CC BY
22
УДК 578.5/.28:575.856.[543.054:543.635.28]
Назар Б.1., к.вет.н.1 Державный науково-дослгдный контрольный тстытут ветеринарных npenapamie та кормовых добавок, м. Лъвгв
ОСОБЛИВОСТ1 ПЩГОТОВКИ ПРОБИ ПРИ ВИЯВЛЕНН1ГЕНЕТИЧНО МОДИФ1КОВАНИХ ОРГАН13М1В IПРОДУКТ1В 3 IX УМ1СТОМ
Шдготовка пробы до анал1зу, пры вызначенш наявност1 генетычно модыфтованых оргашзм1в, е одным з найважлыв1шых emanie дослгдження тому що отрымання необх1дног к\лъкост1 нуклеиновых кыслот прямопропорцтно вплывае на юнцевыйрезулътат.
Вступ. Пщготовка проби до анал1зу е важливою i невщ' емною частиною багатьох анал1тичних метод1в визначення. Значна р1зномаштшсть i постшно зростаюч1 вимоги до метод1в розкладу дослщжуваних проб зумовили розробку численних cnoco6iB пщготовки об'ект1в до анал1зу та створення спещально! апаратури. «Якють» ДНК залежить вщ середньо! довжини екстрагованих молекул ДНК, х1м1чно! чистоти i структурно! цшкносп послщовност1 ДНК та подвшно! cnipani (наприклад, внутр1шньоланцюгове з'еднання м1ж основами ДНК, одноланцюгов1 розриви, nepexpecHi з'еднання з полюлом, гемшом тощо). KpiM того, так1 змши часто залежать вщ послщовност1 i тому невипадково розподшяються за вЫм геномом. Метою метод1в видшення нуклешово! кислоти е забезпечення необхщно! ix кшькост1 для подальших анал1зу.
Лаборатори держав-члешв GC, яю виконують щ анал1зи повинш бути акредитоваш вщповщно до EN ISO/IEC 17025/1999 або сертифковаш вщповщно до визначено! програми, та повинш регулярно брати участь у програмах на перев1рку квал1ф1каци, як1 оргашзовуються або координуються державно та м1жнародно-визнаними лаборатор1ями та/або державними, м1жнародними оргашзащями [1-3].
Анал1тичне дослщження проб повинно проводитись згщно i3 загальними лабораторними та процедурними вимогами Свропейського Стандарту prEN ISO 21571:2008 або нацюнального стандарту ДСТУ ISO 24276.2008.
Метою статт! е анал1з науково-практично! л1тератури з проблеми пщготовки проб до анал1зу на визначення ГМО.
Матер1али i методи. Важливим етапом у пщготовщ проби до анал1зу е пщготовка дослщного зразка. Змшш характеристики (наприклад, волога) i методи обробляння можуть вплинути на кшьюсть i яюсть ДНК, видшено! 3i зразка. Тому характеристики цього методу видшення (MB) ДНК залежать вщ природи матер1алу.
1 Науковий консультант - д. вет. н., професор, член-кор НААН 1.Я. Коцюмбас Назар Б. I., 2012
124
Потр1бно зробити все можливе, щоб зразок для випробовування був «статистично достов1рним представником» лабораторного зразка.
Зразок для випробовування повинен бути достатньо! маси та м1стити достатню кшькють подр1бнених частинок (наприклад, 3000 частинок за меж1 виявлення MB 0,1%), щоб бути «статистично достов1рним представником» лабораторного зразка (ISO 21569). 1з практичних/техшчних причин маса зразка не повинна перевищувати 2 грами.
MB ДНК i3 зразка для випробовування масою вщ 200 до 500 мг, е адекватними для зразюв i3 високим умютом ДНК (наприклад, мелене зерно, борошно). Однак, для деяких зразюв, що м1стять дуже малу кшькють деградовано! ДНК, кшьюсть видшено! для анал1зування ДНК може бути недостатньою. У таких випадках масу зразка для випробовування може бути збшьшено i в два рази.
Видшення ДНК проводять принаймш з двох проб для випробовування.
Збер1гання еталонного матер1алу, стандарт1в i зразюв для випробовування треба здшснювати так, щоб зберегти 6ioxiMi4Hi параметри, необхвдш для анал1зування.
Yci операци щодо готування зразк1в (наприклад, подр1бнення, гомоген1зац1я, розпод1л, суш1ння) треба проводите зг1дно i3 процедурами, описаними в ISO 24276, щоб уникнути будь-якого можливого забруднення зразка чи зм1ни його структури.
Перед зменшенням i вид1ленням зразка для випробовування лабораторш зразки мають бути достатньо однорщними.
Зразки в р1дкому сташ ретельно збовтують, щоб зб1льшити р1вень гомоген1зац11 продукту. Якщо продукти неоднорщш, так1 як неочищена ол1я, перев1ряють, щоб 3i ctIhok емкост1 було повн1стю видалено осад.
Тверд1 зразки, яю не можна легко суспендувати, необх1дно подр1бнити для зменшення po3MipiB частинок i/або для полегшення процесу вид1лення ДНК. У цьому pa3i увагу необх1дно звернути на розм1ри частинок. Зразок для випробовування, з якого вид1ляють ДНК, мае м1стити необх1дну к1льк1сть частинок. Обладнання для подр1бнення i гомоген1зац11 треба ретельно очищувати й обирати так, щоб забезпечити бажану к1льк1сть частинок i розпод1л розм1ру частинок у межах зразка для анал1зування, як зазначено в ISO 21568.
Тверд1 чи клейк1 харчов1 продукти й Ti, що мають високий лшщний ум1ст, важко подр1бнювати до бажано! величини частинок за один етап. Тому вид1лення ДНК необх1дно доповнювати ще к1лькома процедурами, такими як видалення л1п1д1в, використовуючи для цього екстракц1ю гексаном п1сля подр1бнення та заморожування чи висушування субл1мац1ею перед подр1бненням.
Для полегшення процесу подр1бнення клейких або в'язких продукт1в застосовують один i3 таких cnoco6iB оброблення в1дпов1дно до властивостей зразка:
1) нагр1вання до температури 40 °С;
125
2) розчинення у певнш рщиш, наприклад, у вод1;
3) заморожування до температури мшус 20 °С або нижче.
Гомогешзують увесь лабораторний зразок I вщбирають дв1 порци для
випробовування, враховуючи можлив1 розведення чи концентрування. Пщ час подр1бнення/гомогешзаци необхщно вживати заход ¿в, щоб не допустити нагр1вання зразка, оскшьки це може негативно вплинути на яюсть ДНК. Необхщно уникати технологш ¿з високим ризиком перехресного забруднення (наприклад, комбшоване використання рщкого азоту I вапняного розчину).
Якщо наявш ешь, специ, цукрова пудра та/або шш1 речовини, яю можуть потенцшно вплинути на екстрагування чи метод анал1зування, необхщно розглянути можливють застосування етатв очищения вщповщно до обраного методу. Наприклад, у зразках з багатокомпонентними матер1алами може бути ввдбрано цшьовий зразок для видшення ДНК (наприклад, пашрування з рибних паличок).
Яюсть I результати видшення нуклешово! кислоти, екстраговано! згщно з цим методом з певного зразка, повинш мати повторювашсть I вщтворювашсть за умови, що в зразку наявна достатня кшьюсть нукле!ново1 кислоти для видшення.
Для того щоб отримати високоочищену ДНК, бажано видшити:
1) полкахариди (пектин, целюлозу, замшник целюлози, крохмаль, згущувач1 тощ о), використовуючи оброблення ферментами (пектиназою. целюлазою, а-амшазою) або екстрагування оргашчними сполуками (СТАБ/хлороформ);
2) РНК та/або бшки, використовуючи вщповщш оброблення. Наприклад, ферментативне оброблення за допомогою РНК-ази 1 протешази, вщповщно:
3) лшвдш частки, використовуючи, наприклад, ферментативне оброблення чи розчинники (п-гексан);
4) сол1, яю використовують у буферному розчиш для л1зису, яю можуть впливати на наступне анал1зування тощо.
Для твердих або сухих зразюв об'ем буферного розчину для л1зису повинен бути таким, щоб ДНК могла розчинитися.
Якщо для полегшення видшення ДНК пщ час процесу осадження необхщно використати ствосаджувальну з ДНК речовину, таку як глжоген, пол1етиленгл1коль або т-РНК, та вона не повинна м1стити пом1тний р1вень нуклеаз чи шпб1тор1в/конкурент1в ПЛР I не мати жодно! под1бно! послщовност1 з дослщжуваною.
У раз1 використання люфшьних сушарок для висушування ДНК, отримано! осадженням, необхщно враховувати ризик перехресного забруднення,
Додаткове суспендування зумовлюе додаткову руйнацш ДНК. Найкраще збер1гати ДНК у висушеному сташ.
126
Пщ час застосування нового типу видшення ДНК або в pa3i використання одного з метод1в для ново! матриц!, необхщно, використовуючи обрану процедуру, оцшити потенцшну яюсть i цшсшсть екстраговано! ДНК.
Визначення кшькост1 ДНК можна здшснювати ф1зичним (вим1рювання спектрально! поглинально! здатност1 на певнш довжиш хвил1), ф1зико-х1м1чним (штеркалящя або флуоресцентш м1тки), ферментативним (виявлення бюлюмшесценци) методами або за допомогою кшьюсно! ПЛР. Останнш метод особливо придатний для багатокомпонентних матер1ал1в або для зразк1в ¿з низьким ум1стом ДНК, або для анал1зування частково деградовано! ДНК.
Висновок: Отже, для отримання «яюсно!» ДНК, котра необхщна в подальшому для И щентифжаци, необхщно дотримуватись вимог MB, залежно вщ природи зразка для анал1зу.
Л1тература
1. Бок Р. Методы разложения в аналитической химии / Р. Бок. - М.: Химия, 1984. - 432 с.
2. Директива £С № 90/219/GC "Про роботу з ГМО та контролюванш умов". - Режим доступу : // http://europa.eu.int/comm/agriculture/publi/gmo/ law/index_32.html.
3. ДСТУ ISO 21571:2008 Методи виявлення генетично модифжованих оргашзм1в i продукт1в з !хшм вмктом (екстрагування нуклешових кислот).
4. ISO 21569 Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods.
Summary B. I. Nazar, [email protected] State Scientific-Research Control Institute of Veterinary Medical Products
and Fodder Additives FEATURES OF SAMPLE PREPARATION FOR DETECTION OF GENETICALLY MODIFIED ORGANISMS AND PRODUCTS OF THEIR
CONTENT
Preparing the sample for GMO determination analysis is one of the most important stage of research, as getting the required quantity of nucleic acids directly reflects on the final result.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Параняк Р.П.
127
