CC BY
63
УДК 619: 578. 825: 636.085.3 + 636.085. 57
Назар Б. I., к. вет. н © Державный науково-дослгдный контрольный тстытут ветеринарных npenapamie та кормовых добавок, м. Лъвгв
ВАЛ1ДАЦ1Я К1ЛЬК1СНОГО МЕТОДУ, НА OCHOBIАНАЛ13УВАННЯ НУКЛЕШОВИХ КИСЛОТ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ГЕНЕТИЧНО МОДИФ1КОВАНИХ ОРГАН13М1В I ПРОДУКТ1В 3 ÏX УМ1СТОМ
Проведено вал1дацт методыкы ктътсного вызначення генетычно модыфжованых оргатзм1в i продуктгв з ïx умгстом. У xodi проведения дослгдження булы вызначеш основт валгдацтт параметры: зб1жтстъ (повторюватстъ), спецыф1чшстъ, точшстъ, правылъшстъ, ступтъ вгдповгдностг та блызъкостг, в1дтворювашстъ мгтоду, лтттстъ, робасттстъ. Отрымаш результаты свгдчатъ про те, що наведена методыка eidnoeidae сучасным крытергям до аналгтычных методык ктътсного вызначення i дозволяе об'ектывно вызначыты eMicm генетычно модыфжованых оргашзм1в i продуктгв з ïxyMicmoM.
Термш валщащя (англ. Validation) використовуеться в р1зних сферах д1яльносп людини в кшькох розумшнях. Ключовим моментом валщацп е пор1вняння реальних вимог з задекларованими для досягнення певно! мети, визнання будь-чого законним, дшсним. Валщацш - це процедура, що дае високу Mipy упевненост1 в тому, що конкретний метод (в межах встановлених параметр1в) волод1е зб1жшстю (повторювашстю) i послщовно приводитиме до очжуваних результате, встановлених критерпв прийнятност1 з метою доказу i надання документального свщоцтва. Валщацш анал1тичних метод1в полягае у визначенш: зб1жност1 (повторюваност1), специф1чност1, точности правиьност1, ступеня вщповщност1 та близькоси, вщтворюваност1, (м1жлабораторнш вщтворювашсть), лшшноста, робастшстю i шших метролопчних характеристик. Вщповщно до ISO 9000:2005 валщащею е пщтвердження на основ! подання об'ективних свщчень того, що вимоги, призначеш для конкретного використання або застосування, точно i в повному обсяз1 виконаш, а мета досягнута.
Вимоги до процедури валщацп анал1тичних методик викладеш в ряд1 докуменив ВООЗ, прийнятих в 90-х роках XX столбя, i в Державнш Фармакопе! Украши. Анал1тична методика повинна давати результати, не обтяжеш значущою систематичною помилок при достатнш зб1жност1 результате як у тих лаборатор1ях, в яких анал1тична методика була належним
© Науковий консультант Назар Б. I., 2012
- д.вет.наук, професор, членкор. НААН 1.Я. Коцюмбас 261
чином передана, так i в тих, яю отримали тшьки зразки препарату та анал1тичш нормативш документи (АНД).
Матер1али i методи. У ДНДК1 ветпрепарат1в та кормових добавок, у лаборатор1ях контролю кормових добавок та прем1кс1в, а також шструментальних метод1в, котр! мають лаборатори ПЛР, було проведено валщацш (в подальшому В.) кшьюсного методу виявлення вмкту ГМ джерела у дослщних зразках з внесениям дослщжуваних компонента (соевого шроту лшп GTS 40-3-2) у кшькост1 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 5,0 % методом пол1меразно ланцюгово! реакци в реальному 4aci з використанням принцишв, викладених у ДСТУ ISO 21570:2005. Обидв1 лаборатори отримали Ha6ip праймер1в, еталошв та екстракт ДНК coi GTS 40-3-2. Було розроблено основний план валщацп методу виявлення генетично модифжованих оргашзм1в i продукта з ix умютом, який вказував, як1 об'екти пщлягають В., визначав характер i масштаби випробування щодо кожного об'екта, описував у загальних рисах методики випробувань та протоколи, функцюнальш обов'язки персоналу, встановлював обов'язки щодо складання звтв та вимоги до документування роботи i результата. У валщацшних зв1тах з окремих операцш робили посилання на протоколи В. конкретного анал1зу, узагальнювали одержан! результати вим1рювань, пояснювали знайдеш вщхилення, наводили рекомендацп щодо i'x виправлення та полшшення.
Для основного устаткування (приладу ПЛР в реальному 4aci) було заведено журнали, за необхщноси записуючи в них Bci роботи з В., кал1брування, техшчного обслуговування, очищения та ремонту, i3 зазначенням дати та oci6, яю виконали щ роботи. У журналах у хронолопчному порядку також реестрували використання найважлившого устаткування. При проведенш валщацп використовували концепцш оцшки невизначеност1 результата анал1зу, що дозволяло критери прийнятносп пов'язати з р1внем дов1рчо! ймов1рност1, яю звичайно використовують в аналпичиш xiMii' (95 %). Для оцшки результата використовували нормал1зовану систему координат. Це дозволяло пред'являти науково обгрунтоваш вимоги до параметр1в лшшносл (коефщент кореляци, залишкове вщхилення), до характеристик правильное^ i прецизшноси, робастноси та шших, яю не залежать вщ масштабу дослщжуваних величин.
На 6a3i ДНДК1 ветеринарних препарата та кормових добавок було проведено внутршньолабораторну вщтворювашсть (within-laboratory reproducibility), яка вщображае здатшсть методу надавати повторюваш результати з незначним статистичним вщхиленням пщ впливом незначних змш (замша реактив1в, змша температури примщення, проведения дослщження в шший день, на шшому прилад1 i т.д.). Перед проведениям контролю внутршньолабораторно! вщтворюваносп було встановлено два фактори, яю можуть впливати на юнцевий результат дослщження, а саме.' замша реактив1в та змша температура примщення.
262
Результати дослщжень. У результат! проведених дослщжень встановлено, що методи вщтворюваш. Похибка при визначеш концентраци ГМ джерела становила вщ 15 до 60 %, що достаньо для проведения штерпретаци результата дослщжень даного джерела.
Нами проводились вивчення зб1жност1 (повторюваност1, Repeatability) - це характеристика результата вим1рювань, яка вщображае близькють один до одного результате повторних спостережень, проведених в однакових умовах i е м1рою коливань виб1рки даних навколо центрального значения. Було проведенно 10 визначень у приготовлених експериментальних зразках комбшорму та БВМД з внесениям до 1хнього складу р1зного процентного вмюту шроту соевого, виготовленого i3 генетично модифшовано! coi лши GTS 40-3-2.
Проведено визначення "специф1чност1" як здатност1 однозначно оцшювати анал1зовану речовину в присутност1 шших компонента, як1 можуть бути у зразку. Це могли бути домшки, продукти розкладу, допом1жш речовини тощо. Недолш специф1чност1 випробування був компенсований шшим (шшими) додатковими випробуваннями. Специф1чшсть для р1зних тишв випробувань означае проведения щентифжаци — доказ того, що щентифковано саме анал1зовану речовину.
При проведенш кшьккного визначення було пщтверджено те, що методика дозволяе точно i правильно встановити вмют або актившсть саме анал1зовано1 речовини у зразку. При цьому було враховано правильшсть дослщжень, що характеризуе стутнь вщповщност1 м1ж вщомим справжшм значениям або довщковою величиною i значениям, одержаним за щею методикою. Також враховували точшсть анал1тично! методики, що виражае ступ1нь близькосп (або стутнь розб1жност1) результата для cepiii вим1рювань, виконаних за даною методикою на р1зних пробах одного й того ж однорщного зразка. Вона розглядалась на трьох р1внях: зб1жшсть, внутршньо-лабораторна точшсть i вщтворювашсть. Точшсть визначали на в1рогщно однорщних зразках. Точн1сть анал1тично1 методики характеризувалась вщхиленням, стандартним вщхиленням або вщносним стандартним вщхиленням для cepii вим1рювань.
Було дослщженно зб1жшсть вим1рювань, що характеризуе точшсть методики при И виконанш в одних i тих же умовах (зокрема, одним i тим самим анал1тиком або групою анал1тик1в) протягом невеликого перюду. При вивченш точност1 було виконано 9 визначень, що охоплювали д1апазон застосування методики, та 6 визначень для зразюв i3 bmIctom анал1зовано! речовини, близьким до номшального. Нами встановлювалась внутршньо-лабораторна точшсть, котрахарактеризуе вплив внутршньолабораторних вар1ацш: pi3Hi дш, pi3Hi анал1тики, р1зне обладнання i под1бш змши. KpiM цього звертали увагу на вщтворювашсть методу, що характеризуе точшсть у м1жлабораторному експеримент1, оскшьки на стади розробки методики зазвичай складно провести м1жлабораторш дослщження. Для характеристики вщтворюваност1 застосовували прогноз невизначеност1 методики анал1зу, який грунтуеться на фармакопейних вимогах (або вимогах АНД) до обладнання й анал1тичного
263
посуду. Бралась до уваги межа виявлення (МВ) для конкретно! анал1тично! методики — мммальна кшькють анал1зовано! речовини у зразку, яка може бути виявлена (при цьому не обов'язково було визначене точне значения). Була встановлена межа кшьккного визначення (МКВ) для анал1тично! методики — мммальна кшькють анал1зовано! речовини у зразку, яка може бути кшькюно визначена з необхщною правильшстю \ точшстю. МКВ е валщацшною характеристикою методик кшьюсного визначення низьких концентрацш речовин у зразку \ розглядаеться в основному при визначенш домшок ¿/або продукт1в розкладу. Для визначення МКВ застосовували т1 ж пщходи, що й для МВ. Кр1м цього, вивчали лшшшсть — здатшсть методики (у межах д1апазону застосування) давати величини, прямо пропорцшш концентраци (кшькост1) анал1зовано! речовини у зразку.
Нами вивчалась робасшсть методу— здатшсть анал1тично! методики не зазнавати впливу малих заданих (контрольованих) анал1тиком змш в умовах виконання методики. Зокрема, вивчали стшюсть у час1 анал1тичних розчишв, час екстракцп тощо. Виявили, що на результата дослщжень можуть впливати: р1зниця в досвда анал1тик1в; умови навколишнього середовища (температура, волопсть), реактиви (р1зш постачальники). Отримаш даш подано в таблиц! 1.
Таблиця 1
Даш валщування кшьюсного визначення специф1чно*1 конструкцй' гена со¥
лшн СТ8 40-3-2
Показ ники Масова частка (%)
0,1 0,3 0,5 1 5,0
Кшьшсть лабораторш, що приймали участь 2 2 2 2 2
Середне значения ГМО (вщхил в1д значения) 0,1 +6,1 0,3 +9,7 0,6 +20,0 1,1 +10,2 5,2 +16,3
Стандартний вщхил для иовторюваносп, 8 0,018 0,057 0,113 0,386 0,769
Межа иовторюваносп, г 0,052 0,112 0,278 1,672 1,894
Стандартний вщносний ввдхил для повторюваносп 0,018 0,086 0,145 0,186 0,865
Межа ввдтворюваносп, Я 0,051 0,187 0,538 1,764 2,678
Ввдносний стандартний ввдхил для ввдтворюваносп 12,6 14,4 14,9 11,2 11,1
Зведений валщацшний зв1т мютив ус1 даш, результати та оцшку вс1е! програми зВ., а також висновки та пропозици щодо удосконалення проведених дослщжень. Результати, як правило, подавали у вигляд1 звтв. Згщно з Настановою 42-01-2001, (п. 5.4.), було оформлено письмов1 методики та протоколи виконаних дш або зробленихвисновк1в зВ., що належать до них.
Висновки:
Проведено валщащю кшькюного методу виявлення вмюту ГМ джерела у дослщних зразках з внесениям дослвджуваних компоненте
264
(соевого шроту GTS 40-3-2) у кшькост1 0,1; 0,3; 0,5; 1,0; 5,0 % методом пол1меразно ланцюгово! реакци у реальному 4aci з використанням принцип 1в, викладених у ДСТУ ISO 21569-21570:2008.
Л1тература
1. Гризодуб А.И. Валидация спектрофотометрических методик количественного анализа лекарственных средств в соответствии с требованиями ГФУ // Фармаком. — 2002. — № 3. С. 26-28;
2. ДСТУ ISO 21570:2008 Продукта харчовг Методи виявлення генетично модифжованих оргашзм1в i продукта з 1хшм bmIctom. Кшькюний метод на ochobI анал1зу нуклешово! кислоти, Кшв.' Держспоживстандарт Украши, 2009. - С. 18, 24.
Summary
STATE SCIENTIFIC-RESEARCH CONTROL INSTITUTE OF VETERINARY MEDICAL PRODUCTS AND FODDER ADDITIVES THE VALIDATION OF THE QUANTITATIVE METHOD ON THE BASIS
OF NUCLEIC ACIDS' ANALYSIS FOR DETECTION OF THE
GENETICALLY MODIFIED OBJECTS AND GMOS COMPRISED
PRODUCTS
Authors have validated the method for GMO quantitation. As a result of research was determined and described following validation parameters: robustness, linearity and precision in the whole range of the method's application. Besides, there have been got results which are evidence of method's conformity to the modern criteria for quantification analytical procedures. These results allow impartially determinate content of genetically modified objects and GMOs comprised products.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Буцяк B.I.
265
