Научная статья на тему 'Особенности обнаружения генетически модифицированных организмов в семенных партиях рапса ( Brassica napus L. )'

Особенности обнаружения генетически модифицированных организмов в семенных партиях рапса ( Brassica napus L. ) Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
378
44
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
РіПАК / ГМО / GMO / СКРИНіНГОВі ПОСЛіДОВНОСТі ГМО / ПЛР У РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ / ВіРУС МОЗАїКИ ЦВіТНОї КАПУСТИ (CAMV) / CAULIFLOWER MOSAIC VIRUS (CAMV) / РАПС / RAPE / СКРИНИНГОВЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГМО / SCREENING SEQUENCES / ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ / REAL-TIME PCR / ВИРУС МОЗАИКИ ЦВЕТНОЙ КАПУСТЫ (CAMV)

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Король Л.В., Гончарова С.А., Писковая О.В., Костенко А.В., Коровко И.И.

Приведены результаты молекулярно-биологических исследований по апробации и оценке мультиплексных тест-систем для идентификации генетически модифицированных организмов (ГМО) с помощью ПЦР в реальном времени. Для обнаружения генетических модификаций в растениях семейства капустных (Brassicaceae) скрининг основных регуляторных последовательностей является недостаточно точным, поскольку в генно-инженерных манипуляциях используется 35S промотор ДНК-содержащего вируса мозаики цветной капусты (CaMV), наличие которого в исследуемом материале может привести к получению ложно положительных результатов. В процессе работы исследовали целесообразность теста на наличие ДНК вируса CaMV и скрининговых последовательностей генов интереса для использования их при анализе исследуемых образцов семян рапса ( Brassica napus L.). Установлено, что анализ наличия/отсутствия CaMV при положительном результате по 35S промотору не дает исчерпывающего ответа об отсутствии ГМО в образце. Обоснована целесообразность скрининга ГМО в семенном материале рапса проводить по NOS терминатору и генам интереса.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Король Л.В., Гончарова С.А., Писковая О.В., Костенко А.В., Коровко И.И.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Peculiarities of the genetically modified organisms’ detection in seed batches of rape (Brassica napus L.)

This paper presents the results of molecular studies on testing and evaluation of multiplex test systems for the genetically modified organisms’ (GMOs) identification by PCR in real time. For the detection of genetic modifications in plants of the cabbage family (Brassicaceae) screening of major regulatory sequences is insufficient, as in genetic engineering manipulations 35S promoter of DNA-containing cauliflower mosaic virus (CaMV) is used, which presence in the test material can lead to false positive results. In this work the feasibility of testing for the presence of viral CaMV’s DNA and analysis of screened gene sequences of interest for the usage during the analysis of rapeseed (Brassica napus L.) samples. It was established that the analysis of the presence/absence of a positive result for the CaMV 35S promoter is not giving complete answers to the absence of GMO in the sample. The appropriateness of GMO’s screening in rape seeds with NOS terminator and genes of interest.

Текст научной работы на тему «Особенности обнаружения генетически модифицированных организмов в семенных партиях рапса ( Brassica napus L. )»

Б1ОТЕХНОЛОГ1Я ТА Б1ОБЕЗПЕКА

Л.В. Король, С.О. Гончарова, О.В. Пскова, А.В. Костенко, I.I. Коровко

УкраТнський iнститут експертизи сорлв рослин Л.М. Кожемякiна

1нститут бioенеpгетичних культур i цукрових буряюв НААН

УДК 604.6:631.53.01:633.854.79(477-25)

Особли&ост1 виявлення ггнгтигно Модифщобаани^ opzaHiçMiâ у насшни^ партш^ ртака (Brassica napus L.)

Наведено результати молекулярно-бюлог1чних досл1джень з апробаци та оцнки мульти-плексних тест-систем для 1дентифкаци генетично модифкованих орган1зм1в (ГМО) за до-помогою пол1меразно'[ланцюговоХреакци (ПЛР) у реальному час1 Для виявлення генетичних модифкацй у рослинах родини хрестоцвтих (Brassicaceae) недостатн1м е скрин нг основних регуляторних посл'довностей, оскльки в генно-нженерних мантуляц1ях використовуеться 35S промотор ДНК-умсного врусу мозаки цвтно'[ капусти (CaMV), наявнсть якого в досл'джуваному матер1ал1 може призвести до отримання хибно позитивнихрезультат'в. Досл'джено доцльнсть тесту на наявнсть ДНК-в'русу CaMV та анал'ву скриннгових посл'довностей генв нтересу для Ххнього використання пд час анал'ву досл'джуваних зразкв насння ртака (Brassica napus L.).

Встановлено, що анал1з наявност i / в1дсутност1 CaMV за позитивного результату по 35S промотору не дае вичерпно'[ в'дпов'д стосовно в1дсутност1 ГМО у досл'джуваному зразку. Обфунтовано доцльнсть скриннгу ГМО у наснному матер 1ал'1 рпака проводити за NOS термнатором i генами нтересу.

Ключовi слова:

pinaK, ГМО, cкpинiнгoвi посшдовносп ГМО, ПЛР у реальному 4aci, вipуc мозаТки цвкноТ капусти (CaMV).

Вступ. В умовах значного поширення бютехнолопчних культур необх^ним е контроль наявност генетично модифко-ваних органiзмiв (ГМО) серед наанного мaтерiaлу, осюльки виникае ризик забруднення посiвiв сшьськогосподарських культур, отриманих з викорис-танням як класичних методiв селекцп, так i генноТ нженерп [1]. Зокрема це стосуеться пе-рехреснозапильних культур таких, як кукурудза та ртак.

Ртак е основною олмною культурою у багатьох краТнах св^у, яка на сьогодн поадае трете мкце тсля соТ культурно'''

та бавовнику i друге за вало-вим виробництвом олп. Селек-^я ртака ведеться за двома основними напрямами: зни-ження вмкту глюкозинолатв, oптимiзaцiя cпiввiднoшення жирних кислот i пщвищення вмicту еруковоТ або лаурино-воТ кислот [2]. З розвитком технолога генноТ iнженеpiï були cтвopенi сорти ртака, що характеризуются cтiйкicтю про-ти геpбiцидiв широкого спектра дм, шкiдникiв та понижено!' температури, мають модифко-ваний жирнокислотний склад олп, здатысть до продукування фармаколопчних бiлкiв та си-

ровини для виробництва 6io-деградуючих пoлiмеpiв, а та-кож несуть ознаку чoлoвiчoï cтеpильнocтi. 3i створенням таких культур виникла необхщ-нicть у розробц метoдiв для Тх-нього скринтгу.

Загальноприйнята схема виявлення й щентифкацп ГМО включае нacтупнi етапи: 1) первинний скринтг наан-ного мaтеpiaлу, 2) aнaлiз на-явнocтi зареестрованих ГМО, 3) кiлькicне визначення ГМО. Як cкpинiнгoвi пocлiдoвнocтi ГМО зазвичай використовують 35S промотор та NOS термта-тор Agrobacterium tumefaciens,

осюльки вони входять до складу бшьш н1ж 80% ГМО [3, 4]. Однак скрин1нг за 35S промотором не ыдходить для ртака, оск1льки цей промотор взято з ДНК-ум1сного в1русу мозаТ-ки цв1тноТ капусти (Cauliflower mosaic virus - CaMV), який мае здатысть уражувати представ-ник1в родини хрестоцв1тих. От-же, п1д час проведення досш-джень на вм1ст ГМО у зразках р1пака надзвичайно великий ризик отримання хибних по-зитивних результат1в. М1ым1зу-вати ризик можна двома шляхами: або не використовувати у тест1 35S промотор CaMV, або для позитивних за цим промотором зразюв використовувати додатковий тест на наявысть ДнК-в1русу CaMV.

Метою нашоТ роботи було досшдити доц1льн1сть тесту на наявысть ДНК-в1русу CaMV та проанал1зувати 1нш1 послщов-ност1 для використання Тх як скрин1нгов1, п1д час анал1зу на-с1нних зразк1в ртака.

Методи дослщжень. В УкраТы затверджено ряд нор-мативних документ1в i методик, що забезпечують проведення досшджень з виявлення та ¡дентифкацп ГМО. Зокрема розроблено державы стандар-ти УкраТни для етап1в в1дбору проб, вид1лення ДНК, скриынгу ГМО [5, 6, 7, 8]. За щентифкацп ГМО у рослинному матер1ал1 вид1ляють наступн1 етапи:

- видшення ДНК з досл1джу-ваного зразка;

- скрин1нг на наявысть ГМО;

- перев1рка позитивних за 35S промотором i NOS терм1-натором зразюв на наявысть CaMV i A. tumefaciens;

- 1дентиф1кац1я ГМО.

Вид'лення ДНК. Першим

етапом анал1зу на наявысть ГМО у рослинному матер1а-л1 з допомогою ПЛР е вид1-

лення ДНК. Для отримання високоочищеноТ нуклеТновоТ кислоти, що не мктить 1нг1бу-ючих дом1шок, необх1дно використовувати найоптималь-н1ш1 методи [1]. Для видшення ДНК з нас1ння р1пака выбирали 1000 нас1нин й розмелю-вали на муку. Для подальших ман1пуляц1й використовували по 100 мг зразка. Видшення ДНК проводили з викорис-танням кат1онного детергенту бром1д цетилтриметиламо-н1ю (cetyltrimethylammonium bromide, ЦТАБ) 1з сорбентом [6, 8]. Для отриманих зразюв ДНК визначали концентрац1ю та ступшь очистки на спектрофотометр!, використовуючи ТЕ-буфер для кал1брування.

Скриннг генетично моди-ф'кованих органiзмiв. З метою виявлення ГМО у зразках ртака використовуеться три муль-типлексы тест-системи.

Перша мктила праймери та флуоресцентн1 зонди для виявлення специф1чного гена рослин, 35S промотору та NOS терм1натора («Растение / 35S / NOS скрининг», Синтол, Роайська Федерац1я). Дана тест-система призначена для виявлення ГМО рослинного походження у продуктах харчу-вання, сировиы та кормах для тварин методом ПЛР у реальному час1 та рекомендована для використання при анал1-з1 будь-яких зразюв, зокрема i багатокомпонентних, дае змогу встановити наявысть можли-вих л1ый ГМО без Тх щентифи кацп.

Друга тест-система мкти-ла праймери та флуоресценты зонди для виявлення специ-ф1чного гена рослин та CaMV («АмплсенсСенс® CamV-FL», Ампл'сенсСенс®, Роайська Фе-дерац1я). Наб1р реагент1в, при-значений для виявлення ДНК

CaMV у продуктах харчуван-ня i кормах, методом ПЛР з пбридизацмно-флуоресцентною детек^ею. Використання да-ного тестового набору сприяе отриманню iнформацiï про по-ходження ДНК 35S промотору, що наявний у зразку, який може бути як вiрусним, так i трансгенним.

Тест-система «ГМО рапс скрининг» (Синтол, Роайська Федеращя) мктить праймери до структурного гена ртака CruA, NOS термтатора, геыв фосфтотри цин N-ацетилтрансферази i3 Streptomyces viridochromogenes (Pat) та 5-енолтрувтшиюмат-3-фосфат синтетази (cp4 EPSPs), використовуеться для ideHmu-фкаци генетичних модифка-цм рiпака шляхом визначення характерних послщовностей ДНК-методом ПЛР у реальному час й рекомендована ви-робником для аналiзу рослин або насшня рiпака. Аналiз ви-значае бiльшiсть з комерцiйно зареестрованих лшм рiпака без ТхньоТ детально!' щентифи кацiï.

Перша та друга тест-системи передбачають використання внутрiшнього контролю ре-акцп, що дае можливiсть ви-явити присутнiсть речовин, яю iнгiбують реакцiю для третьоТ тест-системи, контроль можна здмснити за специфiчним геном рослин. ПЛР проводили зпдно з iнструкцiею вироб-ниюв в амплiфiкаторi iQTM5 Optical Module (Bio-Rad, США), включаючи негативний контроль вид'лення ДНК з наступ-ними параметрами (табл.).

Результати дослщжень. У процесi роботи проаналiзо-вано кожен етап щентифка-цiï ГМО в насiнному матерiалi. Для отриманих препаратiв ДНК з використанням ЦТАБ-методу

Таблиця

Параметри ампл1ф1кацп зразк1в ртака

Назва тест-системи Початкова денатураця Денатураця Гбридизаця праймер1в та детекця продукпв реакцп' Юльюсть циклв

«Растение / 35S / NOS скрининг» 95°С, 5 хв. 95°С, 15 с 59°С, 40 с 45

« АмплкенсСенс® CamV-FL» 95°С, 15 хв. 95°С, 15 с 59°С, 60 с 42

«ГМ рапс скрининг» 95°С, 5 хв. 95°С, 15 с 61°С, 40 с 45

i сорбенту визначали ступ1нь очистки та концентрац1ю на спектрофотометр!, використо-вуючи ТЕ-буфер з метою кал!-брування. Концентрац1я ДНК, вид!леноТ з1 зразк1в нас1ння р1пака, знаходилась у межах 150-270 мг/мл, при цьому сп!в-в!дношення А260/А280 було 1,7-1,8.

Реакцю ампл!ф!кацп зд!й-снювали з використанням трьох р1зних комерц1йних набор1в з метою виявлення ГМО у зраз-ках р1пака та оц1нки можливих ризикв за отримання хибно по-зитивних результат1в.

Результатом ПЛР-анал1зу у реальному час е графк флю-оресценцп досл1джуваних зразк1в i цифров1 дан1 пор!в-няння граф1к1в накопичення ДНК. У результат! проведених дослджень виявлено, що для зразк1в насння р1пака характерна наявн1сть сигналу за флуоресцентною пробою 35S промотору. Стосовно до схеми проведення анал1з1в на вм!ст ГМО в рослинному матер1ал1, наступним кроком е анал1з на наявн1сть CaMV, причому за умови виявлення ДНК CaMV досл!джуван! зразки розцшю-ються як негативн1. Однак, на наш погляд, така схема анал!-зу не е достатньою, оскльки результати як1сного анал1зу будуть однаковими для зраз-к1в, що м1стять лише CaMV, i для зразкв, що м1стять гене-

тично модифковаы органiзми i CaMV. Так було дослщжено зразки pinaKa, що мали по-зитивний сигнал лише по 35S промотору на BMicT CaMV (рис. 1). Зразки, для яких не виявлено позитивного сигналу по CaMV, розцнювались як так, що мктять ГМО та в по-дальших дослдженнях не ви-користовувались.

У тест-системi, з використанням якоТ отpимaнi дaнi результати, барвником JOE промар-ковано зонд до структурного гена ртака, а барвником ROX -зонд до послдовност CaMV.

Анaлiз позитивних за CaMV зразкв на наявнсть гена енол-трувтшиюматфосфатсинте-тази (EPSPs) та фосфтотрщин N-ацетилтрансферази (Pat) показав присутнсть у частини зразкв послiдовностей EPSPs-гена (рис. 3). Значення порогового циклу реакцп (threshold cycle - Ct) для трьох зразкв ри

пака за барвниками FAM (кар-боксифлуоресцеТн), HEX (6-кар-боксиродам1н), ROX, Cy5 наведено на рис. 2.

На рис. 2. воображено процес накопичення ц!льо-вих фрагментв структурного гена р1пака CruA, NOS терм!-натора, Pat гена та EPSPs гена, а також порогов! л!н!Т для флуоресцентних барвникв, в!дпов!дно яким встановлено значення Ct.

Отриман! дан! св!дчать про присутн!сть посл!довностей ДНК NOS терм!натора у зразках №443 i №444 (порогов! цикли за барвником FAM - 27 та 33) та EPSPs гена у цих же зразках (пороговий цикл за барвником Cy5 - 38). За барвником HEX, що вказуе на наявнсть структурного гена р!пака CruA, отри-мано позитивний результат по вс!х зразках.

Висновки. 1. Скриннг на-с!нного матер!алу рослин, що в!дносяться до родини хрес-тоцв!тих (Brassicaceae) доц!ль-но проводити за NOS терм!-натором та генами ¡нтересу. Анал!з наявност!/в!дсутност! CaMV не дае вичерпноТ в!д-пов!д! стосовно до в!дсутност! ГМО у зразку.

2. У подальш!й робот! для анал!зу зразк!в нас!ння родини хрестоцв!тих (Brassicaceae) на вм!ст ГМО сл!д рекоменду-

Рис. 1. Результати перев1рки п'яти зразк1в р1пака на наявнкть CaMV.

Рис. 2. Графш накопичення ДНК для зразкв pinaKa

Рис. 3. Результати скришнгу трьох 3pa3KiB pinaKa на нaявнiсть ГМО*

* Примiтка: червоним кольором позначено позицп', що свщчать про наявнiсть цтьових посшдовностей генетично модифiкованих органiзмiв.

вати flßi мультиплекснi тест-системи для проведення ПЛР у реальному 4aci. Одна з яких мае включати праймери та флуоресцентн зонди для виявлення специфiчного гена рослин, 35S промотору та NOS термшатора. При наявност позитивного сигналу на 35S промотор необхщно продо-

вжити aнaлiз даних зрaзкiв на виявлення геыв iнтересу, що забезпечують стiйкiсть рослин до найбтьш розповсюджених гербiцидiв широкого спектра дм. Це завдання виршуеться шляхом використання тест-системи, що включае праймери та флуоресцентн зонди для виявлення структурного гена

ртака CruA, NOS термтатора, Pat гена та EPSPs гена. Запро-понована схема проведення дослiджень дае змогу швид-ко й з невеликими витрата-ми отримати достовiрнi дaнi скринiнгу ГМО рiпaкa, що мк-тить вкaзaнi гени, та виключи-ти можливiсть отримання хиб-но позитивних результaтiв.

ВИКОРИСТАНА Л1ТЕРАТУРА

1. Сорочинський Б.В. Генетично модифковаы рос-лини / Б.В.Сорочинський, О.О. Данильченко, Г.В. Кртка. - К.: Фкосоцюцентр, 2005. - 204 с.

2. Ситнк 1.Д. Озимий та ярий ртак / 1.Д. Ситнк, О.Л. Кляченко, О.Г. Какор1н. - К.: Знання УкраТни, 2005. - 115 с.

3. Блюм Я.Б. Впровадження метод1в оц1нки наявност1 та вм1сту генетично модиф1кованих компонент1в у продуктах харчування, кормах i парфумерно-кос-метичних виробах / Я.Б. Блюм, М.О. Банникова, П.А. Карпов [та moii] // Наука та нноваци. - 2008. - Т. 4, № 2. - С. 40-48.

4. Епринцев А.П. Идентификация и исследование экспрессии генов / А.П. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин. - Воронеж, 2008. - 64 с.

5. ДСТУ ISO 21569:2008. Продукти харчовк Ме-тоди виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхшм умктом. Яюсш методи на основi aнaлiзувaння нуклеТновоТ кислоти (ISO 21569:2005, IDT): - Чинний вщ

2010-01-01 - К.: Держспоживстандарт УкраТни, 2009. - 50 с.

6. ДСТУ-П SEN/TS 15568:2008. Продукти харчовК Методи виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхым вмiстом. Вщбирання проб (SEN/TS 15568:2006, IDT) - Чинний вщ 201001-01 - К. : Держспоживстандарт УкраТни, 2009. -10 с.

7. ДСТУ ISO 21570:2008. Продукти харчовК Методи виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхым вмiстом. Ктьюсы методи на основi aнaлiзувaння нуклеТновоТ кислоти (ISO 21570:2005, IDT) - Чинний вщ 2009-07-01 - К.: Держспоживстандарт УкраТни, 2009. -83 с.

8. ДСТУ ISO 21571:2008. Продукти харчовК Методи виявлення генетично модифкованих оргaнiзмiв i продуклв з Тхым вмiстом. Екстрагування нуклеТновоТ кислоти (ISO 21571:2005, IDT) - Чинний вщ 2009-07-01 - К.: Держспоживстандарт УкраТни, 2009. - 83 с.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.