CC BY
34
УДК 619.616.006.441.084
Зав1рюха Г.А., к.с.-г.н., завщувач вщдшу мжробюлоги, Полщук 1.В., Афанасьева К.В., Бурлакова Н.О., молодш1 науков1 ствроб1тники © ДНУ «Державный центр тновацтних бютехнологш», м. Кигв
ЗМ1НИ В ПОПУЛЯЦП РЕТРОВ1РУСУ ЛЕЙКОЗУ В КРОВ1 ХВОРИХ КОР1В П1СЛЯ 1МУН13АЦП ВАКЦИНОЮ «ЛЕЙКОЗАВ»
У статт1 представлет результаты вивчення вплыву поствакцыналъного Iмуштету на зм1ны в популяцп ретров1русу лейкозу велыког рогато! худобы в плазм1 кров1 Р1Д-позытывных тварын.
Ключое1 слова: велыкарогата худоба, лейкоз, шушзащя, вакцына.
Вступ. 3 вщкриттям в1русу лейкозу велико1 рогато! худоби, розпочався новий етап { напрямок активно! боротьби з щею небезпечною хворобою [1,2,3].
Розробка методики постановки реакци ¿мунодифузи з використанням стандартного стабшзованого лейкозного антигену дала можливкть впливати на переб1г активное^ лейкозного процесу в неблагополучному щодо лейкозу стад1, з вилученням тварин у раннш (продромальнш) стади захворювання.
1золящя шфжованих в1русом лейкозу велико! рогато! худоби тварин не могла забезпечити повного оздоровления, бо теля чергових серолопчних дослщжень у стад1 залишилися тварини, хвор1 в латентнш стади захворювання, та хвор1 тварини, оргашзм яких нездатний напрацьовувати специф1чш против1руст антитша. Оздоровления розтягувалось на десятки роюв. Видалення ¿з стада Р1Д-позитивних та 1ФА-позитивних кор1в не гарантуе повного оздоровления. 3 часом латентно хвор1 на лейкоз тварини «дозр1вають» { виявляються пщ час чергових серолопчних дослщжень. За час перебування хворих тварин у стад1 вони е джерелом шфекцп для пщростаючого молодняку та ще не вражених в1русом кор1в. Отже, вщсутшсть Р1Д-позитивних ВРХ у стад1 не гарантуе повного оздоровления вщ онкорнав1русно! шфекцп [4].
В боротьб1 з шфекцшними хворобами в!рус-бактер1ально! етюлогп науковцями розроблет специф1чш вакцини, яю захищають тварин вщ захворювань. До цього часу ефективна вакцина проти лейкозу велико! рогато! худоби ще не розроблена.
Нами запропонована шактивована вакцина «Лейкозав» проти лейкозу велико! рогато! худоби, на яку теля щеплення формуеться у чутливих до лейкозу тварин специф1чний против1русний ¿муттет ¿з титром антитш 2-4 lg2 за Р1Д [5, 6].
Як показали наш1 дослщження, против1русний ¿муштет з такою напругою захищае тварин вщ спонтанного заражения та позитивно впливае на здоров'я окремих шфшованих в1русом тварин (Р1Д+) та вщновлення кшькост1 лейкоципв до ф1зюлопчно! норми [7, 8].
© Зав1рюха Г.А., Пол1щук 1.В., Афанасьева К.В., Бурлакова Н.О., 2013
92
Нижче ми наводимо результата вивчення впливу поствакцинального ¿муштету на змши кшькост! ретров1русу в плазм! кров1 Р1Д-позитивних тварин.
Матер1али i метод и. В дослвд було 150 Kopie молочного стада, яких дослщжували за Р1Д, 1ФА та ПЛР, використовуючи сучасне обладнання для лабораторних дослщжень.
Kopie молочного стада, неблагополучного по лейкозу ВРХ, ¿мушзували вакциною «Лейкозав» згщно вимог «Настанови по застосуванню вакцини «Лейкозав» велико! рогато! худоби», затверджено! Держдепартаментом ветеринарно! медицини 26.10.2000 р., №15-14/193. Коровам, сироватка кров! яких реагувала позитивно в РЩ, 1ФА та яю мали пщвищену кшькють лейкоциив у кров!, вводили вакцину пщшюрно, в дщянщ верхньо! третини ши!, дв!ч! з штервалом 21-30 дн!в по 2 см3 за одне введения (2+2 см3), дотримуючись правил асептики та антисептики. Груш Kopie, сироватка кров! яких реагувала позитивно пщ час дослщження за Р1Д та мала пщвищену к!льк!сть лейкоцит!в в кров!, вакцину вводили за такою ж схемою, але в доз! по 4 см3 (4+4 см3).
Контролем служили тварини, сироватка кров! яких не реагувала ¿з стандартним лейкозним антигеном (РЩ-негативш), показники к!лькост! лейкоциив у кров! були в межах ф!зюлопчно! норми, а також були в!дсутн! Koni! ДНК-npoBipycy лейкозу. Дослщження сироватки кров! за РЩ проводили згщно загальноприйнято! методики з застосуванням д!агностичного набору (Ha6ip компоненте р!дких стаб!л!зованих для серолог!чно! д!агностики лейкозу велико! рогато! худоби в реакцп ¿мунодифуз!! (Р1Д) (РП №3268-14-0526-04(08-01)), НДП «Ветеринарна медицина».
Матер!алом для к!льк!сного визначення ДНК-npoBipycy лейкозу були зразки кров!, як! були ввдбраш в!д Kopie у системи для в!дбору кров! з 3% розчином ЕТДА (VACUTEST®, 1тал!я) та надходили до лаборатор!! в день вщбору. Зразки були протестован! на наявшсть ДНК npoeipycy лейкозу з використанням комплекту реагент!в «ДНК-СОРБ-В» для екстракци ДНК i комплекту реагент!в для проведения ПЛР з детекщею продукт!в у режим! реального часу «Лейкоз», BapiaHT FRT ¿з використанням системи для детекци ПЛР - продукив у режим! «реального часу» IQ5 («Bio-Rad», США). 3 метою визначення в!русного навантаження було протестован! 150 зразюв кров! тварин.
Кшькюне визначення Bipycy лейкозу ВРХ у кров! проводили з використанням тест-системи «Лейкоз» для виявлення ДНК-npoBipycy лейкозу велико! рогато! худоби в бюлопчному MaTepiani методом ПЛР в режим! «реального часу» у BapiaHTi FRT, виробництва «ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзор», Роая. BapiaHT FRT використовуеться для виявлення ДНК-npoßipycy лейкозу велико! рогато! худоби у бюлопчному MaTepiani методом пол!меразно! ланцюгово! реакц!! з пбридизацшно-флуоресцентною детекц!ею в peжимi «реального часу» [9].
В основ! методу лежить aмплiфiкaцiя специф!чно! д!лянки ДНК-npoßipycy лейкозу велико! рогато! худоби (послщовноси, ¿нтегровано! в ДНК лейкоцит!в ВРХ) за рахунок багаторазового повторения ци^в денатурац!! ДНК
93
у дослщжуванш проб1, вщпалу специф1чних ол1гонуклеотидних затравок (праймер1в) I зонд1в, м1чених флуоресцентними барвниками I синтезу комплементарних ланцюпв ДНК за допомогою ферменту Тад-пол1мерази [10].
Для проведения анал1зу був використаний наб1р «Лейкоз», з уже вщомою концентращею ДНК у позитивному контрольному зразку (ПКО ДНК БЬУ) - 4,5Е+04 копш в мл (45000 копш в мл).
Отримаш даш у вигляд1 кривих накопичення флуоресцентного сигналу, анал1зувалися за допомогою програмного забезпечення системи для детекци ПЛР - продукт1в у режим! «реального часу» 1^5.
Для проведения кщькюного визначення було виготовлено серш 10-кратного розведення ПКО ДНК БЬУ. Стандартш зразки - це зразки з вщомою концентращею (табл. 1).
Таблиця 1
Концентращя розведення стандартних зразкзв ПКО ДНК BLV
№ п/п Стандарт Кшьюсть копш в мл
1 ПКО ДНК BLV/1 4,5E+04
2 ПКО ДНК BLV/2 4,5E+03
3 ПКО ДНК BLV/3 4,5E+02
4 ПКО ДНК BLV/4 4,5E+01
Стандартш зразки були використаш для побудови кал1брувально! криво! та в якост1 позитивних контрол1в. За отриманими графжами ампл1фшацп визначали середне значения Ct для кожного зразка та стандарту. Брали до уваги значения нахилу криво! ампл1ф1каци (slope), ефектившсть ампл1ф1кацп (Е) та коефщент кореляци лшшно! perpecii (R2) кал1брувальних графЫв з використанням стандарт1в ПКО ДНК BLV» [11].
Дослщження сироваток кров1 за 1ФА проводили на тест-систем1 ¿муноферментнш «DIA-BLV-Ab». Тест-система призначена для анал1зу сироваток кров! та молока, а також пул1в зразюв сироваток i пул1в зразюв молока велико1 рогато! худоби на наявн!сть антит!л до Bipycy лейкозу методом ¿муноферментного анал1зу. Результата анал1зу оцшювали за допомогою спектрофотометра (TECAN «Sunrise», Австр1я), при довжиш хвиль 450/620нм. 1нкубацш планшет проводили в термошейкер1 BioSAN «PST-60 HL-4».
Гематолопчш дослщження проводили на гематолопчному анал1затор1 «Animal blood counter, модель ABC VET//Horiba ABX, Франщя». Використовували реагенти, яю мштяться в ветпаке АБЦ ABX: ABX Minoton -вщ 100 мл; ABX Mynolyse - вщ 25 мл; ABX Cleaner - 40 мл; ABX Minoclair - 6 мл; при дослщженнях використовували контрольний зразок Para 12 Extend - 3060 мкл.
Результати дослщження. Шсля проведения серолопчних дослщжень було встановлено, що в результат! систематичних щор1чних дослщжень кшьккть реагуючих за Р1Д кор!в в кшщ року зменшувалась до десяти вщсотюв. Зокрема, за нашими даними пщдослщне стадо складалось з Р1Д-негативних тварин, а 10% становили корови, сироватка кров1 яких реагувала позитивно в Р1Д у нативному вигляд1 та в розведенш 1:2-1:4.
94
Для проведения дослщжень було сформовано три групи: дв1 пщдослщш та одна контрольна. Контрольнш груш тварин вводили пщшмрно ф1зюлопчний розчин в доз1 2+2см3 (табл. 2). Тваринам дослщно! групи, з яких у 50% виявлено копи ДНК пров1русу лейкозу, було введено вакцину «Лейкозав» в доз1 2+2см3 (табл. 3).
В дослщнш груш сироватка кров1 50% тварин не реагувала в Р1Д, але в кров1 виявлено вщ 9,8 тис. до 2,8 млн. копш ДНК-пров1русу лейкозу. Через 8 мкящв теля проведения ¿мушзацп вакциною «Лейкозав» у чотирьох кор1в кшьккть копш ДНК-пров1руса зменшилась в (до щеплення вакциною - 2,3 млн. копш ДНК-пров1руса, теля щеплення - 4,8 тис. копш ДНК пров1русу). В юнщ дослщу, через 12 мюящв, 60% кор1в ще! групи звшьнились вщ специф1чних пров1русних антитш I на основ! дослщжень за Р1Д вони були визнаш РЩ-негативними I вважались здоровими. Отримаш експериментальш даш евщчать про те, що вакцина «Лейкозав» впливае оздоровче на шфжовашеть кор1в в1русом лейкозу.
У третш груш (9 кор1в) сироватки кров! реагували позитивно в Р1Д у нативному вигляд! та в розведенш 1:2-1:4, а кшьюсть лейкоцшгв була в межах 15,5-24,9 Г/л. Корови ще! групи в доелда не приймали учасп, !х господарники здали на забш, виконуючи вимоги чинно! 1нструкцп. Наслщки перебування здорових тварин у неблагополучному щодо лейкозу ВРХ стад! подаш в таблиц! 2.
Таблиця 2
Результата дослщження кров1 ВРХ на лейкоз, контрольна група (п=4)
Результати дослщжень, дати
02. 2012 10.2012 2.2013
№ тварини в груш э о 'ёч о & с и К Ч '¡3 о и рц Ч С ПЛР, негативно/ позитивно 1ФА лейкоцита, Г/л 3 о 'ёч о & с и к ч '¡3 о и с^" Ч С ПЛР, негативно/ позитивно 1ФА лейкоцита, Г/л 3 о 'ёч о & с и К Ч '¡3 о и рц Ч С ПЛР, негативно/ позитивно 1ФА лейкоцита, Г/л
1 - - - + гемол1з - - - + гемол1з + 920000 + + 5,0
2 - - - + 16,6 - - - + 16,6 +; 1:2 5420000 + + 22,7
3 - - - - 11,0 - - - - 11,0 - 730 + - 13,7
4 - - - - гемол1з - гемол1з + 12700000 + - 26,6
%% - 50 - 50 75 100 50
позити-
вних
%% 100 100 50 100 50 25 50
негати-
вних
М±ш 6,9±2,3 - - 6,9±2,3 760182,5± 2312,6 10,4±5 ,8*
95
3 таблиц! 2 видно, що в контрольну групу були вдабрат корови, як1 за даними сучасних лабораторних дослщжень (Р1Д, 1ФА, ПЛР, гематолопчно) були здоровими. Ця група тварин була дослщжена 1 сформована теля проведения планових дослщжень на лейкоз з вилученням ¿з стада позитивно реагуючих тварин.
Пщ час перебування тварин контрольно! групи в неблагополучному щодо лейкозу стад1 впродовж восьми мкящв I дослщжених дв1ч1 за Р1Д, 1ФА, ПЛР та гематолопчно, у них не виявили ознак захворювання на лейкоз. Результата дослщжень за вказаними тестами були негативними.
Таблиця 3
Результата дослщження кров1 ВРХ на лейкоз, дослщна група, _щеплено вакциною «Лейкозав» (п=10)_
Результати дослщжень, дати
до щеплення шеля щеплення
02 2012 10.2012 2.2013
о
№ тварини в груш 3 'ёч о & с и к п '¡3 о и рц Ч С ПЛР, негативно/ позитивно 1ФА лейкоцита, Г/л э рц 'ёч о & с и К Ч '¡3 о и рц Ч С ПЛР, негативно/ позитив! 1ФА лейкоцита, Г/л э рц 'ёч о & с и К Ч '¡3 о и рц Ч С ПЛР, негативно/ позитивно 1ФА лейкоцита, Г/л
1 - 981248 + + 15,1 - 123 + - 9,2 - 2230 + - 8,9
2 - - - + гемо - 4020 + + 12,7 - 4660 + + 14,5
л1з
3 - - - - 14,9 + 10 + - 8,6 - 9410 + + 12,8
4 - 56935 + + 13,3 - 268000 + + 10,3 3004000 + - 14,9
5 - - - + 35,5 + 556000 + + 22,2 + 7060000 + + 32,1
6 - 991800 + - 10,1 - 128 + 10,0 - 23600 + - 12,5
7 - - - - 15,7 - 359000 + + 21,0 + 8250000 + + 21,0
8 - - - + 21,0 + 2410000 + + 18,9 + 4300000 + + 26,8
1:2
9 - 9603 + - 13,4 - 1100 + + 7,5 + 7400000 + - 13,1
10 - 281248 + - 15,3 - 207000 + + 15,8 - 6100000 + + 20,7
%% 50 50 30 100 20 40 100 60
негати-
вних
%% 100 50 50 70 80 60 40
позити-
вних
232083,4 13,9± 380538.1 13,62± 3615390± 17,73
M±m ±1258,7 3,4* ±246273, 8 1,8** 11476242 ±2,4* **
*P-0,05, ** P-0,01, =^^-0,001
Ознаки захворювання з'явились упродовж остантх чотирьох мкящв проведения дослщу. У трьох тварин контрольно! групи кшьюсть копш ДНК-пров1русу була в межах 920 тис. - 12 млн. \ лише в одше! корови в кров1
96
виявили всього 730 копш. Ц1 показники свщчать про те, що спонтанне заражения кор1в в неблагополучному стад! вщбуваеться через вгам мкящв з наростанням копш в1руса. Кшькють лейкоципв пщтримуеться оргатзмом в межах верхньо! границ! показниюв норми. Кшькють лейкоциив починае збшьшуватись коли кшькють в1руса сягае 5-122 млн. копш ДНК-пров1русу лейкозу. Паралельно з показниками збшьшення кшькост! копш ДНК-пров1русу збшьшуеться кшькють лейкоциив (22,7-26,6 Г/л).
Отже, з отриманих даних можна зробити висновок, що перебування здорових тварин у неблагополучному щодо лейкозу стад! впродовж 12 мкящв зумовлюе спонтанне заражения в1русом лейкозу. Тварини стають хворими за вама показниками лабораторних дослщжень щодо лейкозу. Варто звернути увагу на результата дослщжень за ПЛР кров! у корови № 3 з контрольно! групи. У ц!е! тварини виявлено всього 730 коп!й ДНК- пров!русу. Це означав, що ця тварина заразилась недавно ! в!рус не встиг напрацювати висок! показники кшькост! коп!й. Результати досл!джень ¿з використанням шших лабораторних досл!джень були негативними. Отже, вилучення ¿з неблагополучного стада РЩ-позитивних тварин не гарантуе його оздоровления в!д в!руса лейкозу.
Корови 2 групи (10 гол!в) були щеплен! проф!лактичною дозою вакцини (2+2см3) (табл.3).
3 таблиц! 3 видно, що за даними лабораторних дослщжень, проведених перед щепленням, ус! тварини були Р1Д-негативними, але в кров! окремих кор!в кшьккть в!руса була в межах вщ 9603 до 981248 коп!й ДНК-пров!русу.
Через в!с!м м!сяц!в п!сля щеплення вакциною у чотирьох кор!в кшьккть коп!й в!русу зменшилась у 4 рази, в окремих тварин кшьккть копш ДНК-пров!русу зменшилась у 8-10 раз!в. П!д к!нець дослщу 60% тварин ц!е! групи були здоровими за показниками серолог!чних дослщжень.
Висновки. 1. Видалення ¿з стада РЩ-позитивних кор!в, хворих у продромальнш стад!! лейкозу, лише стримуе актившсть розвитку ¿нфекц!йного процесу лейкозу серед чутливих тварин ! не сприяе оздоровлению стада у ц!лому. 2. Шсля видалення ¿з стада РЩ-позитивних тварин, джерелом в!русу лейкозу залишаються в стад! тварини (10-20% загально! к!лькост! тварин в стад!) хвор! у латентнш стад!! переб!гу лейкозу, як! не виявляються за Р1Д, 1ФА.
3. П!д час перебування здорових тварин серед тварин неблагополучного щодо лейкозу стада впродовж 8-12 мюящв проходить спонтанне заражения в!русом.
4. Поствакцинальний ¿муштет, сформований теля щеплення вакциною «Лейкозав», активно впливае на зменшення (у 4 рази) кшькост! копш ДНК-пров!русу в плазм! кров!.
Л1тература
1. Мандигра М.С. Лейкоз велико! рогато! худоби: розробка та впровадження широкомасштабних протилейкозних заход!в у господарствах Льв!всько! облает!. - М.С. Мандигра. - .Льв!в - Р!вне, 1999.- 34с.
2. Нагаева Л. I. Д!агностика та профшактика лейкозу велико! рогато! худоби/ Л. I. Нагаева, С. В. Аранчш //Б!блютека ветер. мед. - К., 2003. - 65 с.
97
3. 1нструкщя з профшактики та оздоровления велико! рогато! худоби вщ лейкозу /Затверджено наказом Державного ком!тету ветеринарно! медицини Укра!ни 21.12.2007р. № 21. Зареестровано в MimcTepcTBi юстиц!! Укра!ни 11.01.2008р. за№ 12/14703.
4. Kicepa Я.В. Серолопчт методи д!агностики лейкозу велико! рогато! худоби/Я.В. Kicepa // Науковий вкник ЛАВМ ¿мен! С.З. Гжицького.- Т.-14. - №3 (53).- Ч.-1.-Льв1в, 2012.-е. 89-92.
5. Нагаева Л. I. Д!агностика та ироф!лактика лейкозу велико! рогато! худоби/ Л. I. Нагаева, С. В. Аранчш, В. А. Синицин [та ш.]. - К., 2003. - 64 с.
6. Зав!рюха Г.А. Вииробування вакцини «Лейкозав» ироти лейкозу велико! рогато! худоби на в!вцях / Г.А. Зав!рюха, С.М. Дзюба, A.I. Зав!рюха/ Ветеринарна б!отехнолог!я. - К. :Аграрна наука, 2002. - №2.- С.73-82.
7. Зав!рюха Г.А. Вилив вакцини «Лейкозав» на оргатзм хворих лейкозом кор!в на р!зних стад!ях розвитку шфекцп / Г.А. Зав!рюха, С.М. Дзюба, A.I. Зав!рюха // Ветеринарна бютехнолопя. - К.:Аграрна наука, 2004.- №5.-С.23-33.
8. Зав!рюха Г.А. Формування ¿муттету у кор!в, щеилених вакциною «Лейкозав», в умовах еи!зоотичного експерименту та його вилив на оздоровления вщ лейкозу / Г.А. Зав ¿рюха // Ветеринарна медицина: м!жвщ. темат. наук. зб. - X., 2009. - № 92.- С.203-207.
9. Инструкция по применению тест-системы «ЛЕЙКОЗ» для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС) методом полимеразной цепной реакции - ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.- Москва. - 2009. - 19 с.
10. Подымалкин А.А. Использование метода Real-Time PCR для диагностики генетической устойчивости КРС к лейкозу/А.А. Подымалкин // Эл. ресурс: http://www.biotech-bryansk.net/nfiles/news/b_A0514E5A-53E6-4F46-B765-DA28B6922049.pdf.
11. Гриневич О.Й. Кшьккне визначення ДНК npoBipycy лейкозу велико! рогато! худоби - як метод оцшки шфжованост! тварин/О.И. Гриневич,
1.Г. Маркович, I.B. Пoлiщyк // Ветеринарна медицина Украши. - 2013. - №05 (207). - С. 14-16.
Summary
Zaviriuha G.A., Polechuk I.V., Afanaseva K. V., Burlakova N.O.
CHANGES IN THE POPULATION OF LEUKEMIA RETROVIRUS IN THE BLOOD OF SICR COWS AFTER IMMUNIZATION LEYKOZAV
In the article is presented the results of studying the influence of post-vaccination immunity to changes in the population of retrovirus bovine leukemia in the blood plasma of RIA positive animals. Key words: cattle, leukemia, immunization, vaccine.
Рецензент - к.вет.н., доцент Калшша О.С.
98
