CC BY
62
УДК 619: 616.1: 616-07
Ккера Я.В., д.вет.н., професор ©
Лъв\всъкий нацюналънийутеерситет еетеринарногмедицини та бютехнологт
Iмет С.З. Гжицъкого
СЕРОЛОГ1ЧН1 МЕТОДИ Д1АГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗУ ВЕЛИКО!
Р0ГАТ01ХУДОБИ
У статт1 проведена ощнка серолог1чних метод1в д1агностики лейкозу велыког рогатог худоби в умовах гг експерименталъного тф1кування та еизначет змши морфолог\чних показниюв кров1 теля тфжування.
Ключое1 слова: велика рогата худоба, лейкоз, реакщя ¡мунодифузп, ¡муноферментний анал1з, пол1меразна ланцюгова реакщя, кров, сироватка кров\, лейкоцити, л1мфоцити.
Вступ. Основою профшактичних та оздоровчих заход1в за лейкозу велико! рогато! худоби е своечасна прижиттева д1агностика ¿з застосуванням чутливих метод1в виявлення шфжованих тварин. Доведения в1русно! етюлогп захворювання зумовило розробку та вировадження в практику сучасних метод1в д1агностики [6, 7], в основ! яких лежить дослщження сироватки кров! з метою виявлення специф1чних антитш, що сприяе виявленню шфжованих тварин на раннш стади захворювання.
На сучасному етат основними методами д1агностики лейкозу велико! рогато! худоби е серолопчний - реакщя ¿мунодифузи (Р1Д) та ¿муноферментний анал1з (1ФА) [2, 3, 4, 5, 10], яю грунтуються на виявленш сиециф1чних антитш до антигену в1русу лейкозу велико! рогато! худоби \ молекулярно-генетичний - пол1меразна ланцюгова реакщя (ПЛР). Суть !! полягае в видшенш в дослщжуванш проб! пров1русно! ДНК \ наступна ампл1фшащя специф1чно! дшянки ДНК в1русу лейкозу велико! рогато! худоби з використанням специф1чних ол1гонуклеотидних праймер1в \ синтезу комплементарних ланцюпв ДНК за допомогою ферменту Тад-пол!мерази. Метод високочутливий, але наявш певш обмеження у використанш, яю пов'язаш з дороговизною обладнання \ д1агностичних набор1в та дотримання особливихумов проведения д1агностично! процедури [1, 8, 9].
Матер1ал 1 методи. Дослщження проведен! на велиюй рогатш худоб! чорно-рябо! породи 12-м1сячного вшу, середньою живою масою 200 кг. У дослщах були зад!яш 15 тварин, яю були роздшеш на дв1 групи - контрольну \ дослщну. У контрольнш груш було п'ять тварин. Тваринам дослщно! групи (10 гол1в) введено кров в доз! 1 мл вщ гематолопчно хворо! на лейкоз корови (23,6 Г/л лейкоцшгв за 81% л!мфоцит!в. Кров донора вводили пщшюрно у дшянщ середньо! третини ши!. Експеримент тривав 6 мюящв. Матер1ал для дослщжень вщбирали щомюячно.
© Ккера Я.В., 2012
89
Серолопчш та гематолопчш дослщження на лейкоз проводили згщно з "Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота", затвердженими в 1985 рощ. Наявшсть шфекци в1русу лейкозу встановлювали виявленням специф1чних антитш за допомогою реакцп ¿мунодифузи в агаровому гел1 з лейкозним антигеном та ¿муноферментного анал1зу. Р1Д проводили з використанням компонент комерцшного "Набору для д1агностики лейкозу велико! рогато! худоби методом Р1Д" виробництва 1нституту ешзоотологи НААН у стандартнш постановщ. Облж результапв реакци здшснювали через 48 \ 72 годин теля в!зуал!заци специф1чно! прециттуючо! лшп. Для постановки 1ФА використовували ¿муноферментну тест-систему для дeтeкцiiaнти-gp51aнтитiл у сироватщ кров! велико! рогато! худоби ф1рми IDEXX виробництва США. Д1агностичну процедуру виконували згщно шетрукци, що додавалась до тест-системи.
Статистичну обробку отриманих даних та оцшку в!рогщност! проводили за параметричним критер1ем Ф1шера-Стьюдента з використанням 1ВМ-сум1сного комп'ютера.
Результати дослщження. Одержан! результата серолопчних досл!джень на експериментально ¿нф!кованих в!русом лейкозу тварин показали неоднакову чутлив!сть 1ФА! Р1Д (табл. 1).
Як видно з таблиц! 1, метод ¿муноферментного анал!зу е б!льш чутливим та ефективним пор!вняно з реакц!ею ¿мунодифузи. Так, п!сля 1-го м!сяця шфжування методом 1ФА отримали 80%, а з другого - 100% позитивних результат!в, у той час як методом РЩ одержано в 1-й мкяць 100% негативних результат!в, на другий м!сяць - 50% позитивних результат, ! лише з 3-го мюяця ¿нф!кування спостер!гаеться 100% виявлення ¿нф!кованих тварин.
Таблиця 1
По|Мвняння чутливост1 серолог1чних реакц1й (1ФА, Р1Д) в ¡нф1ковано1
в1русом лейкозу велико! рогато!' худоби
Кшь- к1сть тварин 1ФА Р1Д
Шсля 1н< нкування Шсля шф1кування
1 м1с. 2 м1с. 3 м1с. 4 м1с. 5 м1с. 6 м1с. 1 м1с. 2 м1с. 3 м1с. 4 м1с. 5 м1с. 6 м1с.
1 + + + + + + - + + + + +
2 + + + + + + - - + + + +
3 - + + + + + - - + + + +
4 + + + + + + - - + + + +
5 + + + + + + - + + + + +
6 + + + + + + - - + + + +
7 + + + + + + - - + + + +
8 - + + + + + - + + + + +
9 + + + + + + - + + + + +
10 + + + + + + - + + + + +
Проведен! гематолопчш дослщження (табл. 2, 3) заевщчили однотипшеть змш у перш! два мкящ п!сля ¿нф!кування як у клмчно здорово!, так ! шфжовано! в!русом лейкозу велико! рогато! худоби. Зокрема, спостер!гаеться зниження гематокриту (у здорових - з 36,02±1,05 до
90
32,06±1,32%, в шфкованих - Í3 34,50±0,44 до 32,12±0,57), лейкоципв (у здорових - з 6,20±0,76 до 4,60±0,42 Г/л, а шфкованих - Í3 6,50±0,40 до 4,84±0,57 Г/л) i гемоглобшу (у здорових - Í3 102,25±2,38 до 99,83±3,97 г/л, в шфкованих з 108,06±1,18 до 98,06±1,40 г/л). Починаючи з третього мкяця шфкування, появляються вщмшносп в цих показниках. Так, кшькють сегментоядерних нейтрофЫв (10,0±0,85%), еозинофшв (1,5±0,17%) в шфкованих тварин знижуеться, тод1 як bmíct л1мфоцит1в (81,5±0,94) пщвищуеться пор1вняно з контрольною групою тварин (вщповщно 22,5±1,06, 4,5±0,44, 64,5±1,30%). Абсолютний та вщсотковий bmíct шших кл1тин гранулоцитарного ряду в процес1 експерименту 3míh не зазнають.
Таблиця 2
МорфолоНчш показники Kpoßi кшшчно здорово*! велико*! рогато*! худоби
(M ± m, n = 5)
Назва показнишв Оди-ниця bhmípy Твари-ни bíkom 12 míchuíb BÍK у м1сяцях
13 14 15 16 17 18
Гематокрит % 36,02± 1,05 35,43± 0,83 * 32,06± 1,32 33,08± 1,40 35,02± 1,59 * 31,94± 1,28 * 31,12± 1,46
Еритроцити Т/л 5,68± 0,27 5,70± 0,23 5,88± 0,35 5,51± 0,39 6,80± 0,44 * 6,82± 0,31 5,70± 0,35
Лейкоцити Г/л 6,20± 0,76 4,60± 0,42 4,76± 0,17 5,56± 0,55 6,64± 0,90 5,80± 0,37 5,48± 0,21
Гемоглобш г/л 102,25± 2,38 99,59± 3,11 99,83± 3,97 93,56± 4,38 99,06± 3,48 95,60± 2,11 * 92,68± 1,88
Лейкограма о & « <d X П % 4,0± 0,47 3,0± 0,58 2,5± 0,61 3,0± 0,53 3,5± 0,49 4,0± 0,38 3,5± 0,56
С % 29,0± 1,63 29,0± 1,54 * 22,5± 1,63 * 22,5± 1,06 * 23,0± 1,12 ** 22,0± 0,58 25,0± 1,06
Еозинофши % 1,5± 0,25 3,0± 0,93 *** 4,0± 0,29 *** 4,5± 0,44 ** 4,0± 0,58 ** 4,5± 0,68 3,0± 0,63
Моноцити % 5,0± 0,54 4,5± 0,60 5,0± 0,52 5,5± 0,69 3,5± 0,48 5,0± 0,61 4,0± 0,46
Л1мфоцити % 60,5± 2,24 60,5± 2,37 66,0± 4,28 64,5± 1,30 * 66,0± 0,68 64,5± 0,51 64,5± 0,86
Примггки: * прир < 0,05; ** прир < 0,01; *** прир < 0,001.
91
Таблиця 3
МорфолоНчш показники кров! шфжовано1 в1русом лейкозу великоТ __рогато!' худоби (14 ± m, п = 10)_
Назва Оди- До шф1ку- Шсля шф1кування (м1сящ)
ниця 1 2 3 4 5 6
вим1ру вання
** *** ** ***
Гематокрит % 34,50±0,44 33,26± 0,69 32,12± 0,57 30,89± 0,57 32,40± 1,02 31,89± 0,71 30,43± 0,46
* ** *
Еритроцити Т/л 5,11±0,45 5,18± 0,21 4,81± 0,15 5,68± 0,26 6,27± 0,23 6,75± 0,26 6,36± 0,31
* * ***
Лейкоцити Г/л 6,50±0,40 5,8± 0,44 4,84± 0,57 7,54± 0,25 7,28± 0,30 7,16± 0,28 8,76± 0,40
** *** *** *** ** **
Гемоглобш г/л 108,06±1,18 100,63± 1,87 98,06± 1,40 98,46± 1,61 98,48± 1,54 99,28± 2,01 100,73± 1,71
о о П % 3,0±0,37 4,0± 0,54 3,5± 0,62 3,0± 0,29 2,5± 0,43 2,5± 0,47 * 2,0± 0,22
& « <и X *** *** *** ***
л С % 24,5±3,57 22,0± 3,02 25,0± 1,94 10,0± 0,85 8,5± 0,50 8,0± 0,49 8,5± 0,60
§ ** * ** **
Еозинофши % 2,0±0,30 4,0± 0,36 1,5± 0,37 1,5± 0,17 1,0± 0,09 1,0± 0,05 0,5± 0,04
Моноцити % 5,5±0,61 5,5± 0,70 5,0± 0,83 4,0± 0,78 5,0± 0,68 4,5± 0,74 5,5± 0,69
*** *** *** ***
Л1мфоцити % 65,0±3,40 64,5± 2,89 65,0± 1,83 81,5± 0,94 83,0± 0,50 84,0± 0,50 83,5± 0,64
Примггки: * при р < 0,05; ** при р < 0,01; *** при р < 0,001.
Одержан! результати дослщжень свщчать, що змши в морфолопчному склад! кров! на третьому мкящ шфжування зб1гаються з наявними позитивними результатами у реакци ¿мунодифузп. Проте методом 1ФА виявити шфжованих тварин можна до початкових змш у кровг
Висновки.
1. В умовах експериментального заражения велико! рогато! худоби кров'ю гематолог!чно хворо! на лейкоз корови серолог!чну в!дпов!дь за 1ФА можна виявити приблизно на мкяць ран!ше, н!ж за Р1Д.
2. Розвиток лейкозного процесу на третьому мшящ шф!кування, який характеризуеться початковими зм!нами в кров! на р!вш сегментоядерних нейтроф!л!в, еозиноф!л!в та л!мфоцит!в, зб!гаються з одержанням позитивних результат у реакц!! ¿мунодифузи.
3. 3 метою прискореного оздоровления господарств у систем! заход!в на завершальному еташ оздоровления серолог!чн! досл!дження сл!д проводите ¿муноферментним методом, що дасть змогу виявити хворих тварин у перший мкяць шф!кування.
92
Л1тература
1. Власенко B.C. Выявление животных с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза КРС /B.C. Власенко, Т.С. Дудоладова, М.А. Бажин, А Н. Новиков //Веткорм. - 2008. - № 4. - С. 8-9.
2. Гулюкин М.И. Разработка эффективных мероприятий против лейкоза крупного рогатого скота /М.И. Гулюкин, Л.А. Иванова, Н.В. Замараева и др. //Ветеринария. - 2002. - № 12. - С. 3-8.
3. Двоеглазов Н.Г. Некоторые особенности оздоровительных мероприятий от инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах с применением реакции иммунодиффузии и иммуно-ферментного анализа /Н.Г. Двоеглазов, Т.А. Агарпова //Ветеринарный врач. - 2010. - № 1. - С. 22-24.
4. .Иванов О.В. Эффективность серологических методов исследования при лейкозе крупного рогатого скота /О.В. Иванов, О.Ю. Иванова, В.П. Федотов и др. //Ветеринария. - 2008. - № 7. - С. 6-8.
5. 1нструкщя з профшактики та оздоровления велико! рогато! худоби вщ лейкозу /Затверджено наказом Державного ком!тету ветеринарно! медицини Украши 21 12 2007 р. №21. Зареестровано в МЫстерств! юстици Укра!ни 11 01. 2008 р. за№ 12/14703.
6. Kicepa Я.В. Морфофункц!ональн!, ¿мунолопчш та 6ioxiMi4Hi зм!ни в патогенез! лейкозу велико! рогато! худоби: автореферат дис. док. вет. наук; спец. 16.00.02 /Я.В. Kicepa. - Ки!в, 2011. - 34 с.
7. Ковалюк Н.В. Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота /Н.В. Ковалюк, В.Ф. Сачук, Е.В. Мачульская //Ветеринария Кубани. - 2007. - № 1. - С. 11-13.
8. Козырева Н.Г. Проблемы и перспективы применения полимеразной цепной реакции в диагностике лейкоза КРС /Н.Г. Козырева, Н.Ф. Ломакина, Л.А. Иванова, М.И. Гулюкин //Веткорм. - 2009. - № 3. - С. 8-11.
9. Лиманська О.Ю. Визначення стаи ембр!он!в та виявлення Bipycy лейкозу велико! рогато! худоби за допомогою пол!меразно! ланцюгово! реакц!! /О.Ю. Лиманська, О.П. Лиманський //В!сник аграрно! науки. - 2001. - № 2. -С. 34-38.
10. Мельник Ю.Ф. Ешзоотолопчна ефективн!сть заход!в боротьби з лейкозом велико! рогато! худоби /Ю.Ф. Мельник, М.С. Мандигра //В!сник аграрно! науки. - 2004. - № 2. - С. 26-28.
Summary Kisera J.V.
SEROLOGICAL METHODS FOR DIAGNOSIS BOVINE LEUKEMIA
The paper deals with the evaluation of serological methods of bovine leukemia diagnosis in its experimental infection and is defined certain morphological changes of blood indices after infection.
Key words: cattle, leukemia, immunodiffusion, ELISA, polymerase chain reaction, blood, serum, leucocytes, lymphocytes.
Рецензент - к.вет.н., професор Калшша О.С.
93
