CC BY
16
УДК 001.53: 575. 856: 577.21
Назар Б. I., к. вет. н.1 © Державный науково-дослгдный контрольный тстытут ветеринарных npenapamie та кормовых добавок, м. Лъвгв
МЕТОДИ ВИЯВЛЕННЯ ГЕНЕТИЧНО МОДИФ1КОВАНИХ ОРГАН13М1В ТА IX ЗАСТОСУВАННЯ В УКРА1Н1
Проведенi мотторынгов1 дослгдження продукцп з выкорыстанням розробленых методык показалы можлывжтъ ix выкорыстання для скрытнговых та тлътсных mecmie выявления незадекларованных ГМО у продуктах рослынного походження.
Вступ. Визначення генетично модифжованих оргашзм1в у продуктах проводять за допомогою молекулярно-генетичних метод1в, в основ! яких лежать генно-шженерш маншуляцп з ДНК i РНК. Ця велика група метод1в призначена для виявлення вар1ацш (пошкоджень), починаючи i3 структури дшянки ДНК (алеля, гена, perioHa хромосоми) i закшчуючи тиск нтозами первинно! послщовност1 основ. Оскшьки один ген може кодуватися 10000 i бшьше нуклешових кислот, то спещалкти лаборатори повинш волод1ти необхщними знаниями i методиками, що дозволять розшифровувати й анал1зувати всю генетичну послщовшсть.
Так, молекулярш генетики видшяють ДНК i3 кл1тин i за допомогою спещальних х1м1чних реакцш та прилад1в розшифровують ген, що анал1зуеться. До метод1в, що найчастше використовуються для виявлення генетичних модифжацш, вщносять ПЛР (пол1меразно ланцюгова реакщя) i секвенування. Основними елементами скриншгу можуть слугувати таю послщовност1, як 35S промотор, NOS-TepMiHaTop, pat чи маркерш ДНК послщовност1 для офщшно затверджених та схвалених для споживання ГМО (Mon810, Bt11, GT73 та ти.). Саме потенцшно висока чутливють цих методик вимагае особливо ретельного обладнання ПЛР-лаборатори.
Анал1зи на вмкт ГМО не можуть виконуватись у звичайних анал1тичних лаборатор1ях, оскшьки для цього необхщне дороге обладнання, реактиви, висококвал1фшований персонал, що волод1е р1зноплановими бюлопчними методами.
На сьогодш в Укра!ш офщшно застосовуються два методи: пол1мерно! ланцюгово! реакци (PCR) та ¿мунолопчний Elisa-тест (даш методи впроваджено в ДНДК1 ветпрепарат1в та кормових добавок). Метод PCR не досконалий через те, що вш працюе з базою вже вщомих бшюв i змш ДНК. Hoßi ж, нещодавно створеш, бшки вш виявити не може. Недол1к Elisa-тесту в тому, що вш не здатний визначити ГМО теля теплово! обробки продукту, тобто у вареному продукт! визначити генетичш модифжацп цим методом уже
1 Науковий консультант — д. вет. н., професор, членкор НААН 1.Я. Коцюмбас ©НазарБ. I., 2013
168
не можна. Кр1м того, обидва методи вимагають великих витрат часу - на визначення ГМО витрачаеться 1,5-2 доби. При цьому експертиза одного зразка на присутшсть ГМО коштуе вщ 400 до 600 грн. Якщо ж потр1бно визначити кшьюсть ГМО - це ще 1100-1200 грн. Близько 1 млн тис. коштуе саме устаткування.
В Донецькому национальному ушверситет1 економжи I торпвл1 ¿меш М. Туган-Барановського е спроби розробити бюф1зичний експрес-метод визначення ГМО який заснований на р1знищ м1ж результатами свтння продукт1в, яю м1стять ГМО, I тими, яю 1х не мютять приладом який являе собою газорозрядну камеру. Суть самого методу полягае в тому, що пщ д1ею коротких електричних ¿мпульшв з поверхш бюлопчного об'екту (сировини або продукту) вщбуваеться випускання електрошв I фотошв, яю утворюють свтння. Так-от, продукти, що мютять ГМО, мають свтння, вщмшне вщ звичайних продукт1в. Недол1к цього методу полягае в тому, що за його допомогою можна визначити лише наявшсть ГМО, але не його юльюсть.
Лабораторш, здатних проводити яюсну I юльюсну експертизу ГМО в продуктах харчування та кормах, в Укра!ш близько двадцяти. Серед них — лаборатор1я контролю кормових добавок та премжав ДНДК1 ветеринарних препарат1в та кормових добавок. Слщ зазначити, що ця лаборатор1я обладнана сучасним анал1тичним обладнанням вщ провщних св1тових виробниюв. Фах1вщ лаборатори мають значний досвщ роботи з проведения випробувань методом пол1меразно-ланцюгово! реакцп (основний скриншговий метод для визначення ГМО в зразку), виконання пбридизацшного I рестрикцшного анал1зу, анал1зу функцюнування вставки (ОТ-ПЛР I вивчення продукци бшка чужерщно! ДНК), секвенування I т. д.
Матер1али 1 методи. Для проведения пор1вняльно! оцшки ми використовували р1зш методичш пщходи на р1зних етапах проведения реакцп ПЦР.
Осюльки ефектившсть методу ПЛР, як I шших метод1в анал1зу ДНК, залежить вщ якост1 I чистоти видшено! ДНК, яюсть ДНК визначаеться довжиною фрагмент1в I ступенем 1х пошкодження пщ д1ею тепла, кислот та шших речовин, що викликають гщрол1з чи ферментативну деградацш. Саме яюсть ДНК може змшюватись залежно вщ вихщного матер1алу, ступеня його нативност1 та вщ метод1в екстрагування. Нами були застосоваш методи екстрагування ДНК за допомогою цетилтриметиламоншбромщу (ЦГАБ), тиск нтоза метод та комбшащя цих метод1в.
Загалом процес екстракци ДНК складався з таких стадш:
1. Руйнування кл1тково! стшки тканин.
2. Руйнування кл1тково! мембрани за допомогою детергенту.
3.1нактиващя ендогенних нуклеаз за допомогою детергенту та етилендиамштетраоцтово! кислоти. При цьому зв'язувались ¿они Mg2+, яю е кофакторами багатьох нуклеаз. У деяких випадках для розщеплення бщюв додавали тиск нтоза К. 4. Вщдшення тиск нто пол1сахарид1в.
169
5. Видаленнягщрофобнихкомпонент1в, лшвдв i тиск нтозам.
6. Остаточне видалення детергенту i концентрування ДНК.
Яюсне визначення ГМО засноване на щентифжаци генетично модифжованих регуляторних послщовностей - як правило, це 358-промотор i NOS-термшатор, яю найпоширешш1 у промислових генетично модифжованих культурах. У ход1 анал1зу одночасно в однш npo6ipu;i проходять три незалежш реакци. Перша реакщя дае змогу виявити фрагмент ДНК 35S-np0M0T0pa Bipycy мозаши цв1тно1 капусти (CaMV). Друга реакщя дае змогу виявити фрагмент ДНК-NOS термшатора T1 плазмщи Agrobacterium tumefaciens , яю присутш у багатьох вщомих вирощуваних у промислових масштабах генетично модифжованих рослинах. Наявшсть позитивно! динамжи для одше! або обох реакцш свщчить про наявшсть у зразку ДНК ГМО. Третя реакщя - реакщя внутршнього позитивного контролю (ВПК) - дае змогу виключити помилково негативш результати. Проходження кожно! з трьох реакцш детектуеться
за допомогою специф1чного зонда, який м1чений заданим флуоресцентним барвником. Програма дае змогу контролювати хщ реакцп у bcîx проб1рках одночасно. Шсля отримання достатшх даних було побудовано реальш графжи штенсивност! флуоресценци ycix npo6ipoK для обраного барвника. При штерпретаци результапв завдяки програмному забезпеченню KOMnaHiï «Синтол» даш з приладу АНК виводили на екран ПК у вигляд1 таблиц!.
Результати й обговорення. Пров1вши пор1вняльну ощнку модифжованих високоефективних методик видшення ДНК з використанням ioHHoro детергенту СТАВШИ (цетштр1метшаммошум бром1ду), а також з використанням сорбенту Silica (Si02), встановили що розроблеш методики дозволяють отримувати вшьну вщ тиск нто дом1шок i в необхщних юлькостях ДНК з р1зних продукт1в, що мютять компоненти тваринного i рослинного походження. ДНК придатна для яюсного та юльюсного анал1зу. Методики можуть використовуватися для екстракци та очищения ДНК як в багатокомпонентних, так i однокомпонентних сумшках.
Проведено дослщження з удосконалення методик визначення ГМО на ochobî ПЛР у реальному 4aci, що включають видшення ДНК з використанням сорбенту Silica (SiC А) або використання юнного детергенту СТАВШИ (цетштр1метшамошум бромщу), ампл1фшаци ДНК з м1ченими ДНК-зондами (що представляють собою ол1гонуклеотид, несучий флуоресцентний барвник i флуоресцентний погашувач), використовуваш для яюсно! i юльюсно! ощнки продукту.
Розроблено модифжовану методику яюсного виявлення ГМО з використанням 35S промотора, NOS термшатора i внутршнього позитивного контролю в однш реакцшнш cyMimi, що включае прискорену тиск нтозами с та ощнку результат на ochobî ПЛР у реальному 4aci.
Показано високу чутливкть i специф1чшсть модифжованих яюсних методик визначення ГМО на ochobî ПЛР у реальному 4aci (coï Roundup Ready лшп GTS 40-3-2, кукурудзи лшп MON 810), що дозволяють виявляти в зразку
170
ГМО менше 0,1% як в сировиш, так i в продуктах харчування, в тому числ1 термооброблених. Час анал1зу скорочуеться в 1,5-2 рази.
В ход1 проведених дослщжень за 5 м1сящв 2013 року проведено дослщження 130 проб комб1корм1в (для птищ, бройлер1в, свиней, телят, ВРХ та ти.), БМВД, макухи соево!. 3 них було виявлено 52 позитивш проби.
Висновок: отже, ефектившсть методу ПЛР, як i шших метод1в анал1зу ДНК, залежить вщ якост1 пщготовлено! проби, добре проведено! екстракцп та чистоти видшено! ДНК.
Л1тература
1. Попова М.Ю., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Жаринов А.И., Рогов И.А., Скрябин К.Г. / Определение содержания и выделение ПЦР-пригодной ДНК из коммерческих препаратов переработки сои // Биотехнология, Москва, 2003, № 2, с. 86-94.
2. Ивановцев О.В., Светличкик В.В., Каверин A.B. / Идентификация трансгенной сои в продуктах и кормах.// Журнал «Ветеринария и кормление», Москва 2006, №6 стр. 21-22
3. Назар Б.1. Актуальш питания контролю та o6iry ГМО в Украшг // Проблеми зоошженери та ветеринарно! медицини. Зб1рник наукових праць Випуск 24, Частина 2, "Ветеринарш науки" Харк1в 2012, ти.389- 392
Summary B. I. Nazar (bobnaz@ukr.net) State Scientific-Research Control Institute of Veterinary Medical Products and
Fodder Additives
DETERMINATION METHODS OF GENETICALLY MODIFIED OBJECTS AND THEIR APPLICATION IN UKRAINE
Conducted monitoring research of products using developed methods, showed possibility of theirs using for screening and quantitative tests for determination of non-avowed GMOs in products of plant origin.
Рецензент - к.вет.н., доцент Тибшка A.M.
171
