CC BY
44Б1ОТЕХНОЛОГ1Я ТА Б1ОБЕЗПЕКА
Л.В. Король, С.О. Гончарова, О.В. Пскова, А.В. Костенко, I.I. Коровко
УкраТнський iнститут експертизи сорлв рослин Л.М. Кожемякiна
1нститут бioенеpгетичних культур i цукрових буряюв НААН
УДК 604.6:631.53.01:633.854.79(477-25)
Особли&ост1 виявлення ггнгтигно Модифщобаани^ opzaHiçMiâ у насшни^ партш^ ртака (Brassica napus L.)
Наведено результати молекулярно-бюлог1чних досл1джень з апробаци та оцнки мульти-плексних тест-систем для 1дентифкаци генетично модифкованих орган1зм1в (ГМО) за до-помогою пол1меразно'[ланцюговоХреакци (ПЛР) у реальному час1 Для виявлення генетичних модифкацй у рослинах родини хрестоцвтих (Brassicaceae) недостатн1м е скрин нг основних регуляторних посл'довностей, оскльки в генно-нженерних мантуляц1ях використовуеться 35S промотор ДНК-умсного врусу мозаки цвтно'[ капусти (CaMV), наявнсть якого в досл'джуваному матер1ал1 може призвести до отримання хибно позитивнихрезультат'в. Досл'джено доцльнсть тесту на наявнсть ДНК-в'русу CaMV та анал'ву скриннгових посл'довностей генв нтересу для Ххнього використання пд час анал'ву досл'джуваних зразкв насння ртака (Brassica napus L.).
Встановлено, що анал1з наявност i / в1дсутност1 CaMV за позитивного результату по 35S промотору не дае вичерпно'[ в'дпов'д стосовно в1дсутност1 ГМО у досл'джуваному зразку. Обфунтовано доцльнсть скриннгу ГМО у наснному матер 1ал'1 рпака проводити за NOS термнатором i генами нтересу.
Ключовi слова:
pinaK, ГМО, cкpинiнгoвi посшдовносп ГМО, ПЛР у реальному 4aci, вipуc мозаТки цвкноТ капусти (CaMV).
Вступ. В умовах значного поширення бютехнолопчних культур необх^ним е контроль наявност генетично модифко-ваних органiзмiв (ГМО) серед наанного мaтерiaлу, осюльки виникае ризик забруднення посiвiв сшьськогосподарських культур, отриманих з викорис-танням як класичних методiв селекцп, так i генноТ нженерп [1]. Зокрема це стосуеться пе-рехреснозапильних культур таких, як кукурудза та ртак.
Ртак е основною олмною культурою у багатьох краТнах св^у, яка на сьогодн поадае трете мкце тсля соТ культурно'''
та бавовнику i друге за вало-вим виробництвом олп. Селек-^я ртака ведеться за двома основними напрямами: зни-ження вмкту глюкозинолатв, oптимiзaцiя cпiввiднoшення жирних кислот i пщвищення вмicту еруковоТ або лаурино-воТ кислот [2]. З розвитком технолога генноТ iнженеpiï були cтвopенi сорти ртака, що характеризуются cтiйкicтю про-ти геpбiцидiв широкого спектра дм, шкiдникiв та понижено!' температури, мають модифко-ваний жирнокислотний склад олп, здатысть до продукування фармаколопчних бiлкiв та си-
ровини для виробництва 6io-деградуючих пoлiмеpiв, а та-кож несуть ознаку чoлoвiчoï cтеpильнocтi. 3i створенням таких культур виникла необхщ-нicть у розробц метoдiв для Тх-нього скринтгу.
Загальноприйнята схема виявлення й щентифкацп ГМО включае нacтупнi етапи: 1) первинний скринтг наан-ного мaтеpiaлу, 2) aнaлiз на-явнocтi зареестрованих ГМО, 3) кiлькicне визначення ГМО. Як cкpинiнгoвi пocлiдoвнocтi ГМО зазвичай використовують 35S промотор та NOS термта-тор Agrobacterium tumefaciens,
осюльки вони входять до складу бшьш н1ж 80% ГМО [3, 4]. Однак скрин1нг за 35S промотором не ыдходить для ртака, оск1льки цей промотор взято з ДНК-ум1сного в1русу мозаТ-ки цв1тноТ капусти (Cauliflower mosaic virus - CaMV), який мае здатысть уражувати представ-ник1в родини хрестоцв1тих. От-же, п1д час проведення досш-джень на вм1ст ГМО у зразках р1пака надзвичайно великий ризик отримання хибних по-зитивних результат1в. М1ым1зу-вати ризик можна двома шляхами: або не використовувати у тест1 35S промотор CaMV, або для позитивних за цим промотором зразюв використовувати додатковий тест на наявысть ДнК-в1русу CaMV.
Метою нашоТ роботи було досшдити доц1льн1сть тесту на наявысть ДНК-в1русу CaMV та проанал1зувати 1нш1 послщов-ност1 для використання Тх як скрин1нгов1, п1д час анал1зу на-с1нних зразк1в ртака.
Методи дослщжень. В УкраТы затверджено ряд нор-мативних документ1в i методик, що забезпечують проведення досшджень з виявлення та ¡дентифкацп ГМО. Зокрема розроблено державы стандар-ти УкраТни для етап1в в1дбору проб, вид1лення ДНК, скриынгу ГМО [5, 6, 7, 8]. За щентифкацп ГМО у рослинному матер1ал1 вид1ляють наступн1 етапи:
- видшення ДНК з досл1джу-ваного зразка;
- скрин1нг на наявысть ГМО;
- перев1рка позитивних за 35S промотором i NOS терм1-натором зразюв на наявысть CaMV i A. tumefaciens;
- 1дентиф1кац1я ГМО.
Вид'лення ДНК. Першим
етапом анал1зу на наявысть ГМО у рослинному матер1а-л1 з допомогою ПЛР е вид1-
лення ДНК. Для отримання високоочищеноТ нуклеТновоТ кислоти, що не мктить 1нг1бу-ючих дом1шок, необх1дно використовувати найоптималь-н1ш1 методи [1]. Для видшення ДНК з нас1ння р1пака выбирали 1000 нас1нин й розмелю-вали на муку. Для подальших ман1пуляц1й використовували по 100 мг зразка. Видшення ДНК проводили з викорис-танням кат1онного детергенту бром1д цетилтриметиламо-н1ю (cetyltrimethylammonium bromide, ЦТАБ) 1з сорбентом [6, 8]. Для отриманих зразюв ДНК визначали концентрац1ю та ступшь очистки на спектрофотометр!, використовуючи ТЕ-буфер для кал1брування.
Скриннг генетично моди-ф'кованих органiзмiв. З метою виявлення ГМО у зразках ртака використовуеться три муль-типлексы тест-системи.
Перша мктила праймери та флуоресцентн1 зонди для виявлення специф1чного гена рослин, 35S промотору та NOS терм1натора («Растение / 35S / NOS скрининг», Синтол, Роайська Федерац1я). Дана тест-система призначена для виявлення ГМО рослинного походження у продуктах харчу-вання, сировиы та кормах для тварин методом ПЛР у реальному час1 та рекомендована для використання при анал1-з1 будь-яких зразюв, зокрема i багатокомпонентних, дае змогу встановити наявысть можли-вих л1ый ГМО без Тх щентифи кацп.
Друга тест-система мкти-ла праймери та флуоресценты зонди для виявлення специ-ф1чного гена рослин та CaMV («АмплсенсСенс® CamV-FL», Ампл'сенсСенс®, Роайська Фе-дерац1я). Наб1р реагент1в, при-значений для виявлення ДНК
CaMV у продуктах харчуван-ня i кормах, методом ПЛР з пбридизацмно-флуоресцентною детек^ею. Використання да-ного тестового набору сприяе отриманню iнформацiï про по-ходження ДНК 35S промотору, що наявний у зразку, який може бути як вiрусним, так i трансгенним.
Тест-система «ГМО рапс скрининг» (Синтол, Роайська Федеращя) мктить праймери до структурного гена ртака CruA, NOS термтатора, геыв фосфтотри цин N-ацетилтрансферази i3 Streptomyces viridochromogenes (Pat) та 5-енолтрувтшиюмат-3-фосфат синтетази (cp4 EPSPs), використовуеться для ideHmu-фкаци генетичних модифка-цм рiпака шляхом визначення характерних послщовностей ДНК-методом ПЛР у реальному час й рекомендована ви-робником для аналiзу рослин або насшня рiпака. Аналiз ви-значае бiльшiсть з комерцiйно зареестрованих лшм рiпака без ТхньоТ детально!' щентифи кацiï.
Перша та друга тест-системи передбачають використання внутрiшнього контролю ре-акцп, що дае можливiсть ви-явити присутнiсть речовин, яю iнгiбують реакцiю для третьоТ тест-системи, контроль можна здмснити за специфiчним геном рослин. ПЛР проводили зпдно з iнструкцiею вироб-ниюв в амплiфiкаторi iQTM5 Optical Module (Bio-Rad, США), включаючи негативний контроль вид'лення ДНК з наступ-ними параметрами (табл.).
Результати дослщжень. У процесi роботи проаналiзо-вано кожен етап щентифка-цiï ГМО в насiнному матерiалi. Для отриманих препаратiв ДНК з використанням ЦТАБ-методу
Таблиця
Параметри ампл1ф1кацп зразк1в ртака
Назва тест-системи Початкова денатураця Денатураця Гбридизаця праймер1в та детекця продукпв реакцп' Юльюсть циклв
«Растение / 35S / NOS скрининг» 95°С, 5 хв. 95°С, 15 с 59°С, 40 с 45
« АмплкенсСенс® CamV-FL» 95°С, 15 хв. 95°С, 15 с 59°С, 60 с 42
«ГМ рапс скрининг» 95°С, 5 хв. 95°С, 15 с 61°С, 40 с 45
i сорбенту визначали ступ1нь очистки та концентрац1ю на спектрофотометр!, використо-вуючи ТЕ-буфер з метою кал!-брування. Концентрац1я ДНК, вид!леноТ з1 зразк1в нас1ння р1пака, знаходилась у межах 150-270 мг/мл, при цьому сп!в-в!дношення А260/А280 було 1,7-1,8.
Реакцю ампл!ф!кацп зд!й-снювали з використанням трьох р1зних комерц1йних набор1в з метою виявлення ГМО у зраз-ках р1пака та оц1нки можливих ризикв за отримання хибно по-зитивних результат1в.
Результатом ПЛР-анал1зу у реальному час е графк флю-оресценцп досл1джуваних зразк1в i цифров1 дан1 пор!в-няння граф1к1в накопичення ДНК. У результат! проведених дослджень виявлено, що для зразк1в насння р1пака характерна наявн1сть сигналу за флуоресцентною пробою 35S промотору. Стосовно до схеми проведення анал1з1в на вм!ст ГМО в рослинному матер1ал1, наступним кроком е анал1з на наявн1сть CaMV, причому за умови виявлення ДНК CaMV досл!джуван! зразки розцшю-ються як негативн1. Однак, на наш погляд, така схема анал!-зу не е достатньою, оскльки результати як1сного анал1зу будуть однаковими для зраз-к1в, що м1стять лише CaMV, i для зразкв, що м1стять гене-
тично модифковаы органiзми i CaMV. Так було дослщжено зразки pinaKa, що мали по-зитивний сигнал лише по 35S промотору на BMicT CaMV (рис. 1). Зразки, для яких не виявлено позитивного сигналу по CaMV, розцнювались як так, що мктять ГМО та в по-дальших дослдженнях не ви-користовувались.
У тест-системi, з використанням якоТ отpимaнi дaнi результати, барвником JOE промар-ковано зонд до структурного гена ртака, а барвником ROX -зонд до послдовност CaMV.
Анaлiз позитивних за CaMV зразкв на наявнсть гена енол-трувтшиюматфосфатсинте-тази (EPSPs) та фосфтотрщин N-ацетилтрансферази (Pat) показав присутнсть у частини зразкв послiдовностей EPSPs-гена (рис. 3). Значення порогового циклу реакцп (threshold cycle - Ct) для трьох зразкв ри
пака за барвниками FAM (кар-боксифлуоресцеТн), HEX (6-кар-боксиродам1н), ROX, Cy5 наведено на рис. 2.
На рис. 2. воображено процес накопичення ц!льо-вих фрагментв структурного гена р1пака CruA, NOS терм!-натора, Pat гена та EPSPs гена, а також порогов! л!н!Т для флуоресцентних барвникв, в!дпов!дно яким встановлено значення Ct.
Отриман! дан! св!дчать про присутн!сть посл!довностей ДНК NOS терм!натора у зразках №443 i №444 (порогов! цикли за барвником FAM - 27 та 33) та EPSPs гена у цих же зразках (пороговий цикл за барвником Cy5 - 38). За барвником HEX, що вказуе на наявнсть структурного гена р!пака CruA, отри-мано позитивний результат по вс!х зразках.
Висновки. 1. Скриннг на-с!нного матер!алу рослин, що в!дносяться до родини хрес-тоцв!тих (Brassicaceae) доц!ль-но проводити за NOS терм!-натором та генами ¡нтересу. Анал!з наявност!/в!дсутност! CaMV не дае вичерпноТ в!д-пов!д! стосовно до в!дсутност! ГМО у зразку.
2. У подальш!й робот! для анал!зу зразк!в нас!ння родини хрестоцв!тих (Brassicaceae) на вм!ст ГМО сл!д рекоменду-
Рис. 1. Результати перев1рки п'яти зразк1в р1пака на наявнкть CaMV.
Рис. 2. Графш накопичення ДНК для зразкв pinaKa
Рис. 3. Результати скришнгу трьох 3pa3KiB pinaKa на нaявнiсть ГМО*
* Примiтка: червоним кольором позначено позицп', що свщчать про наявнiсть цтьових посшдовностей генетично модифiкованих органiзмiв.
вати flßi мультиплекснi тест-системи для проведення ПЛР у реальному 4aci. Одна з яких мае включати праймери та флуоресцентн зонди для виявлення специфiчного гена рослин, 35S промотору та NOS термшатора. При наявност позитивного сигналу на 35S промотор необхщно продо-
вжити aнaлiз даних зрaзкiв на виявлення геыв iнтересу, що забезпечують стiйкiсть рослин до найбтьш розповсюджених гербiцидiв широкого спектра дм. Це завдання виршуеться шляхом використання тест-системи, що включае праймери та флуоресцентн зонди для виявлення структурного гена
ртака CruA, NOS термтатора, Pat гена та EPSPs гена. Запро-понована схема проведення дослiджень дае змогу швид-ко й з невеликими витрата-ми отримати достовiрнi дaнi скринiнгу ГМО рiпaкa, що мк-тить вкaзaнi гени, та виключи-ти можливiсть отримання хиб-но позитивних результaтiв.
ВИКОРИСТАНА Л1ТЕРАТУРА
1. Сорочинський Б.В. Генетично модифковаы рос-лини / Б.В.Сорочинський, О.О. Данильченко, Г.В. Кртка. - К.: Фкосоцюцентр, 2005. - 204 с.
2. Ситнк 1.Д. Озимий та ярий ртак / 1.Д. Ситнк, О.Л. Кляченко, О.Г. Какор1н. - К.: Знання УкраТни, 2005. - 115 с.
3. Блюм Я.Б. Впровадження метод1в оц1нки наявност1 та вм1сту генетично модиф1кованих компонент1в у продуктах харчування, кормах i парфумерно-кос-метичних виробах / Я.Б. Блюм, М.О. Банникова, П.А. Карпов [та moii] // Наука та нноваци. - 2008. - Т. 4, № 2. - С. 40-48.
4. Епринцев А.П. Идентификация и исследование экспрессии генов / А.П. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин. - Воронеж, 2008. - 64 с.
5. ДСТУ ISO 21569:2008. Продукти харчовк Ме-тоди виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхшм умктом. Яюсш методи на основi aнaлiзувaння нуклеТновоТ кислоти (ISO 21569:2005, IDT): - Чинний вщ
2010-01-01 - К.: Держспоживстандарт УкраТни, 2009. - 50 с.
6. ДСТУ-П SEN/TS 15568:2008. Продукти харчовК Методи виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхым вмiстом. Вщбирання проб (SEN/TS 15568:2006, IDT) - Чинний вщ 201001-01 - К. : Держспоживстандарт УкраТни, 2009. -10 с.
7. ДСТУ ISO 21570:2008. Продукти харчовК Методи виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхым вмiстом. Ктьюсы методи на основi aнaлiзувaння нуклеТновоТ кислоти (ISO 21570:2005, IDT) - Чинний вщ 2009-07-01 - К.: Держспоживстандарт УкраТни, 2009. -83 с.
8. ДСТУ ISO 21571:2008. Продукти харчовК Методи виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхым вмiстом. Екстрагування нуклеТновоТ кислоти (ISO 21571:2005, IDT) - Чинний вщ 2009-07-01 - К.: Держспоживстандарт УкраТни, 2009. - 83 с.
