CC BY
88
УДК 001. 891. 577.214
Назар Б. I., к.вет.н. ©
Державный науково-досл1дний контрольный тститут ветеринарных препарат1в та кормових добавок, м. Льв1в, Украгна
ПРОБЛЕМИ, ЯК1 ВИНИКАЮТЬ П1Д ЧАС ПРОВЕДЕННЯ ПОЛ1МЕРАЗНО -ЛАНЦЮГОВО1 РЕАКЦП (ПЛР) ТА МОЖЛИВ1СТЬ IX УНИКНЕННЯ
Проведено аналгз можливих помилок та проблем, що можуть виникати в процесс проведення пол1меразно-ланцюгово1 реакцп на преаналтичному, аналтичному та постаналтичному етапах. Подано основт заходи щодо недопущення виникнення контамтацп I, як наслгдок, отримання хибно позитивних або хибно негативних результатов. 1з метою тдтвердження вгдсутностг контамтацп, необхгдно кожну серю експеримент1в супроводжувати постановкою негативних контрол1в (К-). Для контролю за якгстю проходження основних етатв анализу (в1дб1р, транспортування, зберггання, видыення НК, проведення реакцИ зворотног транскрипцп чи безпосередньо реакцИ амплгфгкацИ) обов'язковим е використання позитивних контрол1в (К+), що дозволяють оцтити ефективтсть реакцИ I якгсть реагентгв. Висвтлено декглька способов усунення контамтацп. Вказано на необхгдтсть проводити регулярний внутрШньолабораторний контроль якостг дослгджень 1з пергодичтстю, яка залежить вгд обсягу роботи. Основними критериями оцтки якостг роботи ПЛР-лабораторИ е результати внутрШнього I зовнШнього лабораторного контролю якостг дослгджень, а також вгдсуттсть випадюв лабораторной контамтацп НК.
Ключов'1 слова: пол1меразно-ланцюгова реакция, нуклегнова кислота, контамтацгя, хибно позитивнийрезультат, хибно негативнийрезультат.
УДК 001. 891. 577.214
Назар Б. И., к. вет. н.
Государственный научно-исследовательский контрольный институт ветеринарных препаратов и кормовых добавок, м. Львов, Украина
ПРОБЛЕМЫ, КОТОРЫЕ ВОЗНИКАЮТ ВО ВРЕМЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНО-ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ
ИЗБЕЖАНИЯ
Проведен анализ возможных ошибок и проблем, которые могут возникать в процессе проведения полимеразной цепной реакции на преаналитическом, аналитическом и постаналитическом этапах. Представлены основные мероприятия по недопущению возникновения контаминации и, как следствие, получение ложно положительных или ложно отрицательных результатов. С целью подтверждения отсутствия контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать постановкой негативных контролей (К-). Для контроля за качеством прохождения основных этапов анализа (отбор, транспортировка, хранение, выделения НК, проведения реакции обратной транскрипции или непосредственно реакции амплификации) необходимо использовать положительные контроли (К+), позволяющие оценить эффективность реакции и качество реагентов. Освещены несколько способов устранения загрязнений. Указано необходимость проводить регулярный внутри-лабораторный контроль качества исследований с периодичностью, которая зависит от объема работы. Основными критериями оценки качества работы ПЦР-лаборатории являются результаты внутреннего и внешнего лабораторного контроля качества исследований, а также отсутствие случаев лабораторной контаминации НК.
© Назар Б. I., 2015
88
UDC 001. 891. 577.214
Nazar. I.
State scientific-research control Institute of veterinary preparations and fodder additives, Lviv, Ukraine
PROBLEMS THAT OCCUR DURING THE POLYMERASE-CHAIN REACTION (PCR) AND THE ABILITY TO AVOID THEM
The analysis of possible errors and problems that may arise in the process of polymerase chain reaction to pre-analytical, analytical and post-analytical stages. The basic measures for prevention of occurrence of contamination and consequently obtaining false positive or false negative results. In order to confirm the absence of contamination, should accompany each experiment staging a series of negative controls (K-). For quality control passage of the main stages of analysis (selection, transportation, storage, allocation of IPC reverse transcription reaction or direct reaction amplification) is required to use a positive control (C+), to assess the effectiveness and quality of reaction reagents. Deals are several ways to eliminate contamination. Specified the need to conduct regular internal laboratory quality control studies with frequency depending on the workload. The main criteria for assessing the quality of PCR laboratory are results of internal and external quality control of laboratory studies and the lack of laboratory cases of contamination NC.
Перевагами полiмеразно-ланцюговоï реакци (ПЛР), ropiB^HO з шшими методами, е ушверсальшсть, специфiчнiсть, чутливють, актуальшсть вщповщ (швидюсть отримання результату).
Метою роботи е оглядове висв^лення причини виникнення помилок та методи ïxHboro усунення шсля проведення ПЛР. У рамках статп ми звернемо особливу увагу на проблему контамшаци та основш шляхи ïï попередження. Контамшащя -потрапляння i3 навколишнього середовища в реакцшну сумш специфiчних i неспецифiчних молекул ДНК, здатних служити мiшенями в pеакцiï амплiфiкацiï i давати хибно позитивнi або хибно негативнi результати [1-3].
За проведення ПЛР-анашзу виникнення помилок можливе на преанаштичному, аналiтичному та постаналiтичному етапах. Це може призвести як до хибно позитивних (ХП) (позитивний результат до^дження, коли фрагмент специфiчноï дшянки нуклешово1' кислоти (НК) у матеpiалi вiдсутнiй), так i хибно негативних (ХН) (негативний результат за наявносп НК в зразку) pезультатiв.
На преанаштичному етапi важливу роль слщ пpидiлити пpавильностi вiдбоpу матеpiалу. Для попередження виникнення ХП помилок при вiдбоpi проби слiд використовувати виключно стеpильнi одноpазовi емностi, pукавицi, пpобipки, оскiльки за недотримання цих правил виникае ризик контамшаци вщбраного матеpiалу «чужорщною» НК.
На аналiтичному еташ правильна оpганiзацiя ПЛР-лабоpатоpiï мае принципове значення для отримання вipогiдних результата i суттево залежить вiд методу детекци пpодуктiв амплiфiкацiï.
За умов використання методу горизонтального електрофорезу, етапу детекцiï необхвдно пpидiляти особливу увагу, адже вiн е основним джерелом контамшаци. Примщення для електрофорезу мае бути розмщене в такому мсщ, що виключае попадання амплiконiв в iншi технологiчнi зони лабоpатоpiï. О^м цього потpiбний окремий спiвpобiтник, ретельно продумана система вентиляцiï, вiдсутнiсть можливосп пеpемiщення пpобipок, штативiв та шшого обладнання iз кiмнати для електрофорезу в iншi пpимiщення.
89
У робой сшвробггника, що займаеться ПЛР^агностикою, трапляються два види контамшацп: перша - перехресна контамшащя вiд проби до проби (наприклад, у процесi обробки клiнiчних зразюв), що веде до появи спорадичних хибно позитивних результатiв i друга - контамшащя продуктами амплiфiкацil (амплшонами), яка мае найбiльше значення, адже в процесi ПЛР амплiкони накопичуються у великих кiлькостях i слугують iдеальними продуктами для реамплiфiкацil.
До появи систематичних хибно позитивних результата призводить контамiнацiя залишковими кiлькостями ампшкошв посуди, автоматичних пiпеток, лабораторного обладнання, поверхонь лабораторних столiв i навггь поверхнi шкiри спiвробiтникiв лабораторп.
Зазвичай визначити джерело контамшацп бувае дуже важко, а сам процес И л^щацп потребуе значних витрат часу та засобiв. Дотримання вимог, що ставляться до планування примiщень ПЛР-лабораторш i проведення самих аналiзiв, виключае можливiсть контамшацп та отримання хибно позитивних результата. У кожному примщенш ПЛР-лаборатори мае бути достатнiй набiр реагентiв, автоматичних пiпеток, наконечникiв, пластикового i скляного посуду, лабораторного обладнання, халата i рукавиць, що використовуються тiльки в даному примiщеннi i не виносяться в iншi. Обладнання, матерiали та iнвентар у кожнш кiмнатi вiдповiдним чином маркуються.
За умов дослщжень iз використанням ампшфшаци нуклешових кислот, обов'язкове забезпечення потоковосп руху матерiалу, проб НК, продукта ампшфшаци. Робота у лабораторп мае бути оргашзована тiльки в одному напрямку вiд пре-ПЛР-примiщень до пост--ПЛР--примщень.
Для усунення контамшацп безпосередньо пiд час амплiфiкацil юнуе декiлька способiв. Одним iз них е використання ензиму N-урацил-глiкозилази (УГ), який розщеплюе молекули ДНК, що мютять у своему складi урацил. Реакцiю амплiфiкацil проводять iз використанням сумiшi dNTPs, в якiй dTTP замiнений на dUTP, i в результат термоциклювання всi амплiкони, що утворилися в пробiрцi мiститимуть урацил. Якщо додати в реакцiйну сумш УГ перед етапом амплiфiкацil, то амплшони, що потрапили в реакцшну сумiш зруйнуються, а нативна ДНК залишиться неушкодженою i слугуватиме в подальшому мiшенню в реакци ампшфшацп. 1нший спосiб шактивацн амплiконiв - фотохiмiчний вплив на молекули ДНК. 1з цiею метою використовують сполуки псоралену, якi активуються короткочасною дiею ультрафiолетового свiтла. Модифiкованi цими сполуками молекули ДНК не можуть брати участь в реакци ампшфшаци [3]. Але жоден iз цих методiв не дае 100% гарантн уникнення контамшацп, а отже iснуе ризик отримання ХП та ХН результата. 1з метою шдтвердження вiдсутностi контамшацп, необхщно кожну серiю експерементiв супроводжувати постановкою негативних контролiв (К-). Як К-можуть використовуватися: вода, реакцшна сумiш, зразки генетичного матерiалу, як негативнi за ДГ. Для контролю за яюстю проходження основних еташв аналiзу (вiдбiр, транспортування, зберiгання, видшення НК, проведення реакцп зворотно! транскрипцп чи безпосередньо реакцп амплiфiкацil) обов'язковим е використання позитивних контролiв (К+), що дозволяють ощнити ефективнiсть реакци i якiсть реагентiв. Для проведення кшьюсного ПЛР-аналiзу слiд використовувати серда калiбраторiв, що мiстять кiлькiсно охарактеризован ДГ, якi використовуються для побудови катбрувальних прямих, а також в якосп К+ [3]. Постановка К+, К -, калiбраторiв, використання УГ, сполук псоралену, знижують ризик появи ХП i ХН результатiв на вищезгаданих етапах дослiдження.
90
У nnP^a6opaTOpÍHx необхщно проводити регулярний внутршньолабораторний контроль якостi достджень Í3 перiодичнiстю, яка залежить вщ обсягу роботи i визначена керiвником лаборатори, але не менше одного разу на квартал.
Лабораторiя мае брати участь у встановленому порядку в заходах (програмах) Í3 зовшшньо! оцiнки якостi лабораторних дослiджень за конкретними показниками не менше одного разу на рш.
Внутршньолабораторний i зовшшнш контроль якостi лабораторних дослщжень здшснюють шляхом аналiзу шифрованих атестованих контрольних панелей, якi мiстять позитивш й негативнi проби. Пiд час внутршньолабораторного контролю якостi використовують атестоваш на наявнiсть аналiзу (його кшькосп) панелi виробникiв комерцiйних наборiв або внутршньолабораторш атестованi зразки, що мютять i не мiстять НК конкретного дослщжувального матерiалу у рiзнiй концентраций при стабiльних умовах зберiгання.
Контроль якосп дослiджень е невiд'емною складовою правильно! оргашзаци роботи ПЛР-лаборатори. Вш включае в себе постiйне проведения внутршньо-лабораторного контролю якостi, передбаченого системою забезпечення якостi дослiджень, що дiе в кожнiй конкретнiй лаборатори, i участь у програмах зовшшньо! оцшки якостi ПЛР-дослiджень (професiйне тестування).
Система забезпечення якостi роботи ПЛР-лаборатори повинна передбачати систематичне проведення виутрiшньолабораторного контролю якостi дезiнфекцi! (деконтамшаци). Перiодичнiсть проведення внутрiшньо лабораторного контролю якосп деконтамiнацi! об'ектiв довкiлля визначаеться керiвником лабораторп' залежно вiд об'ему виконувано! роботи, але не рщше одного разу на квартал. У разi пiдозри на контамiнацiю внутршньолабораторний контроль деконтамiнацi! об'ектiв довкiлля лаборатори проводять негайно. Для оцiнки якосп деконтамiнацiйних заходiв та виявлення можливо! контамiнацi! лабораторп' НК або продуктами амптфшаци контроль проводять шляхом вщбору змивiв iз поверхонь. Змиви з поверхонь беруть стерильними ватними тампонами (мшмальний розмiр площi 10х10 см). Перед вщбором змивiв тампони змочують стерильним iзотоиiчним розчином натрiю хлориду або ТЕ-буфером (10 mM Tris, 1 mM ЕДТА), пiсля чого обертальними рухами протирають робочi поверхш обладнання, меблiв, дверних ручок тощо.
Особливу увагу придiляють примiщениям, яю вiдвiдують усi спiвробiтники лабораторп' (юмнати прийому !ж1, туалет тощо). Пюля вiдбору змиву тампон помiщають у мiкропробiрки типу «епендорф» з 300-400 мкл ТЕ-буфера, обертальними рухами змивають вщбраний матерiал протягом 10-15 секунд, уникаючи розбризкування розчину, i, вщтиснувши надлишок рiдини з тампону об стшки пробiрки, видаляють.
Одержанi суспензи центрифугують при 8 000 g (12 000 об/хв) протягом одше! хвилини. Надосадову рiдииу вiдбирають наконечником з аерозольним бар'ером в мiкропробiрку об'емом 1,5 мл. Для видшення НК використовують 0,1-0,2 мл надосадово! фракци. Для дослiджения слiд обирати тест-системи з виутрiшнiм контрольним зразком. Постановка негативних контролiв за видшення НК i проведенш реакци обов'язкова. Це дозволить своечасно виявити контамшащю в лабораторп'. Керiвник ПЛР-лабораторп' або фах1вець, на якого покладенi функци контролю якостi (менеджер з якосп), перюдично проводить тестування працiвникiв шляхом надання контрольних задач (виутрiшнiй контроль якосп дослщжень). Як «позитивш» можуть бути використаш:
- зразки, штучно контамшоваш НК;
91
- зашифрован проби MaTepiany, уже дослщженого в лабораторп рашше, яю збepiгaлися за температури MiHyc 20 °С не бiльшe тижня. У цих пробах визначають НК з того ж мaтepiaлy, що за первинного дослiджeння;
- атестоваш контpольнi пaнeлi, що мiстять «позитивш» i «негативш» проби. Як «негативш» - зразки, що не мютять НК, наприклад, ДНК-буфер.
Кiлькiсть проб залежить вiд об'ему проведених дослщжень i повинна бути достатньою для ощнки роботи спiвpобiтникiв i виявлення контaмiновaних дiлянок лабораторп.
За проведення зовшшньо1 оцiнки якостi дослiджeнь лaбоpaтоpiя-yчaсник отримуе aтeстовaнi контpольнi пaнeлi, що мютять "позитивш" i "нeгaтивнi" проби. За результатами розшифровки атестованих контрольних панелей роблять висновок щодо ощнки якосп ПЛР-дослiджeнь. Основними кpитepiями ощнки якосп роботи ПЛР-лабораторп е результати внутршнього i зовнiшнього лабораторного контролю якосп дослiджeнь, а також вщсутнють випaдкiв лабораторно! контамшацп НК.
Висновки. 1. Найбшьш поширений в лабораторий пpaктицi молекулярно-бiологiчний метод - полiмepaзноl ланцюгово! реакцп в процес проведення потребуе обов'язкового дотримання вшх вимог i правил проведення ПЛР.
2. З метою пiдтвepджeння вщсутносп контамшацп нeобхiдно кожну сepiю експеримента супроводжувати постановкою негативних контpолiв (К-). Для контролю за якiстю проходження основних eтaпiв aнaлiзy обов'язковим е використання позитивних контpолiв (К+).
3. Для уникнення одержання хибно позитивних результата нeобхiдно регулярно (щоквартально) проводити внyтpiшньо-лaбоpaтоpний контроль, а зовнiшню ощнку якостi роботи ПЛР-лабораторп - не менше одного разу на рш.
Лiтература
1. Молeкyляpно-гeнeтичнi методи дiaгностики у вeтepинapнiй мeдицинi та бютехнологи. / Гepiлович А. П., Стегнш Б. Т., Зaвгоpоднiй А. I., Влiзло В. В. та ствавтори - Кив, СТ-Друк, 2014. - 286 с.
2. Умови проведення полiмepaзноl ланцюгово1 реакцп у лабораторий практищ (мeтодичнi аспекти) / М. С. Калачнюк, Л. Г. Калачнюк, Д. О. Мельничук та ш. // Бiологiя тварин. - 2012. -14, №1. - С. 660-667.
3. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. пер. с англ. / под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги. - М., 1999. - 558с.
Стаття надшшла до редакцИ 3.09.2015
УДК 636.4:591.11
Огородник Н. З., к.вет.н., ст. наук. ствр. (E-mail: nataohorodnyk@ukr.net) Вiщур О. I., д.вет.н., професор ©
1нститут б1ологИ' тварин НААН, м. Льв1в, Украта
ВПЛИВ ПРЕПАРАТУ «1НТЕРФЛОК» НА ПАРАМЕТРИ ШИЙНИХ Л1МФОВУЗЛ1В, МАСУ ВНУТР1ШН1Х ОРГАН1В I ПРОДУКТИВН1СТЬ ПОРОСЯТ П1СЛЯ В1ДЛУЧЕННЯ В1Д СВИНОМАТОК
Оргатзм поросят тсля вгдлучення eid свиноматок постшно перебувае тд впливом багатьох факторiв екзогенного i ендогенного походження, як сприяють виникненню оксидативного стресу, проявом якого е накопичення в кровi i тканинах продуктiв пероксидного окиснення лiпiдiв. У результатi цього вiдбуваються змти в органах i тканинах, що призводять до дестабтзацп гомеостазу в органiзмi поросят,
© Огородник Н. З., Вщур О .I., 2015
92
