Этот хемоки-новый рецептор характерен для зрелых ДК и необходим им для миграции из периферических тканей (например, из места введения вакцины) в сеть лимфатических сосудов и далее в паракортекс, т. е. в Т-клеточную зону ЛУ. Как известно, БЦЖ является мощными стимуляторами ответа Т-хелперов первого типа (Тх1), и канонический путь доставки антигенов этой вакцины ДК в Т-клеточную зону ЛУ представляется наиболее выгодным для встречи с наивными Т-лимфоцитами и инструктированию их к созреванию в Тх1.
Экспрессия CCR7 на наружной мембране ДК новорожденных оказалась чрезвычайно слабой. Даже после стимуляции этих клеток смесью ИЛ-1Р, ИЛ-6, ФНОа и простагландина Е2 мы наблюдали накопление CCR7 преимущественно внутри клетки, а не на ее наружной мембране. Такая особенность экспрессии
------------------------- CCR7 может быть связана с
определенной незрелостью ДК детей, которую мы регистрировали по сохранению моно-цитарного маркера CD14 и слабой экспрессии молекул CD80 и CD83, характерных для зрелых ДК. При действии на ДК детей вакцина БЦЖ вызывала лишь слабое, но достоверное увеличение внутриклеточной экспрессии CCR7 и не влияла на экспрессию этого белка на наружной мембране клеток.
ВПГВ, а также ее адъювантный компонент Al3+ индуцировали на ДК экспрессию не только CCR7, но и другого хемокинового рецептора - CXCR5. Лиганд этого рецептора хемокин CXCL13 активно продуцируется в В-клеточной зоне ЛУ и является хемоаттрактантом для В-лимфоцитов, фТх и CXCR5+ ДК, т.е. собирает вместе всех потенциальных участников гуморального иммунного ответа [22]. По нашему мнению, экспрессия CXCR5 на ДК может приводить к направлению части ДК, несущих HBs-антиген, в фолликулы ЛУ, способствуя тем самым развитию гуморального иммунного ответа. Кроме того, принесенный в фолликулы HBs-антиген после развития гуморального иммунного ответа и гибели ДК становится доступным к хранению на фолликулярных ДК мезенхимального происхождения, что в свою очередь может способствовать длительному поддержанию продукции защитных антител после вакцинации.
Заключение. Таким образом, показано, что стимуляция ДК вакциной БЦЖ и ВПГВ индуцирует экспрессию различ-
- 322 -
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
ного набора хемокиновых рецепторов, определяющих конечный пункт миграции этих антигенпрезентирующих клеток. По нашему мнению, различия в маршруте миграции стимулированных вакцинами ДК могут оказывать существенное влияние на выбор типа иммунного ответа на вакцину.
Работа поддержана РФФИ, проект 13-04-00264.
ЛИТЕРАТУРА
2. Ярилин A.A. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2010.
21. Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Адъюванты в составе вакцин. Сообщение 1. Микро- и наночастицы. Иммунология. 2011; 32 (1):37—45.
22. Топтыгина А. П. Лимфоидный фолликул - территория иммунного ответа. Иммунология. 2012; 33 (3):162-9.
REFERENCES
1. Steinman R. M. The dendritic cell system and its role in immunoge-nicity. Annu. Rev. Immunol. 1991; 9: 271-96.
2. Jarilin A. A. Immunology. Moscow: GJeOTAR-Media; 2010 (in Russian).
3. Alvarez D., Vollmann E.H., von Andrian U. H. Mechanisms and consequences of dendritic cell migration. Immunity. 2008; 29(3): 325.
4. Boullart A.C.I., AarntzenE.H.J.G., VerdijkP, JacobsJ.F.M., Schuurhu-is D.H., Benitez-Ribas D. et al. Maturation of monocyte-derived dendritic cells with Toll-like receptor 3 and 7/8 ligands combined with prostaglandin E2 results in high interleukin-12 production and cell migration. Cancer Immunol. Immunother. 2008; 57: 1589-97.
5. Morel S.A., Turner M.S. Designing the optimal vaccine: the importance of cytokines and dendritic cells. Open Vaccine J. 2010; 3: 7-17.
6. Yen J.-H., Khayrullina T., Ganea D. PGE2-induced metalloproteinase-9 is essential for dendritic cell migration. Blood. 2008; 111(1): 260-70.
7. WestM.A., Prescott A.R., ChanK.M., Zhou Z., Rose-JohnS., Scheller J. et al. TLR ligand - induced podosome disassembly in dendritic cells is ADAM17 dependent. J. Cell Biol. 2008; 182(5): 993-1005.
8. JohnsonL.A., JacksonD.G. Cell Traffic and the Lymphatic Endothelium. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008; 1131: 119-33.
9. Randolph G. J., Angeli V., SwartzM. A. Dendritic-cell trafficking to lymph node through lymphatic vessels. Nature Rev. Immunol. 2005; 5: 617-28.
10. Martm-FontechaA., SebastianiS., Hopken U.E., UguccioniM., Lipp M., Lanzavecchia A., Sallusto F Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. J. Exp. Med. 2003; 198: 615-21.
11. KabashimaK., ShiraishiN., SugitaK., Mori T., Onoue A., Kobayashi M. et al. CXCL12-CXCR4 engagement is required formigration of cutaneous dendritic cells. Am. J. Pathol. 2007; 171: 1249-57.
12. Nakano H., Gunn M.D. Gene duplications at the chemokine locus on mouse chromosome 4: multiple strain-specific haplotypes and the deletion of secondary lymphoid-organ chemokine and EBI-1 ligand chemokine genes in the plt mutation. J. Immunol. 2001; 166: 361-9.
13. CysterJ.G. Chemokines and the homing of dendritic cells to the T cell areas of lymphoid organs. J. Exp. Med. 1999; 189: 447-50.
14. Saeki H., Wu M.T., Olasz E., Hwang S.T. A migratory population of skin-derived dendritic cells expresses CXCR5, responds to B lymphocyte chemoattractant in vitro, and co-localizes to B cell zones in lymph nodes in vivo. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 2808-14.
15. Cyster J.G., AnselK.M., ReifK., EklandE.H., HymanP.L., TangH.L. et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunol. Rev. 2000; 176: 181-93.
16. Katakai T., Suto H., Sugai M., GondaH, Togawa A, Suematsu S, et al. Organizer-like reticular stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs. J. Immunol. 2008; 181: 6189-200.
17. LeonB., Ballesteros-TatoA., Browning J.L., Dunn R., Randall T.D., Lund F.E. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunol. 2012; 13(7): 681-90.
18. Sprott G. D., Dicaire C. J., Gurnani K., SadS., KrishnanL. Activation of dendritic cells by liposomes prepared from phosphatidylinositol mannosides from Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin and adjuvant activity in vivo. Infect. and Immun. 2004; 72: 5235-5246.
19. Andersen C.S., AggerE.M., RosenkrandsI., Gomes J.M., Bhowruth V, Gibson K.J. et al. Simple mycobacterial monomycolated glycerol lipid has potent immunostimulatory activity. J. Immunol. 2009; 182: 424-32.
20. Op den Brouw M. L., Binda R. S., Geijtenbeek T. B., Janssen H. L., Woltman A. M. The mannose receptor acts as hepatitis B virus surface antigen receptor mediating interaction with intrahepatic dendritic cells. virology. 2009; 393: 84-90.
21. Ataullakhanov R. I., Khaitov R. M. Vaccine adjuvants. 1. Micro- and nanoparticles. Immunologia. 2011; 32 (1):37- 45 (in Russian).
22. Toptygina A.P. The lymphoid follicles - the immune response zone. Immunologia. 2012; 33(3): 162-9 (in Russian).
Поступила 06.07.13
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 618.3-06:616.98:579.882.11]-078.33
В.Н. Зорина1, И.А. Ботвиньева2, Л.В. Ренге2, Р.М. Зорина1, Т.С. Чирикова1, Н.А.Зорин1 ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ БЕЛКИ-ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ И ЦИТОКИНЫ
у беременных женщин при антителоносительстве к chlamydia
TRACHOMATIS
1ГБОУ ДПО Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Минздрава России, 654005, г Новокузнецк; 2МБ ЛПУ Зональный перинатальный центр, 654041, г Новокузнецк, ул. Сеченова
Изучено содержание а2-макроглобулина (а2-МГ), лактоферрина (ЛФ), альбумина (Алб), интерлейкина (ИЛ)-6, ИЛ-8 и фактора некроза опухоли а (ФНОа) в сыворотке крови (Сыв), пуповинной сыворотке (ПС) и околоплодных водах (ОВ) у рожениц-носительниц IgG-антител (АТ) к Chlamydia trachomatis для оценки их возможной роли в развитии внутриутробной инфекции (ВУИ). Установлено, что при антителоносительстве и развитии ВУИ наблюдается значительное повышение уровня а2-МГ, Алб, ИЛ-8, ФНОа, а также снижение содержания ЛФ в ОВ. В Сыв антителоносительниц при рождении детей с ВУИ повышен уровень ЛФ, ИЛ-6 и ФНОа. В ПС при антителоносительстве и развитии ВУИ увеличено количество ЛФ и ИЛ-6. Соотношение уровня изученных белков в Сыв, ПС и ОВ в норме и при антителоносительстве также различается - нарушена проницаемость гематоамниотического барьера при ВУИ. Нарушения синтеза и функций полифункциональных ЛФ, а2-МГ вносят свой вклад в развитие патологии, оказывая патологическое влияние на взаимозависимый транспорт цитокинов, так и напрямую повреждая ткани.
Ключевые слова: Chlamydia trachomatis, внутриутробная инфекция, а2-макроглобулин, лактоферрин, цитокины
- 323 -
