CC BY
65
УДК 619:616.98.578.828.11
1щенко л.М., науковий ствроб1тник © E-mail: ischenko_lm@ukr.net Спиридонов в.г., д.с-г.н., завщувач вщдшу молекулярно-д1агностичних
дослщжень УЛЯБП АПК, 1щенко в.д., к. вет. н., доцент, Мельничук с.д., д.б.н., член-кор. НААН Украши Нацюналънийутверситет ôiopecypcie i природокористування Украти, м. Кигв
вал1дац1я плр-методики для д1агностики лейкозу
велико! рогато! худоби
Проведено вал1дащю розробленого eapianmy ПЛР для iдентиф1кацИ'в1русу лейкозу ВРХ. Дослгджено ефективтстъ та лтттстъ ампл1фЫацИ, специф1чтстъ, межу выявления (чутливктъ) та точтстъ методу. Чутливктъ анал1зу становитъ 86 геномных екв1валент1в для пров1русулейкозу та 3 геномт екв1валенти для внутршнъого контролю. Отримано чгтку пряму залежтстъ експерименталъних значенъ Ct npoeipycy лейкозу та внутршнъого контролю eid логарифму початковог концентрацИ' субстрату (R2 > 0,98). Отримат значения нахилу кал1брувалъних графШв (-3,27 —3,47) свгдчатъ про задовыъну ефективтстъ ампл1ф1кацп як для щлъовог послгдовностг, так i для внутршнъого контролю. Специф1чтстъ методики було тдтверджено шляхом сиквенування продуютв ампл1ф1кацп та пор1вняння отриманих нуклеотидних посл1довностей гз базою даних NCBI (National Center for Biotechnology Information). Резулътати пошуку св1дчили про 99 % i быъшу idenmu4Hicmb отриманих даних 1з нуклеотидною посл1довтстю характерною для дыянки в1русного глтопротегду gp51. Хибно-негативт резулътати (15 %) було отримано на меж1 чутливост1 методики (на piem 10 геномних екв1валент1в npoeipycHOï ДНК). В межах робочого д1апазону хибно-негативних i хибно-позитивних резулътат1в не в1дм1чалосъ, що св1дчитъ про високу точтстъ анал1зу.
Ключов{ слова: вал1дац1я, лейкоз ВРХ, ефективтстъ ампл1фжацп, чутливктъметоду, специф1чтстъметоду, точмстъметоду.
УДК 619:616.98.578.828.11
Ищеико Л.М., научный сотрудник (E-mail: ischenko_lm@ukr.net), Спиридонов в.г., д-р с-х наук, заведующий отделом молекулярно-диагностических исследований УЛЯБП АПК, Ищенко в.д., канд. вет. наук, доцент, Мельничук С.д., д-р биол. наук, член-кор. НААН Украины НУБиП Украины, Киев
валидация пцр-методики для диагностики лейкоза крупного рогатого скота
Проведена валидация разработанного варианта ПЦР для идентификации вируса лейкоза КРС. Изучены эффективность и линейность амплификации,
© 1щенко Л.М., Спиридонов В.Г., 1щенко В.Д., Мельничук С.Д., 2014
95
специфичность, чувствительность и точность метода. Чувствительность анализа равна 86 геномных эквивалентов для провируса лейкоза и 3 геномных эквивалента для внутреннего контроля. Показана прямая зависимость экспериментальных значений порогового цикла Ct провируса лейкоза и внутреннего контроля от логарифма начальной концентрации субстрата (R2 > 0,98). Полученные значения уклона калибровочных графиков (-3,27 - -3,47) свидетельствуют об удовлетворительной эффективности амплификации как для целевой последовательности, так и для внутреннего контроля. Специфичность методики была подтверждена путем сиквенирования продуктов амплификации и сравнения полученных нуклеотидных последовательностей с базой данных NCBI (National Center for Biotechnology Information). Результаты поиска свидетельствуют о 99 % и большей идентичности наших данных с нуклеотидной последовательностью характерной для участка вирусного гликопротеида gp51. Ложноотрицательные результаты (15%) были получены на границе чувствительности методики (10 геномных эквивалента провирусной ДНК). В пределах рабочего диапазона ложноположительных и ложноотрицательных результатов не наблюдалось, что свидетельствует о высокой точности предложенного анализа.
Ключевые слова: валидация, лейкоз КРС, эффективность амплификации, чувствительностьметода, специфичность метода, точность метода.
UDC 619:616.98.578.828.11
Ishchenko L.M., researcher (E-mail: ischenko_lm@ukr.net), Spyrydonov V.G., Dr. agricultural Sciences, Ishchenko V.D., PhD. vet. Science, Associate Professor, Melnychuk S.D., Dr. biol. Sciences
National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kiev
VALIDATION OF PCR METHODS FOR BOVINE LEUKEMIA DIAGNOSIS
Validation of developed PCR method for identification bovine leukemia virus has been conducted. There were investigated amplification efficiency and linearity, specificity, limit of detection and accuracy of the method. Limit of detection analysis is equal to 86 genomic equivalents for proviral DNA and 3 genomic equivalents for internal control. It was demonstrated direct correlation of experimental values of the proviral DNA threshold cycle Ct and internal control from the initial substrate concentration logarithm (R2 > 0,98). Obtained value slopes of calibration curves (-3,27 - 3,47) indicate high efficiency of amplification for target sequence as well as for internal control. A specificity of method was confirmed by sequencing of amplification products and comparing obtained nucleotide sequences with NCBI (National Center for Biotechnology Information) data base. Search results indicate 99 % and above identity of obtained data and nucleotide sequence, specific for viral glycoprotein gp51 area. False-negative results (15 %) were obtained at limit of detection method (10 genomic equivalents of proviral DNA). False-positive and false-negative results were not observed in operational range that can be indicated as high accuracy analysis.
96
Keywords: validation, bovine leukemia, amplification efficiency, limit of détection, specificity, accuracy
Одним i3 сучасних метод1в д1агностики шфекцшних захворювань, в тому числ1 i лейкозу ВРХ, е пол1меразна ланцюгова реакщя (ПЛР), перевагами яко! е пряме виявлення збудника, висока чутливкть та специф1чшсть методу, а також можливкть виявлеиня латентно! фор ми nepeôiry шфекцп [1]. Сьогодш накопичено достатньо експериментальних даних, яю свщчать про ефектившсть використання ПЛР в комплекс! i3 серолопчними методами (реакщя рад1ально1 ¿мунодифузп, ¿муноферментний анал1з) для оздоровления погол1в'я ВРХ вщ лейкозу [2-6]. Цей факт зумовив появу на ринку ветеринарних ¿мунобюлопчних засоб1в значно! кшькост1 д1агностичних набор1в для вдентифшацп Bipycy лейкозу за допомогою ПЛР. Однак, слщ пам'ятати, що згщно ISO 17025 впровадження в практику д1агностично1 лаборатори будь-якого анал1тичного методу повинно супроводжуватися його внутршньо-лабораторною валщащею (оцшка придатност1 методу) [7, 8]. Пщ валщащею розумшть комплекс дослщжень для будь-якого анал1тичного методу i3 визначенням певних параметр1в, як1 дозволяють ощнити наскшьки даний анал1тичний метод забезпечуе точшсть, правильшсть та вщтворювашсть отриманих результат в умовах конкретно! лаборатори. Необхщшсть валщаци анал1тичних методик не викликае сумшву, оскщьки дозволяе виявити yci фактори, що можуть вплинути на процес дослщження та призвести до отримання помилкових результата. Особливо важливою валщащя е в процеЫ розробки нових методик, коли вона е не метою, а засобом, який дозволяе своечасного виявити недолжи та усунути ïx [8-10].
Метою роботи було провести внутршньо-лабораторну валщащю розробленого нами д1агностичного набору для щентифжаци Bipycy лейкозу методом ПЛР в реальному 4aci.
Методи та матер1али. Оцшка придатност1 проводилась згщно до стандартно! схеми з використанням поЫбника CITAC/EURACHEM [9, 10]. Оскщьки, запропонована методика е якюною, тобто результат дослщження штерпретуеться в формат! так/ш, дослщжували параметри, яю рекомендуються для валщаци яюсних методик (ефектившсть та лшшшсть ампл1ф1каци, чутливють, специф1чшсть i точшсть методики).
Матер1алом дослщження були зразки кров1 ввдбраш у шфжованих BipycoM лейкозу тварин (за результатами дослщжень у ПЛР та Р1Д), а також плазмщш ДНК (одна з яких мютила фрагмент npoBipycHoi' ДНК Bipycy лейкозу, а друга - фрагмент нуклеотидно! послщовност1 гену, специф1чного для ВРХ).
Геномну ДНК i3 кров1 видшяли методом сорбци на оксид1 кремнш описаним R. Boom i3 сшвавторами [11]. Детекщю npoBipycHoi' ДНК Bipycy лейкозу ВРХ проводили згщно методичних рекомендацш [12].
Анал1з результата та статистичну обробку даних здшснювали за допомогою програмного забезпечення ABI Prism 7000 Vs. 1.2.3.
97
Результати дослщжень. Одним i3 основних параметр1в оцшки придатиоел ПЛР-методик е визначення ix чутливосл (limit of detection), який характеризуе найменшу кiлькicть чи концентращю цтьово! ДНК в зразку, що може бути виявлена, але не обов'язково кiлькicнo оцшена. Для визначення чутливоеп готували cepiro 5-кратних розведень ДНК, видтеио! i3 KpoBi iнфiкoвaниx тварин, з початковою концентращею 2,7x105 геномних eквiвaлeнтiв. Реакщю ампшфкацп кожного зразка проводили у 3-х повторах, з отриманням вщповщних значень Ct для дiлянки цтьово! послщовносл npoBipycy лейкозу та для дшянки гену cпeцифiчнoгo для ВРХ (рис. 1).
ампл1фтацй'цтьово1посл1довност1 npoeipycy лейкозу, Б - внутрШнъого контролю)
Для кожного повтору вираховували середне значения Ct та вщповщне значения стандартного вщхилеиня (SD) (табл. 1). За даними Ct визначали мшмальне розведення ДНК, що може бути виявлене i3 статистичною достов1ршстю. Bei зразки i3 значениям Ct < 40 вважали позитивиими.
Таблиця 1.
Статистичш даш результате ампл1фжацп cepi'i 5-кратних розведень ДНК
Дшяика цшьово! послщовиоеп npoßipycy Дшяика ЦШЬОВО! послщовносп
лейкозу внутр!шнього контролю
КШЬЮСТЬ Значения SD Кшьюсть Значения SD
котй порогового циклу, Ct котй порогового циклу, Ct
2,7х105 23,67 0,283 2,7х105 21,19 0,126
5,4х104 25,99 0,080 5,4х104 23,41 0,204
1,1х104 28,45 0,220 1,1 х 104 25,94 0,142
2,1х103 31,04 0,057 2,1х103 28,42 0,128
4,3х102 34,07 0,117 4,3х102 31,52 0,048
8,6х101 37,68 0,317 8,6х101 33,87 0,522
17 36,41 1,854 17 35,18 0,099
3 - - 3 35,75 0,085
Виходячи i3 предетавлених у табл. 1 результате дocлiджeння встановлено, що чyтливicть розроблеиого нами д1агностичного тесту для
98
щентифжацп в1русу лейкозу становить 86 геномних екв1валент1в для пров1русу лейкозу та 3 геномш екв1валенти для внутршнього контролю. Критичш значения порогового циклу О: (SD > 1) отримано на р1вш концентрацш 100-10х геномних екв1валента пров1русу лейкозу.
За отриманими кривими ампл1ф1каци (рис. 1) визначали також лшшшсть та ефектившсть ампл1ф1кацп як для цшьово! послщовност1, так \ для внутршнього контролю. Результати оцшювали за допомогою регресшного анал1зу та побудови кал1брувального графжу залежност1 значения порогового циклу (С:) вщ логарифму початково! концентрацп субстрату (рис. 2).
Рис. 2. Кашбрувальш графжи залежност1 порогового циклу (Ct) ввд log початково'1 кшькосл копш щльово*1 послвдовност1 ( внутр1шнього контролю (0)
Ефектившсть ампл1ф1каци визначали за значениям кута нахилу кал1брувального граф1ку (slope):
E=(10-1/slope -1) х 100.
У табл. 2 представлен! значения кута нахилу кал1брувальних графтв, ефектившсть ампл1ф1кацп та коефщент кореляци лшшно! perpecii (R2) для цшьово1 послщовност1 та внутршнього контролю на основ! трьох незалежних експеримент1в.
99
Таблиця 2
Ефектившсть та лшшшсть амншфжацн npoeipycy лейкозу ВРХ i
__внут|мшнього контролю__
n Кут нахилу кал1брувально1 криво! (slope) Ефектившсть ПЛР, Е (%) Лшшшсть, R2
л H m Д о и л о ¡U 4 нч о о с 1 -3,27 100,00 0,98
2 -3,48 93,60 0,99
3 -3,62 88,70 0,99
середне -3,46 94,10 0,99
Внутршнш коко коко 1 -3,31 100,00 0,97
2 -3,47 94,00 0,99
3 -3,63 88,30 0,99
середне -3,47 94,10 0,98
Слщ вщм!тити ч!тку пряму залежшсть експериментальних значень Ct npoeipycy лейкозу ВРХ та внутршнього контролю вщ логарифму початково! концентраци субстрату (R2 > 0,98). Отримаш значения нахилу кал1брувальних графшв (-3,27 - -3,47) свщчать про задовшьну ефектившсть ампл!фшацп даного методу (задовшьними значениями кута нахилу кал1брувального графжу для ПЛР е значения в межах вщ -3,1 до -3,6.
Не менше значения мае i специф1чшсть методик на ochobî ПЛР, а також вщсутшсть иерехресних чи несиециф1чних реакцш. На eTani конструювання ираймер1в i TaqMan-30HfliB для запропонованого д1агностичного тесту в якост1 мшеш, згщно рекомендацш МЕБ, було обрано висококонсервативну дщянку BipycHoro глжопротещу gp51. KpiM того специф1чшсть методики для щентифжаци Bipycy лейкозу була пщтверджена шляхом сиквенування продукта ампл1фшацп та пор1вняння отриманих нуклеотидних послщовностей i3 базою даних NCBI (National Center for Biotechnology Information) (у стата даш не наводяться). Результати пошуку свщчили про 99 % i бшьшу щентичшсть наших даних i3 нуклеотидною послщовшстю дшянки в1русного глкопротещу gp51.
Точн1сть (precision) яюсних методик виражають як коефщенти правильно! i хибно! позитивно! (та негативно!) реакци. TaKi кoeфiцieнти було визначено на граничному piBHi концентрацш та вище нього. Для цього використовували pi3Hi розведення позитивного зразку та 10 негативних 3pa3KiB.
100
В експериментах визначали частоту отримання хибно-позитивних та хибно- негативних результат:
% хибних позитивних = хибш позитивш х 100/сума вщомих негативних;
% хибних негативних = хибш негативш х 100/ сума вщомих позитивних.
Хибно-негативш результати (15 %) було отримано на меж1 LOD дано! методики (на piBHi 10 геномних екв1валент1в npoBipycHo! ДНК). В межах робочого д1апазону хибно-негативних результат не вщм1чалось. На Bcix р1внях концентрацш хибно-позитивних результат вщм1чено не було.
Висновок.
За результатами проведено! валщацп ПЛР-методики для щентифжацп Bipycy лейкозу ВРХ встановлено наступне: чутливють анал1зу для щентифжацп Bipycy лейкозу становить 86 геномних екв1валент1в для npoBipycy лейкозу та 3 геномш екв1валенти для внутршнього контролю; коефщент лшшно! perpecii кал1брувально! криво! отриманий при постановщ розведень ДНК позитивного зразку становить R2 > 0,98 як для Bipycy лейкозу ВРХ, так i для внутршнього контролю; отримаш значения нахилу кал1брувальних граф1к1в (-3,27 - -3,47) свщчать про задов1льну ефективн1сть ампл1ф1кац!!; хибно-негативних i хибно-позитивних результат1в в межах робочого д1апазону не вщм1чалось, що св1дчить про задов1льну точшсть анал1зу.
Л1тература
1. Антонов Б.И. Использование метода ПЦР при диагностике острых инфекционных болезней животных / Б.И. Антонов // Ветеринарный консультант. - 2002. - № 16-17. - С. 22.
2. Кузнецова Н.В. Использование полимеразной цепной реакции для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота / Н.В. Кузнецова, Н.В. Кузнецов, Г.А. Симонян // Ветеринария. - 1997. - №5. - С. 12-15.
3. Development of a polymerase chain reaction and its comparison with agar gel immunodiffusion test in the detection of bovine leukemia virus infection / Camargos M.F., Stancek D., Lessa L.M. [et al.] // Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. -2003. - V.40 (5). - P. 341-348.
4. Evennann J.F. A Look at How Bovine Leukemia Virus Infection is Diagnosed / Evennann J.F. // Vet. Med. Assoc. - 1992. - V.175. - P. 705-708.
5. Пор1вняльна ефектившсть д1агностики лейкозу велико! рогато! худоби при використанш р1зних метод1в дослщження / Абрамов А.В., Король Д.М., Мельничук С.Д. [та ш.] // Ветеринарна медицина Украши. - 2007. - №2. -С. 33-34.
6. Д1агностика лейкозу у тщьних кор!в i телят методом двостадшно! ПЛР в реальному 4aci /Л. 1щенко, В. Спиридонов, В. Бусол, [та ш.] // Тваринництво Украши. - 2011. - №6. - С. 22-25.
7. До питания валщацп зажиттевих метод1в д1агностики лейкозу велико! рогато! худоби / В.О. Бусол, С.Д. Мельничук, А.П. Блажко [та ¿н.] // Ветеринарна медицина 92. Мгжвщомчий тематичний науковий зб1рник. -Харк1в. - 2009. - С. 118 - 121.
101
8. International Standard (ISO) 17025. 2000. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. International Organization for Standardization, Genève, Swizerland.
9. ПоЫбник 3 питань якосп у сфер1 анал1тично1 xiMiï: Допомога при акредитаци (Guide to Quality in Analytical Chemistry: An Aid to Accreditation). -CITAC/Eurachem, 2002. - Режим доступу : URL : http://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/CITAC EURACHEM GUIDE. pdf
10. Вщповщшсть анал1тичних метод1в встановленш метк Поабник для лабораторш з валщаци метод1в та пов'язаиих питань (The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics). - Eurachem, 1998. - ISBN 0-948926-12-0 - Режим доступу : URL : http://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/valid.pdf.
11. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids / Boom R., Sol C., Salimans M. [et al.] // Journal of clinical microbiology. - 1990 (3). - V. 28. - P. 495-503.
12. Д1агностика лейкозу велико! рогато! худоби методом двостадшно! пол1меразно1 ланцюгово! реакци : методичш рекомендаци / [В.Г. Спиридонов, Л.М. 1щенко, Д.Ю. Рибальченко та îh.]. - К. : НУБШ Укра1ни, 2010. - 29 с.
Рецензент - д.вет.н., професор Гунчак В.М.
102
