CC BY
47
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
expression and function of Fc receptors for IgG on human myeloid cells // Mol. Immunol. - 1990. - Vol. 27, N 1. - P. 57-67.
10. Iking-Konert C., Cseko C., Wagner C. et al. Transdiffereatiation of polymorphonuclear neutrophils: Acquisition of CD83 and other functional characteristics of dendritic cells // J. Mol. Med.
- 2001. - Vol. 79. - P. 464-474.
11. Kushner B. H., Cheung N. K. Absolute requirement of CD11/ CD18 adhesion molecules, FcRII and the phosphatidylinosi-tollinked FcRIII for monoclonal antibody-mediated neutrophil antihuman tumor cytotoxicity // Blood. - 1992. - Vol. 79, N 6.
- P. 1484-1490.
12. Lord P C., Wilmoth L. M, Mizel S. B., McCall C.E. Expression of interleukin-la, Ip, genes by human blood polymorphonuclear leukocytes // J. Clin. Invest. - 1991. - Vol. 87, N 4. - P. 1312-1321.
13. Metani C., Mattia G. F., Silvani A. et al. Interleukin-6 expression
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
in human neutrophil and eosinophil peripheral blood granulocytes // Blood. - 1993. - Vol. 81, N 10. - P. 2744-2749.
14. RadsakM, Iking-Konert C, Stegmaier S. et al. Polymorphonuclear neutrophils as accessory cells for T-cell activation: Major histocompatibility complex class II restricted antigen-dependent induction of T-cell proliferation // Immunology. - 2000. - Vol. 101. - P. 521-530.
15. Scapini P., Lapinet V.A., Gasperini S. et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines // Immunol. Rev. - 2000. - Vol. 177. - P. 195-203.
16. Van EgmondM., van Spriel A. B., Vermeulen H. et al. Enhancement of polymorphonuclear cell-mediated tumor cell-mediated tumor cell killing on simultaneous engage meant of fcgammaRI(CD64) and fcal-phaRI (CD89) // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61, N 40. - P. 55-60.
Поступила 25.06.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
М. В. Плеханова, В. Ю. Талаев, О. Н. Бабайкина, И. Е. Зайченко, Е. И. Ефимов ДЕЙСТВИЕ ВАКЦИН ПРОТИВ ТУБЕРКУЛЕЗА И ГЕПАТИТА В НА ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ
и функциональные свойства дендритных клеток новорожденных in
VITRO
ФБУН Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И. Н. Блохиной Роспотребнадзора, (г Нижний Новгород, ул. Грузинская, д. 44)
Вакцина БЦж in vitro индуцирует фенотипическое созревание дендритных клеток (дК) новорожденных и взрослых и значительно усиливает их способность стимулировать продукцию интерферона (IFN)-y лимфоцитами. БЦЖ увеличивает способность ДК взрослых стимулировать продукцию фактора некроза опухолей a (TNFa) лимфоцитами и практически не влияет на данный параметр у ДК новорожденных. Рекомбинантные вакцины против гепатита B индуцируют фенотипическое созревание ДК, вызывают слабое усиление их способности стимулировать продукцию IFNy и не влияют на способность ДК стимулировать продукцию TNFa, интерлейкина (IL)-5 и IL-17 лимфоцитами.
Ключевые слова: вакцины, дендритные клетки, лимфоциты, цитокины M.VPlekhanova, V.Yu Talayev, O.N. Babaykina, I.Ye. Zaichenko, E.I. Ephimov
THE ACTION OF BCG AND HEPATITIS B VACCINES ON PHENOTYPIC AND FUNCTIONAL PROPERTIES OF THE NEWBORN'S DENDRITIC CELLS IN VITRO
BCG vaccine induces the phenotypic maturation of adult and newborn dendritic cells in vitro and strong increases their ability to stimulate interferon-Y production by lymphocytes. BCG enhances the ability of adult's dendritic cells to stimulate tumor necrosis factor-a production by lymphocytes and has not any effect on current parameter of newborn dendritic cells. Hepatitis B vaccines induce the phenotypic maturation of dendritic cells, weakly increase their ability to stimulate interferon-Y production and do not influence upon dendritic cell ability to stimulate production of tumor necrosis factor-a, IL-5 and IL-17 by lymphocytes.
Keywords: vaccine, dendritic cells, lymphocyte, cytokines
Введение. Эффективность вакцин определяется их способностью активировать специфичные к антигенам инфекционного агента лимфоциты, вызывая их размножение и созревание в клетки иммунологической памяти. Как известно, активация Т-лимфоцитов антигенами осуществляется с помощью анти-генпрезентирующих клеток (АПК), причем при индукции первичного иммунного ответа эту роль должны выполнять наиболее активные АПК, именуемые дендритными клетками (ДК) [2, 10, 23, 25]. Основной задачей незрелых миелоидных ДК, рассеянных по различным тканям организма, является
Плеханова Мария Владимировна - науч. сотр., тел. 8(831) 434-24-82, e-mail: talaev@inbox.ru
сбор антигенного материала за счет фагоцитоза и макропино-цитоза [10, 12, 19]. Для обнаружения признаков инфекции ДК снабжены рецепторами к молекулярным паттернам патогенов (МПП) - относительно немногочисленным, но высококонсервативным и соответственно широко распространенным молекулам микроорганизмов [3, 11]. Поглощение микроорганизмов и сопутствующее этому распознавание МПП ведут к созреванию ДК, в результате чего они приобретают необходимые для презентации антигенов свойства и мигрируют с током лимфы в Т-клеточные зоны лимфатических узлов для последующей идентификации собранных антигенов Т-лимфоцитами. Активация лимфоцитов вызывает запуск иммунного ответа, после завершения которого остается значительное количество функционально зрелых антигенспецифических Т- и В-лимфоцитов, которые будут обеспечивать иммунологическую память [4].
- 311 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
Очевидно, что эффективная вакцинация как модель иммунной реакции на инфекцию должна запускать все этапы реакции -от активации ДК до формирования клеток иммунологической памяти, однако возрастные особенности реакции различных клеток иммунной системы на вакцины и их компоненты до сих пор недостаточно хорошо изучены.
Данная работа посвящена исследованию особенностей реакции моноцитарных ДК новорожденных и взрослых на две широко используемые вакцины, принципиально различающиеся по механизму действия на ДК. Одна из этих вакцин -противотуберкулезная вакцина БЦЖ, содержит живую бациллу Calmette-Guerin (Mycobacterium bovis), родственную возбудителю туберкулеза (M. tuberculosis). Вакцина БЦЖ обладает мощной способностью стимулировать функцию АПК за счет наличия естественных МПП и способности заражать макрофаги и ДК [16, 24]. В то же время способность микобактерий к внутриклеточному паразитизму существенно затрудняет защиту от M. tuberculosis. В связи с этим от эффективной вакцины требуется мобилизовать разнообразные клетки иммунной системы, включая Т-хелперы 1-го типа (Th1) и цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты, поскольку активность этих клеток и мощная продукция ими интерферона (IFN)-y обеспечивают успешную элиминацию внутриклеточных инфекционных агентов [4].
Для увеличения иммуногенности вакцин, облегчения презентации антигена, расширения спектра АПК и обеспечения большей безопасности применения проводится разработка новых противотуберкулезных вакцин на основе рекомбинантных или синтетических антигенов и паттернов M. tuberculosis. Найдено и синтезировано множество иммуностимулирующих молекул микобактерий по своим характеристикам, подходящих для использования в качестве адъювантного компонента вакцин [5, 22]. Однако результаты недавних исследований показали, что МПП M. tuberculosis могут как стимулировать, так и подавлять продукцию IFN 1-го типа ДК. Микобактериальные агонисты толл-подобного рецептора 9 (TLR9) стимулируют продукцию IFN, в то время как агонисты TLR2 подавляют продукцию IFN и связанную с ней перекрестную презентацию антигенов на молекулах главного комплекса гистосовместимости I класса [20]. Таким образом, для поиска адъювантных компонентов новых противотуберкулезных вакцин целесообразно использовать модельные эксперименты с применением ДК.
Другой использованной в работе вакциной была вакцина против гепатита В (ВГВ). Эта вакцина не содержит естественных МПП и состоит из рекомбинантного HBs-антигена, сорбированного на частицах гидроокиси алюминия. Адъювантное действие гидроокиси алюминия на АПК осуществляется за счет разрыва фаголизосомы под действием частиц этого вещества, их выхода в цитоплазму и активации инфламмасом - древних сенсорных органелл, предназначенных для распознавания сигналов опасности, в частности внутриклеточных инфекций. Активация Nlp3'-инфламмасомы, представляющей собой мультимолекулярный комплекс белков Nlp3, Asc, прокаспазы-1 и NLR, приводит к превращению прокаспазы-1 в активную каспазу-1. Этот протеолитический фермент участвует в транскрипции и процессинге интерлейкинов (IL), критически необходимых для созревания АПК [7, 9, 14, 15]. Однако секреция фактора некроза опухоли a (TNFa) и IL-6 не зависит от Nlp3-инфламмасомы, а запускается через TLR-сигналы, активирующие NF-kB [7, 9]. В связи с этим считается, что для индукции полноценного ответа на вакцины, адсорбированные на частицах гидроокиси алюминия, целесообразно введение в их состав агонистов TLR или других дополнительных стимулирующих молекул [1].
В данной работе мы рассматривали влияние живой вакцины БЦЖ и рекомбинантных ВГВ на созревание ДК новорожденных и взрослых, а также их способность стимулировать продукцию цитокинов лимфоцитами.
Материал и методы. В работе использовали туберкулезную вакцину БЦЖ ("Микроген", Москва) и две рекомбинант-
ные дрожжевые ВГВ: Шанвак-В ("Шанта Биотекникс Ли-митед", Индия) и ВГВ производства ЗАО НПК "Комбитех" (Москва). Перед использованием сухую вакцину БЦЖ разводили в среде DME (Sigma, США), а ВГВ трижды отмывали от мертиолята средой DME с помощью центрифугирования.
ДК получали из моноцитов пуповинной крови здоровых новорожденных и венозной крови взрослых здоровых доноров. Для этого из проб стерильной гепаринизированной крови выделяли мононуклеарные клетки над слоем Hys-topaque-1077 (Sigma, США), клетки отмывали средой DME (Sigma, США) с 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) ("Биолот", Санкт-Петербург) и готовили суспензию клеток концентрацией 5 . 106 клеток/мл на среде DME с 10% ЭТС. Клетки засевали в 24-луночные планшеты (Costar, США) и инкубировали 2 ч при 37о С и 5% СО2. Затем неприлипшие клетки осторожно смывали с поверхности пластика несколькими порциями теплой среды и в лунки с моноцитами вносили среду DME с 10% ЭТС. Для получения из моноцитов незрелых ДК в лунки добавляли рекомбинантные человеческие GM-CSF (100 нг/мл; Biosource, США) и IL-4 (20 нг/мл; Invitrogen, США). Клетки инкубировали 6 сут (для оценки функциональных свойств ДК) или 7 сут (для оценки фенотипа) при 37о С и 5% СО2, повторно добавляя GM-CSF и IL-4 на 3-и сутки культивирования.
По истечении срока культивирования среду в лунках заменяли на новую и добавляли стимуляторы созревания или исследуемые вакцины. Для индукции созревания ДК в лунки добавляли липополисахарид (ЛПС) Salmonella typhi (1 мкг/ мл; отраслевой стандарт образца пирогена, ГИСК им. Тара-севича, Москва) и рекомбинантный TNFa (10 нг/мл, Sigma, США). Далее эти клетки обозначены ДК-ЛПС. В другие лунки вносили исследуемые вакцины: БЦЖ или ВГВ в концентрации 0,2; 0,02 и 0,002 детские дозы на 1 мл. Для получения контрольных незрелых ДК (нДК) в лунки не вносили стимуляторов.
Через 24 ч культивирования ДК собирали и оценивали их функциональные свойства по способности стимулировать продукцию цитокинов аллогенными лимфоцитами. Для этого лимфоциты засевали в 96-луночные круглодонные планшеты (Costar, США) в среде DME с 10% ЭТС по 2 • 105 клеток на лунку. Затем в лунки вносили исследуемые ДК в количестве 1, 2 и 4% количества лимфоцитов. Лунки без ДК использовали в качестве контрольных. Конечный объем среды в лунках составил 200 мкл. Планшеты инкубировали 72 ч при 37оС и 5% СО2 и отбирали пробы надосадков для твердофазного иммуноферментного анализа содержания IFNy, TNFa, IL-17 и IL-5. Для определения содержания IFNy, TNFa и IL-17 использовали тест-системы производства "Вектор-Бест" (Новосибирск), а для определения IL-5 - производства R&D (Франция).
Для оценки действия вакцин на экспрессию мембранных молекул нДК культивировали с вакцинами, со смесью ЛПС и TNFa или без стимуляторов в течение 48 ч. Затем клетки собирали и определяли экспрессию молекул HLA-DR, CD14, CD80, CD83 и CD86 с помощью 2-цветной проточной лазерной цитометрии. Для этого использовали меченные фикоэ-ритрином (РЕ) антитела к CD14 ("Сорбент", Россия), CD83 (BD Biosciences, США) и CD86 (Beckman Coulter Corp., Франция), а также меченные флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) антитела к CD80 (Beckman Coulter Corp., Франция) и HLA-DR ("Сорбент", Россия). Пробы анализировали на проточном цитофлюориметре FacsCanto II (BD Biosciences, США) с помощью программы FacsDiva и оценивали процент несущих маркер клеток и геометрическую среднюю яркости свечения. Статистический анализ проводили с использованием t-теста Стьюдента для зависимых и независимых выборок.
Результаты. В ходе работы изучали особенности действия вакцины БЦЖ и ВГВ на фенотипические и функциональные свойства ДК новорожденных и взрослых. Для
- 312 -
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
Экспрессия (в %) мембранных молекул в культурах ДК новорожденных детей и взрослых
Моле- кула нДК ДК, стимулированные ЛПС и TNFa
дети взрослые дети взрослые
HLA-DR 97,38 ± 0,77 92,08 ± 6,04 94,78 ± 2,83 93,77 ± 1,64
CD14 29,97 ± 7,62 * 11,84 ± 5,35 29,99 ± 7,1 * 9,39 ± 4,06
CD80 13,39 ± 4,77 39,69 ± 3,24 22,42 ± 2,73 * 50,90 ± 7,28
CD83 10,38 ± 1,64 * 14,9 ± 1,99 16,48 ± 2,28 * 33,32 ± 5,38
CD86 45,03 ± 6,74 46,25 ± 6,22 59,91 ± 6,77 70,77 ± 8,07
Примечание. * - различия между детьми и взрослыми достоверны при р < 0,05.
этого традиционным способом получали нДК, культивируя моноциты крови человека с IL-4 и GM-CSF. Затем нДК инкубировали с вакцинами и определяли экспрессию мембранных молекул и способность стимулировать продукцию цитокинов аллогенными лимфоцитами.
В предварительно проведенных экспериментах показано, что полученные in vitro ДК новорожденных демонстрируют определенные фенотипические признаки незрелости по сравнению с ДК взрослых (см. таблицу). Даже после созревания, индуцированного ЛПС и TNFa, культуры ДК детей содержали значительное количество клеток, сохранявших экспрессию моноцитарного маркера CD14. Кроме того, количество клеток, экспрессирующих CD80 и CD83, в культурах ДК детей было значительно ниже, чем в культурах ДК взрослых.
Внесение вакцины БЦЖ в культуры нДК новорожден-
Рис. 1. Действие вакцин на экспрессию мембранных молекул на ДК взрослого (слева) и новорожденного (справа).
Названия маркеров - под гистограммами. Тонкая линия - нДК; толстая черная линия - ДК, стимулированные БЦЖ (0,2 дозы на 1 мл); толстая серая линия - ДК, стимулированные ВГВ Шанвак-В (0,2 дозы на 1 мл); гистограмма с закрашенным полем - изотипический контроль.
ных приводило к фенотипическому созреванию клеток, что проявлялось в достоверном усилении экспрессии молекул, необходимых для презентации антигенов и стимуляции Т-лимфоцитов (рис. 1). В результате при использовании БЦЖ в концентрации 0,2 дозы/мл плотность экспрессии HLA-DR (средняя геометрическая яркости свечения окрашенных клеток) возрастала в 1,53 ± 0,16 раза, а количество клеток, несущих CD83 и CD86, - в 2,03 ± 0,19 и 1,91 ± 0,16 раза соответственно (рис. 2). ВГВ Шанвак-В и ВГВ производства "Комбитех" так же, как и БЦЖ, усиливали экспрессию на ДК молекул, необходимых для презентации антигенов и стимуляции Т-лимфоцитов. Обе вакцины достоверно увеличивали геометрическую среднюю яркости окрашивания HLA-DR и долю клеток, несущих CD83 и CD86 (см. рис. 2). Так, после инкубации ДК с 0,2 дозы на 1 мл ВГВ Шанвак-В плотность экспрессии HLA-DR возрастала в 1,4 ± 0,11 раза, а количество клеток, несущих CD83 и CD86, увеличивалось в 2,29 ± 0,65 и 2,03 ± 0,37 раза соответственно. Уровень экспрессии HLA-DR, CD83 и CD86 на ДК, обработанных всеми использованными нами вакцинами, существенно не различался.
Функциональные свойства ДК оценивали по их способности стимулировать продукцию цитокинов аллогенными лимфоцитами в смешанной культуре клеток. Одним из цитокинов, содержание которых определяли в данной работе, был IFNy. Как известно, IFNy является ключевым цитокином Th1, а также активно продуцируется естественными киллерами и CD8+ Т-лимфоцитами с ТЫ-профилем цитокинопродукции. IFNy критически необходим для эффективного развития клеточной формы адаптивного иммунного ответа, важнейше- * 1
Шанвак-В
нДК Ш ДК-ЛПС Ш ДК-ВГВ
Комбитек
Рис. 2. Средние показатели экспрессии маркеров на ДК новорожденных, стимулированных вакцинами БЦЖ, ВГВ Шанвак-В (а и в) и ВГВ производства "Комбитех" (б и г) в концентрации 0,2 дозы на
1 мл.
а и б - количество (в %) клеток, несущих маркеры, которые обозначены под гистограммами; в и г - геометрическая средняя яркости свечения HLA-DR-FITC. Тип клеток обозначен между гистограммами. J - отличия от нДК; * - отличия от ДК-ЛПС (р < 0,05 в парном f-тесте).
- 313 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
250-
200-
150
100-
50
1400-1
1050-
700-
350-
"о 1 1 1 2 1 4
нДК
■ ДК-ППС —О— ДК-БЦЖ 0,002 —Д— ДК-БЦЖ 0,02 —•— ДК-БЦЖ 0,2
а
г
0
0
Рис. 3. Действие БЦЖ на продукцию IFNy (а, б и в) и TNFa (г, д и е) в смешанных культурах лимфоцитов и ДК новорожденных (а и г), лимфоцитов и ДК взрослых (б и д), а также лимфоцитов взрослых и ДК новорожденных (в и е).
Здесь и на рис. 4, 5: по оси абсцисс - доля (в %) ДК в культуре; по оси ординат - концентрация (в пг/мл) цитокина; типы ДК и концентрации вакцины (доза на 1 мл) обозначены в картуше под гистограммами; * - достоверные отличия от нДК (р < 0,05 в парном f-тесте).
го для защиты от туберкулеза. Показано, что вакцина БЦЖ дозозависимо усиливает способность ДК детей и взрослых стимулировать продукцию IFNy отвечающими лимфоцитами (рис. 3, а, б). После культивирования с высокой концентрацией БЦЖ (0,2 дозы на 1 мл) ДК детей запускали достоверно большую продукцию IFNy, чем нДК и ДК, стимулированные ЛПС и TNFa (ДК-ЛПС). ДК, обработанные БЦЖ в концентрации 0,02 дозы на 1 мл, вызывали продукцию IFNy, сходную с действием ДК-ЛПС и значительно превышающую уровень секреции IFNy, который индуцирован нДК. БЦЖ в концентрации 0,002 дозы на 1 мл не оказывала достоверного IFN-индуцирующего действия.
Следует отметить, что концентрации IFNy в смешанных культурах клеток детей (см. рис. 3, а) была значительно
ниже, чем в смешанных культурах клеток взрослых (см. рис. 3, б). Это различие в продукции IFNy наблюдали при использовании как нДК, так и ДК, стимулированных БЦЖ. Для выяснения, с какими именно клетками смешанной культуры (с лимфоцитами или ДК) связана слабость продукции IFNy у детей, мы использовали вариант смешанной культуры, в которой лимфоциты взрослых активировали ДК новорожденных (рис. 3, в). Продукция IFNy в таких культурах оказалась столь же мощной, как и в обычных смешанных культурах клеток взрослых. Таким образом, слабость продукции IFNy в смешанных культурах клеток детей обусловлена функциональными особенностями детских лимфоцитов, но не ДК.
ВГВ Шанвак-В слабо, но достоверно увеличивала IFN-индуцирующую способность ДК детей и взрослых (рис. 4, а,
- 314 -
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
250-1
200-
150-
100 -
50 -
--1-1--1-
0 12 4
Рис. 4. Действие ВГВ Шанвак-В на продукцию IFNy (а, б) и TNFa (в, г) в смешанных культурах лимфоцитов и ДК новорожденных (а и в) и лимфоцитов и ДК взрослых (б и г).
б). При использовании различных концентраций ВГВ установили, что внесение в культуру ДК детей 0,002 дозы вакцины на 1 мл среды не дает стимулирующего эффекта на ДК (данные не приведены). ВГВ в концентрации 0,02 дозы на 1 мл усиливает слабую продукцию IFNy в смешанной культуре клеток новорожденных в 1,4 ± 0,2 раза и по данному параметру не отличается от БЦЖ в той же концентрации. Увеличение концентрации ВГВ в культуре не приводит к дальнейшему усилению IFN-индуцирующих свойств ДК новорожденных. ВГВ производства "Комбитех" достоверно не отличалась от ВГВ Шанвак-В по действию на IFN-индуцирующие свойства ДК новорожденных (данные не приведены).
При внесении ВГВ Шанвак-В в культуру ДК взрослых максимальный IFN-индуцирующий эффект наблюдали при использовании средней концентрации вакцины 0,02 дозы на 1 мл. IFN-индуцирующие свойства ДК взрослых, обработанных средней или максимальной концентрацией ВГВ, достоверно слабее свойств ДК, культивированных с соответствующими концентрациями БЦЖ (р < 0,05).
Другим цитокином, оцениваемым в данной работе, был TNFa. Этот провоспалительный цитокин продуцируется клетками врожденного иммунитета, Th1 и цитотоксическими CD8+ Т-клетками. Подобно содержанию IFNy, уровень продукции TNFa в смешанных культурах лимфоцитов и ДК детей был существенно ниже, чем в культурах клеток взрослых (рис. 3, г, д). БЦЖ не увеличивала способность ДК детей стимулировать продукцию TNFa лимфоцитами детей, но вызывала мощное дозозависимое усиление продукции TNFa при использовании ДК и лимфоцитов взрослых. Дефицит продукции TNFa в смешанных культурах ДК и лимфоцитов новорожденных полностью не исчезал при замене лимфоцитов детей на лимфоциты взрослых (рис. 3, е).
Поскольку активными продуцентами TNFa являются сами ДК, мы оценивали вклад ДК детей и взрослых в различия продукции TNFa в смешанных культурах. Однако при определении концентрации TNFa в надосадках культур ДК не выявили значимых различий между детьми и взрослыми по продукции TNFa самими ДК вне зависимости от способа их активации (данные не приведены).
Обработка ДК детей и взрослых ВГВ не усиливала их способности индуцировать продукцию TNFa (рис. 4, в, г). Более того, ДК взрослых, обработанные ВГВ в концентрации 0,2 дозы на 1 мл, индуцировали достоверно меньшую продукцию TNFa по сравнению с таковой контрольных нДК.
Наряду с Th1-цитокинами мы изучали продукцию Th2-цитокина IL-5. Как известно, Th2 играют ключевую роль в защите организма от внеклеточных паразитов и развитии аллергических реакций немедленного типа. Показано, что продукция IL-5 лимфоцитами нарастает при повышении концентрации ДК в смешанной культуре. В то же время достоверных различий между действиями нДК и ДК-ЛПС не наблюдали (рис. 5, а, б). Активация ДК вакциной БЦЖ в концентрации 0,2 дозы на 1 мл вызывает небольшой, но статистически достоверный дополнительный прирост продукции IL-5 в смешанных культурах клеток детей и взрослых. Обработка ДК детей и взрослых ВГВ не вызывает дополнительного усиления продукции IL-5.
Также в работе оценивали продукцию IL-17 - ключевого цитокина Th17, играющего важную роль в индукции воспаления и патогенезе некоторых аутоиммунных заболеваний. Продукция IL-17 лимфоцитами новорожденных невелика (около 10 пг/мл). Стимуляция лимфоцитов с помощью нДК и ДК, инкубированных с вакцинами, не вызывает никакого усиления продукции IL-17 (рис 5, в). Уровень продукции
- 315 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
Рис. 4. Действие ВГВ Шанвак-В на продукцию IFNy (а, б) и TNFa (в, г) в смешанных культурах лимфоцитов и ДК новорожденных (а и в) и лимфоцитов и ДК взрослых (б и г).
IL-17 у взрослых выше, и лимфоциты взрослых отвечают усилением его продукции на нДК (рис. 5, г). В то же время стимуляция ДК с помощью вакцин не вызывает дополнительного прироста продукции IL-17 по сравнению с таковой контрольных нДК.
Обсуждение. Показано, что живая вакцина БЦЖ и рекомбинантные ВГВ одинаково эффективно стимулируют фенотипическое созревание моноцитарных ДК в условиях in vitro, но оказывают различное действие на способность ДК стимулировать лимфоциты к цитокинопродукции.
Инкубация нДК детей и взрослых с вакциной БЦЖ значительно увеличивает их способность стимулировать лимфоциты взрослых к продукции IFNy. Различий IFN-индуцируещей способности ДК детей и взрослых при этом не обнаружили. Лимфоциты новорожденных в смешанной культуре продуцируют значительно меньшие количества IFNy, чем лимфоциты взрослых. В то же время кратность усиления продукции IFNy под действием БЦЖ в смешанных культурах с лимфоцитами детей была выше, чем в культурах с лимфоциты взрослых. Так, концентрация IFNy в культурах детских лимфоцитов с 4% детских ДК, обработанных 0,2 дозы на 1 мл БЦЖ, превышала аналогичные значения смешанных культур с нДК в 5,09 ± 1,65 раза. Для культур лимфоцитов взрослых, стимулированных ДК взрослых, соответственно показатель составил 2,62 ± 0,57, а для культур лимфоцитов взрослых, стимулированных ДК детей, - 2,48 ± 0,39.
Известно, что слабость продукции IFNy лимфоцитами новорожденных связана с гиперметилированием промоторного участка гена этого цитокина в CD4+ Т-клетках новорожденных [17] и, по-видимому, может быть преодолена при достаточно мощной стимуляции лимфоцитов. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что ограничение продукции IFNy у лимфоцитов новорожденных частично снимается
при стимуляции ДК, обработанными БЦЖ. По нашему мнению, эти результаты согласуются с литературными данными о том, что вакцина БЦЖ в организме детей индуцирует ответ Th1, сравнимый с таковым у взрослых [17].
Иной характер носит действие БЦЖ на TNF-инду-цирующую способность ДК детей и взрослых. Обработанные вакциной БЦЖ ДК взрослых значительно усиливают свою способность стимулировать продукцию TNFa. В то же время инкубация ДК новорожденных с вакциной БЦЖ приводит лишь к небольшому усилению TNF-индуцирующей способности, причем это усиление проявляется только при воздействии на лимфоциты взрослых, но не на лимфоциты новорожденных.
Инкубирование ДК детей и взрослых с БЦЖ вызывает небольшое усиление IL-5-индуцирующей способности этих клеток и не влияет на способность индуцировать продукцию IL-17.
Как известно, вакцина БЦЖ является сильным индуктором клеточных форм иммунного ответа, и полученные результаты, включая выявленные возрастные особенности продукции IFNy, соответствуют ожидаемым. По нашему мнению, использованная модель пригодна для оценки действия потенциальных адъювантов, направленных на усиление TM-ответа.
Несмотря на то что ВГВ эффективно стимулируют фенотипическое созревание ДК, эти вакцины вызывают лишь слабое усиление IFN-индуцирующей способности ДК детей и взрослых и практически не влияют на способность ДК стимулировать продукцию TNFa, IL-5 и IL-17. Отсутствие влияния ВГВ на IL-5-индуцирующую способность ДК может показаться неожиданным, поскольку Th2 до недавнего времени рассматривались как основные, если не единственные, стимуляторы гуморальных иммунных реакций, а сорбированные на
- 316 -
ИММУНОЛОГИЯ РЕПРОДУКЦИИ
гидроокиси алюминия вакцины считаются индукторами гуморального иммунного ответа. Однако в настоящее время основную роль в осуществлении помощи В-лимфоцитам и соответственно в индукции гуморального иммунного ответа отводят недавно открытой специализированной субпопуляции CD4+ Т-клеток - так называемым фолликулярным Th (T ) [8, 13, 18]. Эти клетки дифференцируются из наивных Т-лимфоцитов, имеющих высокоаффинный Т-клеточный рецептор к антигену. Кроме того, TFH, по-видимому, могут созревать из Th, ранее поляризированных по другим линиям дифференцировки [8]. Ключевым моментом, определяющим судьбу TFH, является экспрессия хемокинового рецептора CXCR5, направляющего эти лимфоциты в перифолликулярное пространство лимфоидных органов, где они контактируют с В-лимфоцитами. Распознавание специфичного антигена на В-лимфоцитах, сходное с аналогичным процессом при презентации антигенов на АПК, а также эффективный и достаточно длительный обмен костимулирующими сигналам индуцируют дальнейшее созревание TFH и миграцию этих клеток и контактировавших с ними В-лимфоцитов в фолликулы [8]. Активность TFH критически необходима для эффективного и длительного функционирования зародышевых центров лимфоидных органов, созревания аффинитета антител и формирования В-клеток иммунологической памяти. Основным цитокином TFH является IL-21. Также эти клетки продуцируют Th2-цитокины IL-4 и IL-13 и хемокин CXCL13 - лиганд CXCR5 [8, 13]. Часть CXCR5+ Т-лимфоцитов, выделенных из миндалин человека или полученных in vitro, демонстрирует смешанные свойства с Th1, что, по-видимому, является проявлением нестабильности субпопуляции "классических" TFH. Эта нестабильность может быть обусловлена особенностями регуляции ядерного мастер-регулятора TFH - репрессора экспрессии генов Bcl-6. В отличие от ключевых ядерных факторов других субпопуляций хелперов (таких, как T-bet у Th1 или GATA3 у Th2), подавляющих экспрессию факторов-конкурентов и стабилизирующих собственную экспрессию, Bcl-6 угнетает экспрессию как факторов-конкурентов, так и свою собственную. В результате без внешнего воздействия, стабилизирующего свойства TFH, эти клетки будут постоянно дрейфовать в более стабильные субпопуляции, превращаясь в Th1 или Th2 [18].
Следует также отметить, что не только "классические" TFH, но и все остальные субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов при определенных условиях могут оказывать помощь В-лимфоцитам. Общеизвестна ключевая роль Th2 в переключении изотипа продуцируемых антител на IgE. Кроме того, Th2 способны поддерживать размножение праймированных В-лимфоцитов, а также стимулировать продукцию IgG1 у мышей [4, 8, 21]. Th1, продуцирующие IFNy и при этом обладающие хомингом в В-клеточные зоны за счет экспрессии CXCR5 (так называемые Th1F), стимулируют переключение изотипа антител на IgG2a и усиливают его продукцию [8, 21]. Даже профессиональные супрессоры иммунного ответа - индуцибельные регуляторные Т-клетки могут вызывать переключение синтеза антител на IgA за счет продукции IL-10 и трансформирующего фактора роста в и стимулировать миграцию плазматических клеток в слизистые [6].
Таким образом, способность осуществлять помощь В-лимфоцитам присуща различным функциональным субпо-поляциям CD4+ Т-лимфоцитов, однако для ее эффективной реализации Th после распознавания антигена на АПК должны передислоцироваться из Т-клеточной в В-клеточную зону лимфоидного органа, т.е. утратить хемокиновый рецептор CCR7 и экспрессировать CxCr5 [8].
В связи с этим для оценки действия вакцин на гуморальный иммунитет в условиях in vitro в дальнейшем мы планируем исследовать изменения показателей хоминга активированных Т-клеток, а также ввести в смешанную культуру лимфоцитов второй этап, а именно - обогащение культуры В-лимфоцитами с последующей оценкой как созревания Т-лимфоцитов, так и продукции антител.
Заключение. Показано, что обработка моноцитарных нДК новорожденных живой вакциной БЦЖ в условиях in vitro эффективно индуцирует изменения экспрессии мембранных молекул, характерные для созревания ДК, и значительно усиливает их способность запускать продукцию IFNy лимфоцитами. Кроме того, БЦЖ вызывает небольшое усиление способности ДК новорожденных усиливать продукцию IL-5 и TNFa и не влияет на продукцию IL-17. При активации ДК взрослых вакцина БЦЖ провоцирует мощное усиление их IFNy- и TNFa-индуцирующих свойств и небольшое усиление IL-5-индуцирующей способности. ВГВ эффективно стимулируют фенотипическое созревание ДК, но вызывают лишь слабое усиление IFN-индуцирующей способности ДК детей и взрослых и практически не влияют на способность этих клеток стимулировать продукцию TNFa, IL-5 и IL-17.
ЛИТЕРАТУРА
1. Атауллаханов Р. И., Хаитов Р. М. Адъюванты в составе вакцин. Сообщение 1. Микро- и наночастицы // Иммунология.
- 2011. - № 1. - С. 37-45.
2. Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки // Иммунология.
- 2006. - Т. 27, №. 6 - C. 368 -378.
3. Симбирцев А. С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология. - 2005. - Т. 26, № . - C. 368-377.
4. Ярилин А. А. Иммунология. - М., 2010.
5. Andersen C. S., AggerE. M., Rosenkrands I. et al. A simple mycobacterial monomycolated glycerol lipid has potent immunostimu-latory activity // J. Immunol. - 2009. - Vol. 182. - Р. 424-432.
6. Dullaers M., Li D., Xue Y. et al. A T celldependent mechanism for the induction of human mucosal homing immunoglobulin A-se-creting plasmablasts // Immunity. - 2009. - Vol. 30. - P. 120-129.
7. Eisenbarth S. C., Colegio O. R.,O Connor W. Jr. et al. Crucial role for the Nalp3 inflammasome in the immunostimulatory properties of aluminium adjuvants // Nature. - 2008. - Vol. 453.
- P. 1122-1126.
8. Fazilleau N., Mark L., McHeyzer-Williams L.J., McHeyzer-Wil-liams M.G. Follicular helper T cells: lineage and location // Immunity. - 2009. - Vol. 30, N 3. - P. 324-335.
9. Franci L., Nunez G. The Nirp3 inflammasome is critical for aluminium hydroxide mediated IL-1beta secretion but dispensable for adjuvant activity // Eur. J. Immunol. - 2008. - Vol. 38, N 8.
- P. 2085-2089.
10. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L. et al. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 20. - P. 621-667.
11. Janeway C. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology // Cold Spr. Harb. Symp.Quant. Biol.
- 1989. - Vol. 54. - P. 1-13.
12. Jutras I., Desjardins M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. - 2005. -Vol. 21. - P. 511-527.
13. Kai McKinstry K., Strutt T.M., Swain S.L. The potential of CD4 T-cell memory // Immunology. - 2010. - Vol. 130. - P. 1-9.
14. Li H., Nookala S., Re F. Aluminium hydroxide adjuvants activate caspase-1 and induce IL-1beta and IL-18 re3lease // J. Immunol.
- 2007. - Vol. 178. - P. 5271-5276.
15. LiH., WillinghamS. B., TingJ.P.,ReF. Cutting edge: Inflammasome activation by alum and alum’s adjuvant effect are mediated by NLRP3 // J. Immunol. - 2008. - Vol. 181. - P. 17-21.
16. Maartens G., Wilkinson R. J. Tuberculosis // Lancet. - 2007. -Vol. 370. - Р. 2030-2043.
17. MarchantA., Goldman M. T-cell-mediated immune responses in human newborns: ready to learn? // Clin. Exp. Immunol. - 2005.
- Vol. 141. - P. 10-18.
18. Murphy K. M., StockingerB. Effector T cell plasticity: flexibility in the face of changing circumstances // Nature Immunol. - 2010.
- Vol. 11, N 8. - P. 674-680.
19. Norbury C. C. Drinking a lot is good for dendritic cells //
- 317 -
ИММУНОЛОГИЯ № 6, 2012
Immunology. - 2006. - Vol. 117. - P. 443-451.
20. Simmons D. P., Canaday D. H., Liu Y. et al. Mycobacterium tuberculosis and TLR2 agonists inhibit induction of type I IFN and class I MHC antigen cross processing by TLR9 // J. Immunol. -2010. - Vol. 185, N 4. - Р 2405-2415.
21. Snapper C. M., Paul W. E. Interferon-gamma and B cell stimulatory factor-1 reciprocally regulate Ig isotype production // Science. - 1987. - Vol. 236. - P. 944-947.
22. Sprott G. D., Dicaire C. J., Gurnani K. et al. Activation of dendritic cells by liposomes prepared from phosphatidylinositol mannosides from Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin
and adjuvant activity in vivo // Infect. and Immun. - 2004. - Vol. 72. - Р 5235-5246.
23. Steinman R.M.The dendritic cell system and its role in immunogenicity // Annu. Rev. Immunol. - 1991. - Vol. 9. - P 271296.
24. TrunzB. B., Fine P., Dye C. Effect of BCG vaccination on childhood tuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness // Lancet. -2006. - Vol. 367. - P. 1173-1180.
25. Wu L., Dakie A. Development of dendritic cell system // Cell. Mol. Immunol. - 2004. - Vol. 1. - P. 112-118.
Поступила 27.07.12
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
Н. Ю. Анисимова1, А. Ю. Галкина1, А. Н. Копылов1, Т. В. Борисова2, А. В. Караулов2,
М. В. Киселевский1
ФЕНОТИП И ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ астмой в период обострения
1 Лаборатория клеточного иммунитета, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, (115478, г Москва, Каширское ш., 24); 2 кафедра клинической иммунологии и аллергологии, Первый Московский медицинский университет им. И.М.Сеченова, (199911, г Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2)
Исследование включало сравнительный анализ фенотипических и функциональных особенностей нейтрофилов крови больных бронхиальной астмой в стадии обострения (n = 12) и группы здоровых доноров (n = 15). В результате проведенных исследований было установлено, что в крови больных бронхиальной астмой наблюдается достоверное повышение концентрации CD45+CD66b+CD11b+ лейкоцитов в сравнении с показателями у здоровых доноров [89,1(69,6-99,6) и 48,4(41-62,8)% соответственно). Полученные нами данные свидетельствуют о значительной активации циркулирующих в крови нейтрофилов. В частности, установлено, что в сравнении со здоровыми донорами при бронхиальной астме в стадии обострения концентрация гранулоцитов крови с фенотипом CD45+CD66b+CD11b+ возрастала примерно в 2 раза. Кроме того, у больных наблюдается значительное увеличение фагоцитарной активности гранулоцитов системного кровотока. Наибольшие изменения реактивности фагоцитов наблюдались после добавления латекса. В сравнении со здоровыми донорами у больных бронхиальной астмой фагоцитарный индекс увеличился почти в 4 раза (63 и 14% соответственно), а фагоцитарное число - в 15,7 раза (47 и 3 гранулы соответственно). Одновременно при бронхиальной астме значительно увеличивалась способность нейтрофилов к фагоцитозу грамотрицательных бактерий Lactobacillus acidophilus (фагоцитарный индекс у больных был в 4,5 раза выше, чем у здоровых), а также в 2 раза увеличилось количество гранулоцитов, интернализующих одноклеточные дрожжевые грибы Saccharomyces cerevisiae.
Ключевые слова: нейтрофилы, фагоцитоз, бронхиальная астма
Anisimova N.Yu., Galkina A.Yu., Kopylov A.N., Borisova T.V., Karaulov A.V., Kiselevsky M.V
PHENOTYP AND PHAGOCYTOSIS ACTIVITY OF NEUTROPHILS BLOOD OF PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA IN THE PERIOD OF AGGRAVATION
Following research included comparative analysis of asthmatics' blood neutrophils phenotypic features during exacerbation period(n=9) and a group of healthy donors(n = 15). As a result we determined authentic increase of concentration of CD45+CD66b+CD11b+ cells in comparing with healthy donors (89,1(69,6-99,6)% asthmatics and 48,4(41-62,8)% healthy donors). Acquired information authentically show significant activation of blood neutrophils. We determined that during asthma in exacerbation period the concentration of CD45+CD66b+CD11b+blood granulocytes almost doubled in comparing with healthy donors. Also there is a significant increasing of blood flow granulocytes' phagocytosis activity. Greater changes in phagocytosis effectors occurred after latex injection: phagocytosis index in asthmatics almost quadrupled in comparing with healthy donors( 63% asthmatics, 14% healthy donors) and phagocytosis number increased 15,7 times (47 and 3). Simultaneously there is a significant increasing of ingested gram-negative lactic acid bacteria L. acidophilus (asthmatics phagocytosis number increased in 4,5 times compared with healthy donors) and doubled amount of granulocytes capable for internalization of fungus S. cerevisiae.
Keywords: neutrophils, phagocytosis, bronchial asthma
Согласно полученным нами ранее данным, у больных бронхиальной астмой в стадии обострения отмечаются по-Караулов Александр Викторович - д-р мед. наук, проф., чл.- вышенные концентрации в крови ряда про- и противовос-
кор. ВАМН, e-mail: karayl°v@mtu-net.m палительных цитокинов - интерлейкина (ИЛ)1р, фактора
- 318 -
