CC BY
16УДК 633.63/577.213.3 http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).2016.88686
Розроблення мультиплексно'1 системи ПЛР для 1дентиф1каци цукрових буряк1в, толерантних до дИ* гл1фосату
Л. М. Присяжнюк*, Ю. В. Шит1кова, 0. 0. Волчков
Укратський институт експертизи copmie рослин, вул. Генерала Родимцева, 15, м. Kuïe, 03041, Украта, *e-mail: prysiazhniuk_l@ukr.net
Мета. Створити мультиплексну систему для 1дентифжац1'1 толерантних до гтфосату буряк1'в за допомогою ПЛР. Методи. Молекулярно-генетичн методи анал1зу нукле'нових кислот. Результати. Наведено результати досл1'джень з визначення параметр1в пол1'меразно'1 ланцюгово'1 реакцИ" (ПЛР) для розроблення мультиплексно'1 системи для 1дентиф1кац11 структурних елеменлв трансгенно'1 конструкцл з геном cp 4 epsps, що забезпечуе толерантнкть до гтфосату. Для отримання амплжотв цтльових посл1'довностей ДНК визначено там значення температурних режим1'в ПЛР: крок 1 (початкова денатурац1я) 95 °С - 3 хв; крок 2 (напрацювання специф1чних продуклв реакцИ'): денатурац'я 95 °С - 45 с; пбридизац'я праймер1в 55 °С - 50 с; елонгац'я 72 °С - 1 хв; юльюсть цикт'в - 40; крок 3 (к'нцева елонгаця) 72 °С - 6 хв. Проведено серш ПЛР з метою добору оптимально'' юлькосл матриц' ДНК для ефективно'1 оц1нки трансгенних рослин цукрових буряк'в за наявнктю специф1'чних посл1'довностей. Висновки. Для iдентиф1 кац11 трансгенних цукрових буряк1'в, толерантних до д11' гтфосату, доцльно визначати в окремих генотипах 35S промотор та ген cp 4 epsps. Встановлено, що в процес добору температурних параметр1в мультиплексно'1 реакц" на щентифжацш гена als не впливало зб1льшення температури г1бридизац11 праймер1в на 5 °С, що дало змогу включити специф1чт праймери для визначення цпе1 постдовносл як внутршнього контролю. За результатами пробних мультиплексних реакц1й визначено концентрацл дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфалв) та 1он1в Mg2+, як1 дали змогу виключити можливкть отримання неспециф1чних фрагменлв та хибно негативних результалв. Визначено оптимальну юльккть матриц ДНК (100-150 нг) для ефективно'1 оц1нки трансгенних рослин цукрових бурямв за наявнктю специф1чних постдовностей. 0триман1 результати дали змогу розробити мультиплексну тест-систему для 1дентиф1кац11 трансгенних цукрових бурямв, толерантних до д11 гтфосату, за допомогою яко'1 можна одночасно визначити 35S промотор, ген cp 4 epsps та ген als як внутрштй контроль реакц".
Ключов! слова: ген cp 4 epsps, 35S промотор, трансгент цукpoвi буряки, параметри амплiфiкацiï.
Вступ
Одшею з основних свггових проблем у XXI ст. е глобальна енергетична криза. У зв'язку з цим важливого значення набува-ють бюлопчт. та б1оф1зичн1 дослвдження, спрямован на полшшення властивостей схльськогосподарських культур, стаб1льшсть виробництва i зниження його втрат [1]. Так проблеми сьогодш успiшно розв'язують шляхом використання трансгенних рослин. В Укра'1'ш. цукровi буряки (Beta vulgaris L. var. saccharifera Alef.) e одтею з важливих иль-ськогосподарських культур [2, 3].
На цей час опублшовано ряд робгг з гене-тично'1 трансформаци B. vulgaris за допомогою Agrobacterium tumefaciens, бюл^тично-го методу, методом трансформаци прото-пластiв iз застосуванням полiетиленглiколю
Larysa Prysiazhniuk
http://orcid.org/0000-0003-4388-0485 Yuliia Shytikova
http://orcid.org/0000-0002-1403-694X Olexandr Volchkov
http:// orcid.org/0000-0002-8324-7142
для отримання стшких до гербщидГв лшш та ибридГв [4]. Сучасний селекцшний про-цес цукрових бурякГв ^рунтуеться на вико-ристаннг методГв ибридно!" селекци, тому актуальним е розроблення ефективного методу Гдентифшаци трансформантгв, який дасть змогу значно прискорити та шдвищи-ти ефективнiсть проведення добору серед рiзних генотипiв цукрових бурякгв з метою створення гiбридiв з новими ознакам, зокре-ма з толерантнгстю до дГ! глiфосату [5-7].
Мета дослгджепь - створити мультиплексну систему Гдентифшаци толерантних до глiфосату бурякгв за допомогою ПЛР.
Матер1али та методика досл1джень
Дослiджуванi дипло'1дш ибриди були отри-манi на ЯлтушкГвськш дослiдно-селекцiйнiй станци в лаборатори селекци 1нституту бю-енергетичних культур i цукрових бурякГв НААН шляхом гетерозисно! селекци на осно-вГ чоловiчостерильних лшш та багатонасш-ного запилювача, який мГстить ген, що обу-мовлюе толерантшсть до дГ! глГфосату. Мате-рГалом для роботи були шгсть ибридГв по 30 генотишв кожного для одного аналГзу.
Вид1лення ДНК здшснювали згдно з мо-дифшованою авторами методикою на осно-Bi методу [8], з використанням катюнного детергента ЦТАБ i3 частини листово! плас-тини.
Показники якостi нукле!нових кислот (концентрацiю та чистоту) оцшювали на основi ввдношення поглинання за довжини хвиль 260 нм i 280 нм (260/280 нм) за допо-могою спектрофотометра BioPhotometr (Eppendorf, Нiмеччина) [9, 10].
За сучасними даними, близько 80% транс-формованих рослин, що виявляють толе-рантнiсть до ди гербщид1в, у складi перенесено! генетично! конструкцй мiстять конс-титутивний промотор вiрусу моза!ки цвгг-но! капусти (35S промотор) та термшатор-ний сигнал гена нопалш синтази (NOS-термiнатор) [11].
Для виявлення частин генетично! конструкцй' у трансгенних рослин цукрових бу-рякiв використовували метод ПЛР з подаль-шим електрофоретичним роздiленням про-дуктiв реакцй [12, 13]. Для добору парамет-рiв ПЛР, визначення оптимальних концен-трацiй компонентiв реакцшно! сумiшi спо-
ПЛР проводили на амплiфiкаторi TC-Y CreaCon (USA). Реакцшна сумiш метила 100 нг сумарно! рослинно! ДНК, сольовий буфер (10 мМ Tris-HCl, рН 9,0; 50 мМ KCl; 0,01% Тритон Х-100), 1,5-2,5 мМ MgCl2; по 200 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфатв (дНТФ), по 0,2-1 мкМ кожного з праймерiв та 1 одиницю Tag-полiмерази. Загальний об'ем сумiшi становив 20 мкл.
Для кожно! пари праймерiв застосовували такi температурно-часовi параметри ПЛР: крок 1 (початкова денатуращя) 95 °С - 2-5 хв; крок 2 (напрацювання специфiчних продук-тiв реакцй): денатурацiя 94-95 °С - 30-60 с; гiбридизацiя праймерiв 50-55 °С - 40-60 с; елонгащя 72 °С - 30-60 с; ыльылть циклiв - 35-40; крок 3 (кшцева елонгацiя) 72 °С -5 хв.
Продукти реакцй' ампл:ф:каци в:зуал:зу-вали методом електрофорезу в 1-1,5% ага-
чатку проводили сери моноплексних реак-цiй, а поим на основi отриманих даних здшснювали досл1дження з розроблення мультиплексно! системи.
Пiдбираючи оптимальш умови проведен-ня ПЛР, визначали там параметри реакцй': склад реакцшно! сумiшi - концентрацiя праймерiв, Taq-полiмерази, Mg2+; програма амплiфiкацii' - температура пбридизаци праймерiв, тривалiсть кожного кроку циклу амплiфiкацii', кiлькiсть циклiв, тривал^ть попередньо! денатурацй'. Далi, використову-ючи данi, отриманi у процесi проведення моноплексних реакцш [14], був п:дабраний склад реакцiйноi' сум:ш: для мультиплекс-но! ПЛР системи, що забезпечуе стабiльне напрацювання амплiконiв [15-20].
Для вдентифшаци гена cp 4 epsps (ген ш-тересу), промоторно! дшянки генетично! конструкцй' (промотор 35S в:русу моза1ки цв:тно!' капусти) в рослинах цукрових буря-к:в проводили реакщю амплiфiкацii' з прай-мерами, стоциф:чними до ц:льових посл:-довностей. Як внутршнш стандарт використовували ген ацетолактатсинтетази (als) цукрових буряк:в (табл. 1) [6].
розному гел: у 1х ТБЕ (тр:с-боратний буфер-ний розчин) за загальноприйнятою методикою з бромистим етид:ем [12, 13]. Електро-форез проводили протягом 30 хв за напру-женосп електричного поля 5 В/см.
Результати електрофоретичного розпод1лу продуктв ПЛР визначали при ультраф:оле-товому свил та ф:ксували за допомогою системи документування гел:в, що склада-еться з транс:люм:натора та ввдеосистеми з цифровою камерою. Розм:р отриманих фраг-мент:в визначали за допомогою комп'ютер-но! програми Totallab 2.0.
Результати досл1*джень
Встановлено [14], що вдентифшащю трансгенних цукрових буря^в толерантних до дй' гл:фосату, доц:льно проводити за 35S промотором, геном cp 4 epsps та геном als (внут-ршнш контроль). Концентрац:я отримано!
Таблиця 1
Характеристика праймер!*в для 1*дентиф1*кац1*1 досл1'джуваних посл1'довностей
Ц1'льов1 П0СЛ1Д0ВН0СЛ Праймери Нуклеотидна посл1'довт'сть 5' 3' Ю'льк'сть нуклеотид1'в, п. н. CG-склад, % Температура плавлення, °С От'куваний розм1'р амплшот'в, п.н.
35S промотор 35S-1 35S-2 gcTccTAcAAATgccA TcA qATAqTqqqATTqTqcqTcA 19 20 47 50 54,5 57,3 195
Ген ср 4 epsps pr1 pr2 cAccggTCTTTTggAAggTgAAg AAcgAgAcccATAAcgAggAAgc 23 23 52 52 60,5 59,4 1132
Ген als bvprl bvpr2 ggTcAggTTcAgccAcAAAcTc gAAgAcTcgTTAgcccAAccAAg 22 23 55 52 57,2 57,9 840
ДНК становила 180,4-280,4 мкг/мл, показ-ники чистоти препарату ДНК були в межах 1,75-1,93. Для щентифшацп структурних елемент1в генетично! конструкцп та щльо-вих гешв з метою добору генотитв, як Mic-тять вci елементи конструкцп, проводили ПЛР çi cпецифiчними праймерами окремо для кожно! з дослщжуваних поcлiдовноcтей
ДНК. У подальшому цей матерiал викорис-товували для розроблення мультиплексно! системи.
Пicля проведення електрофорезу продук-тiв амплiфiкацiï пiд УФ-св^лом на агароз-ному гелi були виявлеш амплiкони розмь ром 195 п.н., що вiдповiдають поcлiдовноcтi 35S промотора (рис. 1).
Рис. 1. 1дентифжац1'я 35S промотора: M - маркер молекулярно!' маси (GeneRuler™ 100bp); 1-3 - ДНК п'брида 12-189; 4-6 - ДНК пбрида 12-190; 7-11 - ДНК пбрида 12-192; 12-16 - ДНК п'брида 12-216; 17 - негативний контроль (ДНК нетрансформованого п'брида)
Biдcутнicть амплiконiв на треку № 17 негативного контрольного зразка свщчить про доcтовiрнicть отриманих даних та вщсутшсть контамiнацiï. Наявнicть амплiконiв розмiром 195 п.н. на треках № 1, 5-7, 10, 13-14, як вщповщають зразкам дослщжу-вано! ДНК генотитв 12-189/1, 12-190/6, 12-190/7, 12-192/1, 12-192/6, 12-216/2, 12-216/3, свщчить про наявшсть у цих рос-линах 35S промотору. Вщсутшсть амплшо-ну зазначеного розмiру на треках № 2-4, 8-9, 11-12, 15-16 з продуктами амплiфiка-цп ДНК гiбридiв 12-189/3, 12-189/5, 12190/5, 12-192/2, 12-192/3, 12-192/7 та за-пилювача 12-216/6, 12-216/8, 12-216/9 вка-зуе на те, що щ генотипи не м^тять промо-торно! дiлянки або вона не щентифшована.
ПЛР-аналiз дослщжуваних рослин цукро-вих бурякiв з метою щентифшацп гена, що зумовлюе толерантность до дiï глiфоcату, вия-вив наявнicть амплiконiв розмiру 1132 п.н.,
яю вiдповiдають пошуковiй послщовноста гена cp 4 epsps (рис. 2).
Як видно з рис. 2, ген cp 4 epsps було щен-тифшовано в зразках 12-189/1, 12-190/7, 12-192/1, 12-192/6, 12-216/2, 12-216/3, 12-216/6 на треках № 1, 6-7, 10, 13-15. Трек № 16, який вщповщае зразку негативного контролю, не метить амплшошв, що свщчить про вщсутшсть контамшацп та ефектившсть проведення ПЛР. Вщсутшсть продук^в амплiфiкацiï очшуваного розмiру на треках № 2-5, 8-9, 11-12, ят вщповща-ють зразкам 12-189/3, 12-189/5, 12-190/5, 12-190/6, 12-192/2, 12-192/3, 12-192/7, 12-216/8, вказуе на те, що в цих генотипах наявшсть гена штересу не встановлено.
Значення температур пбридизацп рiзни-лися для рiзних праймерiв: 50 °С для вияв-лення гена внутршнього контролю (ген als) [14] та 55 °С - для праймерiв, якi дають змо-гу щентифшувати поcлiдовноcтi 35S промо-
1200 п.н.-1000 п.н.-
M
W
I
1132 п.н.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Рис. 2. 1дентиф1'кац1'я гена cp 4 epsps: M - маркер молекулярно!' маси (GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder); 1-3 - ДНК п'брида 12-189; 4-6 - ДНК п'брида 12-190; 7-11 - ДНК п'брида 12-192; 12-15 - ДНК п'брида 12-216; 16 - негативний контроль (ДНК нетрансформованого п'брида)
тору та гена Гнтересу (гена cp 4 epsps), тому для ГдентифГкацп гена ацетолактат синтази цукрових бурякгв ПЛР проводили, викорис-товуючи термоцикли з температурою гГбри-дизацГ' 55 °С. У результат! електрофорезу в агарозному гел1 були виявленГ ампл1кони розм1ром 840 п.н., що в1дпов1дають послГ-довност1 гена внутр1шнього контролю та збГ-гаються з фрагментами, як1 були отриманГ за допомогою амплГфГкацп з даними прай-мерами за температури ггбридизацГ' 50 °С (рис. 3).
800 п.н.
840 п.н.
М 1 2 3 4
Рис. 3. 1дентиф1*кац1*я гена als: М - маркер молекулярно! маси (GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder); 1 - ДНК п'брида 12-189/1 (температура п'бридизацП 50 °С); 2 - ДНК п'брида 12-189/1 (температура пбридизацИ" 55 °С); 3 - ДНК нетрансформованого п'брида (температура п'бридизацИ' 55 °С);
4 - негативний контроль вид1'лення ДНК
За результатами дослГджень отримано амплГ-кони оч1куваного розм1ру на треках, що вГд-повГдають зразкам, ампл1ф1кац1ю ДНК яких проводили за температури гГбридизацп 55 °С. У проведених моноплексних реакц1ях для ГдентифГкацп гена als п1двищення температури на 5 °С не вплинуло на можлив1сть ви-значення гена внутр1шнього контролю цукрових бурякгв, оск1льки розм1ри ампл1кон1в зб1гались за однакових 1нших параметр1в реакцп та концентрацГ' компонент1в. У раз1 застосування як матриц1 для амплГфГкацп ДНК нетрансформованого г1брида з температурою гГбридизацп праймер1в 55 °С були отриман1 ампл1кони розм1ром 840 п.н., що свГдчить про високу консервативнГсть цге! посл1довност1 та можлив1сть використання ii в мультиплексн1й реакцп. ВГдсутнГсть про-дукт1в реакцп на треку негативного контролю (№ 4) свщчить про достовГрнГсть отрима-них даних, в1дсутн1сть контам1нацГ1 при ви-д1ленн1 ДНК та чГткого дотримання процеду-ри приготування реакцГйно! сумГшГ та про-ведення реакцп амплГфГкацп.
АналГз даних, отриманих за результатами проведених ПЛР, дав можливГсть визначи-ти оптимальнГ параметри роботи розробле-
но'1 мультиплексно'1 тест-системи: крок 1 (початкова денатурацГя) 95 °С - 3 хв; крок 2 (напрацювання специфГчних продуктгв реакцп): денатурацГя 95 °С - 45 с; гГбридиза-цГя праймерГв 55 °С - 50 с; елонгацГя 72 °С - 1 хв; кглькгсть циклГв - 40; крок 3 (кГнце-ва елонгацГя) 72 °С - 6 хв.
ДГапазон робочих концентрацГй Mg2+ ста-новить 0,5-5,0 мМ, оскгльки пГдвищена кон-центрацГя, наприклад, 10 мМ, ГнгГбуе полГ-меразу на 40-50% [12]. ЗГ збГльшенням кон-центрацГ' Mg2+ пГдвищуеться температура денатурацГ' ДНК, збГльшуеться кглькгсть продуктгв амплГфГкацп, проте Гстотно зни-жуеться специфГчнГсть реакцп, що призво-дить до утворення безлГчГ неспецифГчних продуктгв амплГфГкацп. Таким чином, опти-мальну концентрацГю ГонГв Mg2+ добирали експериментально, враховуючи особливостГ послГдовностей матриц! та праймерГв, дГапа-зон концентрацГй становив 1,5-2,5 мМ MgCl2.
ДГапазон концентрацГ' дНТФ для проведен-ня ПЛР становить вГд 50 до 500 мкМ. У дос-лГдженнях пГд час розроблення мультиплексно'1 системи для ГдентифГкацп трансгенних цукрових бурякгв концентрацГя дНТФ стано-вила 200 мкМ. Тако'1 кГлькостГ достатньо для амплГфГкацп одночасно трьох фрагментГв ДНК з високою точнГстю синтезу. ЗГ збГльшенням кГлькостГ дНТФ у дослГдженнях спостерГ-галась наявнГсть неспецифГчних фрагментГв амплГфГкацп. Тому в процесГ проведення мультиплексно'1 реакцГ1 для ГдентифГкацГ1 цГ-льових послГдовностей з метою визначення трансгенних рослин цукрових бурякгв пГдви-щувати концентрацГю дНТФ е недоцГльним.
Оскгльки для ГдентифГкацп цГльових послГдовностей у процесГ проведення моноплексних реакцГй концентрацГ' праймерГв, дНТФ та ГонГв Mg2+ були рГзними, то для проведення мультиплексно'1 реакцГ1 в процесГ роботи були пГдГбранГ оптимальнГ концентрацГ'1 компонентГв для виявлення трансгенних цукрових бурякГв, толерантних до глГфоса-ту (табл. 2). Об'ем реакцГйно'1 сумГшГ становив 20 мкл.
Наступним етапом у дослГдженнях було визначення оптимально'' кГлькостГ матриц! ДНК для ефективно'' оцГнки трансгенних рослин цукрових бурякГв за наявнГстю спе-цифГчних послГдовностей. Для проведення мультиплексно' реакцГ' використовували сумарну ДНК, отриману з трансгенно' рос-лини цукрових бурякГв з рГзною концентра-цГею. Препарати ДНК тестували пГсля серп послГдовних розведень: 50 нг, 100 нг, 150 нг, 200 нг. ПГсля проходження ПЛР проводили електрофорез в 1% агарозному гелГ (рис. 4).
Таблиця 2
Склад реакфйно! cyMi'rni ПЛР мультиплексно! ампл1*ф1*кац1*йно1 системи
Цпльовп Праймери Концентрац'я компонента реакц'йно'! сумиш!
посл1довносп позначення концентрац'я, мкМ дНТФ, мкМ сольовий буфер* MgCL2, мМ Тэя-пол1'мераза
35S промотор 35S-1 35S-2 0,5 0,5
Ген cp 4 epsps pr1 pr2 1 1 200 1 Х 2 1 од.
Ген als bvprl bvpr2 0,2 0,2
* Сольовий буфер мае такий склад та к'нцеву концентрацию компонент'в: (10 мМ Tris-HCL, pH 9,0; 50 мМ KCL; 0,01% Тритон Х-100).
Рис. 4. Електрофореграма мультиплексно! ПЛР з визначення гетв cp 4 epsps, als та 35S промотора. M - маркер молекулярнот маси (GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder); 1-4 - ДНК пбрида 12-189/1 (розведення 50 нг; 100 нг; 150 нг; 200 нг вщпов^но); 5-7 - ДНК пбрида 12-189/1 (моноплекси); 8 - негативний контроль
(ДНК нетрансформованого пбрида)
За використання в мультиплексних реакц!-ях р!зно! к1лькост1 матриц! ДНК на електро-фореграм1 зазначено р1зну !нтенсивн!сть сиг-нал1в ампл1кон1в ДНК на треках, як1 в!дпо-в!дають досл!джуваним зразкам. Це св!дчить про р1зну к1льк1сть отриманих продукт1в амп-л!ф!кац!!. При застосуванн! в ПЛР 50 нг ДНК в!дбувалось напрацювання невелико!' к!лькос-т1 продукт1в реакц!!, про що св1дчить менш 1нтенсивний сигнал на треку, що в1дпов1дае цьому зразку. П1сля зб1льшення к1лькост1 матриц! до 100 нг та 150 нг було отримано дос-татню к!льк!сть продукт!в ампл!ф!кац!!, що дае можлив!сть встановити наявн!сть ц!льо-вих посл!довностей в цих зразках. На треку, який в!дпов!дае зразку, в якому було вико-ристано 200 нг досл!джувано! ДНК, заф!ксо-вано наявн!сть невелико!' к!лькост! неспеци-ф!чних продукт!в ампл!ф!кац!! розм!рами в!д 200 до 800 п.н. та значне перевантаження ну-кле!новими кислотами. Отже, для !дентиф!-кац!! елемент!в трансгенно! конструкц!! в рос-линах цукрових буряк!в за використання роз-
робленого мультиплексного п!дходу доц!льно застосовувати 100-150 нг сумарно! ДНК на одну реакц!ю. Прийнятним також е ! 50 нг, проте !снуе ймов!рн!сть отримання хибно не-гативних результат!в внасл!док невелико! к!лькост! матриц! для ампл!ф!кац!!.
Висновки
Таким чином, розроблена мультиплексна пол!меразна ланцюгова реакц!я !з системою праймер!в, гомолог!чних до посл!довностей 35S промотора, гена cp 4 epsps та гена внут-р!шнього контролю цукрових буряк!в (als), дае змогу м!н!м!зувати к!льк!сть реактив!в та рослинного матер!алу для проведення ана-л!зу, а також зменшити час для досл!джень велико! к!лькост! зразк!в. Для проведення мультиплексно! ПЛР з визначення толерант-них до д!! гл!фосату цукрових буряк!в реак-ц!йна сум!ш мае м!стити (к!нцев! концентра-ц!!): праймери до 35S промотору - по 0,5 мкМ, праймери до гена cp 4 epsps - по 1 мкМ; до гена als - по 0,2 мкМ; дНТФ - 200 мкМ;
1хсольовий буфер; 2 мМ Mgd2; 1 од. Taq-полГмераза, а також такГ значення темпера-турних режимГв: крок 1 (початкова денату-ращя) 95 °С - 3 хв; крок 2 (напрацювання специфГчних продукта реакцп): денатурацГя 95 °С - 45 с; гГбридизацГя праймерГв 55 °С -50 с; елонгацГя 72 °С - 1 хв; кГлькГсть циклГв - 40; крок 3 (кГнцева елонгацГя) 72 °С - 6 хв.
Розроблений пГдхГд до ГдентифГкацГ' еле-менпв трансгенно! конструкци, штегращя яко! в геном цукрових бурякГв забезнечуе голерангнiсгь до ди глГфосату, дасть можливГсть проводити шдивГдуальну оцшку се-лекцГйного матерГалу цукрових бурякГв з метою отримання ибридГв зГ стаб1льним рГв-нем експресГ' трансгена.
Використана литература
1. Романко С. М. Актуальн питання забезпечення еколопчноТ безпеки с'льськогосподарськоТ продукцИ та реалп'зацп'Т за-конодавства про оргатчне виробництво / С. М. Романко // Оргат'чне виробництво i продовольча безпека : [матер. III Мп'жнар. наук.-практ. конф., 23 квп'тня 2015 р., Житомир]. -Житомир : Полкся, 2015. - С. 186-194.
2. Чирва I. В. Буряювництво в економп'цп' с'льськогосподар-ських тдприсмств / I. В. Чирва // Вкник ПолтавськоТ дер-жавноТ аграрноТ академл. - 2015. - № 3. - С. 186-190.
3. Разработка ДНК-технологий для селекции сахарной свёклы (Beta vulgaris L.) / Т. П. Федулова, Н. Н. Богачева, А. С. Хуссейн, А. А. Налбандян // Клеточная биология и биотехнология растений : Междунар. науч.-практ. конф. : тезисы докладов (г. Минск, 13-15 февраля 2013 г.). - Минск : Изд. центр БГУ, 2013. - C. 239.
4. Левенко Б. Трансгент культури у свт та УкраТн / Б. Левенко // Вкн. НАН УкраТни. - 2011. - № 9. - С. 31-41.
5. Creation of transgenic sugar beet lines expressing insect pest resistance genes crylC and cry2A / D. I. Lytvyn, V. V. Syvura, V. V. Kurylo [et al.] // Cytol Genet. - 2014. - Vol. 48, Iss. 2. -P. 69-75. doi: 10.3103/S0095452714020078
6. Кищенко E. Н. Получение трансгенных растений сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) с помощью Agrobacterium rhizogenes / E. Н. Кищенко, И. К. Комарницкий, Н. В. Кучук // Цитология и генетика. - 2005. - Т. 39, № 1. - С. 9-13.
7. Богомолова Н. М. Разработка метода получения трансгенных растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам : авто-реф. дис. ... канд. биол. наук : спец. 06.01.05 «Селекция и семеноводство» / Богомолова Наталья Михайловна ; Всерос. НИИ сахарной свеклы и сахара им. А. Л. Мазлумова. - Ра-монь, 2002. - 20 с.
8. DNA cloning. Vol. III : A practical approach / D. M. Glover (ed). - Oxford, Washington DC : IRL Press Ltd., 1987. - 254 p.
9. Епринцев А. П. Идентификация и исследование экспрессии генов / А. П. Епринцев, В. Н. Попов, Д. Н. Федорин. - Воронеж : ИПЦ ВГУ, 2008. - 63 с.
10. Количественный анализ экспрессии генов / Е. В. Ермилова, Ж. М. Залуцкая, Т. В. Лапина, Т. В. Матвеева. - СПб. : ТЕССА, 2010. - 410 с.
11. Genetically Modified Food and Feed: Authorization in the EU. GMO Compass / GMO Database [Електронний ресурс]. - Режим доступу: http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/
12. Визначення молекулярно-генетичного пол1'морф1'зму роду Beta L. за допомогою пол1'меразноТ ланцюговоТ реакцА' : метод. рекоменд. / М. В. РоТк, Ю. М. Сиволап, Г. П. Петюх [та 1'н.]. - К. : Пол1'графКонсалтинг, 2007. - 27 с.
13. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Електрофорез и ультрацентрифугирование / Л. А. Остерман. - М. : Наука, 1981. - 288 с.
14. Присяжнюк Л. М. Особливосп прояву та способи оц'нки генетичних конструкц'й в трансгенних рослинах цукрових буряк'в : автореф. дис. ... канд. с.-г. наук : спец. 06.05.01 «Селекц'я i наст'нництво» / Присяжнюк Лариса Михайл1'вна ; 1н-т бкенергетичних культур i цукрових бурям'в НААН. - К., 2015. - 26 с.
15. Акинина Г. Е. Генетическая чистота семян - актуальный вопрос современной генетики и селекции растений / Г. Е. Аки-нина, Ю. Н. Тереняк, Я. Ю. Шарыпина, В. Н. Попов // Фак-тори експериментальноТ еволюцп'Т оргат'зм1'в : зб. наук. пр. - К. : Логос, 2016. - Т. 18. - С. 56-60.
16. Маренкова Т. В. Изучение стабильности экспрессии чужеродных генов у трансгенных растений табака (Nicotiniana tabacum L.) : автореф. дис. ... канд. биол. наук : спец. 03.00.15 «Генетика» / Маренкова Татьяна Владиславовна ; Ин-т цитологии и генетики СО РАН. - Новосибирск, 2005. - 16 с.
17. A novel universal primer-multiplex-PCR method with sequencing gel electrophoresis analysis / W. Xu, Z. Zhai, K. Huang [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, Iss. 1. - e22900. doi: 10.1371/journal.pone.0022900
18. Супрун И. И. Разработка мультиплексной ДНК-маркерной системы идентификации генов устойчивости риса к пири-куляриозу pi-40 и pi-b [Електронний ресурс] / И. И. Супрун, В. С. Ковалев, В. Н. Шиловский // Научный журнал Куб-ГАУ. - 2013. - № 94. - Режим доступу : http://ej.kubagro. ru/2013/10/pdf/19.pdf
19. Мультиплексная полимеразная цепная реакция для геноти-пирования экотипов Arabidopsis thaliana с помощью SSLP-маркеров / О. В. Зимина, Е. С. Сытник, М. Ф. Парий, Е. Г. Ал-химова // Biotechnologia acta. - 2014. - Т. 7, № 4. - С. 80-84. doi: 10.15407/biotech7.04.080
20. Sint D. Advances in multiplex PCR: balancing primer efficiencies and improving detection success / D. Sint, L. Raso, M. Traugott // Methods Ecol Evol. - 2012. - Vol. 3, Iss. 5. - P. 898-905. doi: 10.1111/j.2041-210X.2012.00215.x
References
1. Romanko, S. M. (2015). Current issues of environmental safety of agricultural products and implementation of the organic farming legislation. In Orhanichne vyrobnytstvo i prodovolcha bezpeka: materialy III Mizhnarodnoi naukovo-praktychnoi konferentsii [Organic production and food security: Collection of materials of III Int. Sci. Conf.] (pp. 186-194). April 23, 2015, Zhytomyr, Ukraine. [in Ukrainian]
2. Chyrva, I. V. (2015). Beet growing in farm economy. Visnyk Poltavskoi derzhavnoi ahrarnoi akademii [Bulletin of Poltava State Agrarian Academy], 3, 186-190. [in Ukrainian]
3. Fedulova, T. P., Bogacheva, N. N., Khusseyn, A. S., & Nalbandyan, A. A. (2013). The development of DNA-technologies for sugar beet (Beta vulgaris L.) breeding. In Kletochnaya biologiya i biotekhnologiya rasteniy: Mezhdunarodnaya nauchno-prakti-cheskaya konferentsiya: tezisy dokladov [Plant Cell Biology and Biotechnology: Int. Sci. Conf.: Abstracts of Papers] (p. 239). Feb 13-15, 2013, Minsk, Belarus [in Russian].
4. Levenko, B. (2011). Transgenic crops in the world and Ukraine. Visn. Nac. Akad. Nauk Ukr. [Herald of National Academy of Sciences of Ukraine], 9, 31-41. [in Ukrainian]
5. Lytvyn, D. I., Syvura, V. V., Kurylo, V. V., Olenieva, V. D., Yemets, A. I., & Blume, Ya. B. (2014). Creation of transgenic sugar beet lines expressing insect pest resistance genes crylC and cry2A. Cytol Genet., 48(2), 69-75. doi: 10.3103/S0095452714020078
6. Kishchenko, E. N., Komarnitskii, I. K., & Kuchuk, N. V. (2005). Production of transgenic sugar beet plants (Beta vulgaris L.) using Agrobacterium rhizogenes. Tsitol Genet. [Cytol. Genet.], 39(1), 9-13. [in Russian]
7. Bogomolova, N. M. (2002). Razrabotka metoda polucheniya trans-gennykh rasteniy sakharnoy svekly, ustoychivykh k gerbitsidam [Development of a method for producing transgenic sugar beet
plants resistant to herbicides] (Extended Abstract of Cand. Biol. Sci. Diss.). All-Russian Research Institute of Sugar Beet named after A. L. Mazlumov, Ramon, Russia. [in Russian]
8. Glover, D. M. (Ed.). (1987). DNA cloning. Vol. III: A practical approach. Oxford, Washington DC: IRL Press Ltd.
9. Eprintsev, A. P., Popov, V. N., & Fedorin, D. N. (2008). Identifikatsiya i issledovanie ekspressiigenov [Identification and research of gene expression]. Voronezh: IPTs VGU. [in Russian]
10. Ermilova, E. V., Zalutskaya, Zh. M., Lapina, T. V., & Matveeva, T. V. (2010). Kolichestvennyy analiz ekspressii genov [Quantitative analysis of gene expression]. St. Petersburg: TESSA. [in Russian]
11. Genetically Modified Food and Feed: Authorization in the EU. GMO Compass / GMO Database. Retrieved from http://www. gmo-compass.org/eng/gmo/db/
12. Roik, M. V., Syvolap, Yu. M., Petiukh, H. P., Shaiuk, L. V., Babiazh, A. I., & Bilous, N. V. (2007). Vyznachennia molekuliarno-henetychnoho polimorfizmu rodu Beta L. za dopomohoiu polimeraznoi lantsiuhovoi reaktsii [Research of molecular-genetic polymorphism of the genus Beta L. with PCR-analysis]. Kyiv: PolihrafKonsaltynh. [in Ukrainian]
13. Osterman, L. A. (1981). Metody issledovaniya belkov i nukleinovykh kislot. Elektroforez i ultratsentrifugirovanie [Methods of research of proteins and nucleic acids. Electrophoresis and ultracentrifugation]. Moscow: Nauka. [in Russian]
14. Prysiazhniuk, L. M. (2015). Osoblyvosti proiavu ta sposoby otsinky henetychnykh konstruktsii v transhennykh roslynakh tsukrovykh buriakiv [Peculiarities of expression and evaluation methods of genetic constructs in transgenic sugar beet plants]
(Cand. Agric. Sci. Diss.). Institute of bioenergy crops and sugar beet of NAAS, Kyiv, Ukraine. [in Ukrainian]
15. Akinina, G. E., Tereniak, Yu. N., Sharypina, Ya. Yu., & Popov, V. N. (2016). Genetic purity of seeds - topical question of modern genetics and plant breeding. Fakt. eksp. evol. org. [Factors of experimental evolution of organisms], 18, 56-60. [in Russian]
16. Marenkova, T. V. (2005). Izuchenie stabilnosti ekspressii chuzherodnykh genov u transgennykh rasteniy tabaka (Nicotiniana tabacum L.) [Study of the stability of foreign gene expression in transgenic tobacco plants] (Extended Abstract of Cand. Biol. Sci. Diss.). Institute of Cytology and Genetics, Novosibirsk, Russia. [in Russian]
17. Xu, W., Zhai, Z., Huang, K., Zhang, N., Yuan, Y., Shang, Y., & Luo, Y. (2012). A novel universal primer-multiplex-PCR method with sequencing gel electrophoresis analysis. PLoS One, 7(1), e22900. doi: 10.1371/journal.pone.0022900
18. Suprun, I. I. Kovalev, V. S., & Shilovskiy, V. N. (2013). Development of Multiplex DNA-marker set for identification of rice blast resistance genes Pi-40 and Pi-b. Naucnyj zurnal Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Scientific Journal of KubSAU], 94. Retrieved from http://ej.kubagro. ru/2013/10/pdf/19.pdf [in Russian]
19. Zimina, O. V., Sytnik, E. S., Pariy, M. F., & Alkhimova, E. G. (2014). Multiplex polymerase chain reaction for genotyping of Arabidopsis thaliana ecotypes using SSLR markers. Biotechnologia acta, 7(4), 80-84. doi: 10.15407/ biotech7.04.080 [in Russian]
20. Sint, D., Raso, L., & Traugott, M. (2012). Advances in multiplex PCR: balancing primer efficiencies and improving detection success. Methods Ecol Evol., 3(5), 898-905. doi: 10.1111/j.2041-210X.2012.00215.x
УДК 633.63/577.213.3
Присяжнюк Л. M., Шитикова Ю. В., Волчков А. А. Создание мультиплексной системы ПЦР для идентификации сахарной свеклы, толерантной к воздействию глифосата // Сортовивчення та охорона прав на сорти рослин. - 2016. - № 4. - С. 63-70. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).2016.88686
Украинский институт экспертизы сортов растений, ул. Генерала Родимцева, 15, г. Киев, 03041, Украина, * e-mail: prysiazhniuk_l@ukr.net Цель. Создать мультиплексную систему для иденти- промотор и ген cp 4 epsps. Установлено, что при подборе
фикации толерантной к глифосату сахарной свеклы с помощью ПЦР. Методы. Молекулярно-генетические методы анализа нуклеиновых кислот. Результаты. Приведены результаты исследований по определению параметров полимеразной цепной реакции (ПЦР) для разработки мультиплексной системы по идентификации структурных элементов трансгенной конструкции с геном cp 4 epsps, что обеспечивает толерантность к глифосату. Для получения ампликонов целевых последовательностей ДНК определены следующие значения температурных режимов ПЦР: шаг 1 (начальная денатурация) 95 °С - 3 мин; шаг 2 (наработка специфических продуктов реакции): денатурация 95 °С - 45 с; гибридизация праймеров 55 °С - 50 с; элонгация 72 °С - 1 мин; количество циклов - 40; шаг 3 (конечная элонгация) 72 °С - 6 мин. Проведена серия ПЦР с целью подбора оптимального количества матрицы ДНК для эффективной оценки трансгенных растений сахарной свеклы по наличию специфических последовательностей. Выводы. Для идентификации трансгенной сахарной свеклы, толерантной к воздействию глифосата, целесообразно определять в отдельных генотипах 35S
температурных параметров мультиплексном реакции на идентификацию гена als не влияло увеличение температуры гибридизации праймеров на 5 °С, что позволило включить специфические праймеры для определения этой последовательности в качестве внутреннего контроля. По результатам пробных мультиплексных реакций определены концентрации дНТФ (дезоксинуклеотидтри-фосфатов) и ионов Mg2+, которые позволили исключить возможность получения неспецифических фрагментов и ложноотрицательных результатов. Определено оптимальное количество матрицы ДНК (100-150 нг) для эффективной оценки трансгенных растений сахарной свеклы по наличию специфических последовательностей. Полученные результаты позволили разработать мультиплексную тест-систему для идентификации трансгенной сахарной свеклы, толерантной к воздействию глифосата, с помощью которой можно одновременно определить 35S промотор, ген cp 4 epsps и ген als в качестве внутреннего контроля реакции.
Ключевые слова: ген cp 4 epsps, 35S промотор, трансгенная сахарная свекла, параметры амплификации.
UDC 633.63/577.213.3
Prysiazhniuk, L. M.*, Shytikova, Yu. V., & Volchkov, O. O. (2016). Development of multiplex PCR system for identification of glyphosate-tolerant sugar beet. Sortovivcenna ohor. prav sorti roslin [Plant Varieties Studying and Protection], 4, 63-70. http://dx.doi.org/10.21498/2518-1017.4(33).2016.88686
Ukrainian Institute for Plant Variety Examination, 15 Henera Rodymtseva Str., Kyiv, 03041, Ukraine, *e-mail: prysiazhniuk_l@ukr.net Purpose. To create a multiplex system for identification individual genotypes. It was found that during the selection
glyphosate-tolerant sugar beet by using PCR. Methods. Molecular genetic analysis. Results. The article presents the results of studies to determine the parameters of the polymerase chain reaction (PCR) in order to develop a multiplex system for identification of the structural elements of the design of transgenic gene cp 4 epsps, which provides tolerance to glyphosate. For amplicon target DNA sequences, the following values of temperature conditions of PCR were determined: step 1 (initial denaturation) 95 °C - 3 min; step 2 (specific reaction products accumulation): denaturation 95 °C - 45 s; hybridization of primers 55 °C - 50 s; elongation 72 °C - 1 min; number of cycles - 40; step 3 (final elongation) 72 °C - 6 min. A series of PCR were carried out for the purpose of selecting the optimal amount of DNA matrix for efficient estimate of transgenic sugar beet plants for the presence of specific sequences. Conclusions. To identify transgenic glyphosate-tolerant sugar beet, it is advisable to determine 35S promoter and gene cp 4 epsps in
of temperature parameters of multiplex reaction a 5 °C rise in primer hybridization temperature did not affect the identification of gene als that allowed to include specific primers for determination of this sequence as an internal control. Based on the results of test multiplex reactions, concentrations of dNTPs and Mg2+ ions were determined that allowed to exclude the possibility of non-specific fragments and false-negative results. The optimum amount of matrix DNA (100-150 ng) for an efficient estimate of transgenic sugar beet plants for the presence of specific sequences was determined. Obtained results allowed to develop a multiplex test system for identification of transgenic glyphosate-to-lerant sugar beet which can be used for simultaneous determination of the 35S promoter, cp 4 epsps gene and als gene as an internal reaction control.
Keywords: gene cp 4 epsps, 35S promoter, the transgenic sugar beet, amplification parameters.
HadiuuiAa 19.10.2016
