CC BY
109
БИОТЕРАПИЯ
А.В. Алясова, Р. Г. Пегов, Е.М. Михайлова, В. В. Новиков,
А. Ю. Барышников
Содержание растворимой формы молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком молочной железы и легкого
1 Нижегородская государственная медицинская академия 2Нижегородский областной онкологический диспансер 3Нижегородская областная клиническая больница 4ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 5ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Цель исследования. Охарактеризовать содержание растворимых молекул HLA I класса в сыворотке крови больных раком легкого.
Материалы и методы. Под наблюдением находились 356 больных в возрасте 35-65 лет с гистологически подтвержденным диагнозом рака молочной железы (300 женщин) и раком легкого (56 человек). Контрольную группу составили 53 донора, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными. Для определения в сыворотке крови относительной концентрации растворимых молекул HLA I класса использовались моноклональные антитела (МКА), направленные против белков, составляющих антигены гистосовместимости I класса: МКА ИКО-53 против альфа-цепи молекул гистосовместимости и МКА ИКО-216 против ßi-микроглобулина. Полученные результаты представлены в условных единицах (U/ml). Статистическая обработка материала осуществлялась с помощью компьютерной программы Statgraphics plus 5.1 for Windows.
Результаты. Начало роста опухоли и диссеминация рака молочной железы сопровождаются достоверным увеличением концентрации растворимых молекул HLA I класса (sHLA-I) в сыворотке крови больных (1236,80±103,0 U/ml и 1238,4±97,4 U/ml соответственно, р<0,05) по сравнению с контрольной группой (1019,6±30,0 U/ml). Сывороточная концентрация молекул sHLA-I зависела от гистологического строения опухоли, мультицентричности роста новообразования, локализации отдаленных метастазов. Мастэктомия и лучевая терапия достоверно не влияли, а полихимиотерапия способствовала снижению содержания молекул sHLA-I в сыворотке крови больных, обеспечивая нормализацию их уровня у пациенток, достигших стойкой ремиссии заболевания. Развитие рецидива рака молочной железы или прогрессированием опухолевого процесса на фоне лечения сопровождалось повышением сывороточного содержания молекул sHLA-I (1371,38±113,74 U/ml и 1703,62±380,58 U/ml соответственно). Развитие IB, IIA, IIIА стадий рака легкого сопровождалось достоверным уменьшением содержания молекул sHLA-I в сыворотке крови больных (493,21±128,66 U/ml, 552,90±192,25 U/ml и 564,40±138,71 U/ml соответственно, р<0,05) относительно показателей здоровых лиц. Сывороточная концентрация молекул sHLA-I снижалась в случаях локализации очагов поражения в лимфатических узлах корня легкого (656,40±169,56 U/ml, р<0,05) или в средостении (583,16±159,27 U/ml, р<0,05), но достоверно возрастала при появлении отдаленных метастазов (1485,0±111,89 U/ml, р<0,05). Различные морфологические варианты строения опухоли не различались по сывороточной концентрации молекул sHLA-I.
Выводы. Таким образом, течение опухолевого процесса может сопровождаться не только повышением сывороточного содержания растворимых молекул HLA I класса. По-видимому, выявленные различия отражают особенности формирования иммунного ответа у больных различными видами злокачественных новообразований.
Н. Ю. Анисимова, М. В. Киселевский Воздействие гипертермии на физиологическую активность перевиваемых линий опухолевых и нетрансформированных клеток in vitro ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Цель исследования. Экспериментальное обоснование оптимальных режимов сочетанного применения локальной гипертермии и химиотерапии (ГТ) с адоптивной иммунотерапией у онкологических больных.
Материалы и методы. Оценивалась жизнеспособность перевиваемых линий опухолевых К-562 (эритромиелоидный лейкоз человека), MCF-7 (рак молочной железы человека), SCOV3 (рак яичников человека), и эмбриональных VERO (клетки почки зеленой африканской мартышки), КСТ (клетки эндотелия сосудов теленка) и ЛЭК (клетки легкого эмбриона коровы). Суспензию клеток в питательной среде RPMI-1640 прогревали в течение 2 ч при температуре 41-50 °С (в контрольной серии - при 37 °С). Процентное содержание физиологически активных клеток в культуре определяли с помощью МТТ-колориметрического теста. Для оценки пролиферативной клеточной активности культуры тест повторяли через 2 сут. Лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) получали при инкубации мононук-леаров крови доноров с ИЛ-2. При оценке цитотоксичности ЛАК на интактные и подвергшиеся ГТ клетки соотношение эффекторы/мишени составляло 5:1.
Результаты. Представленные результаты позволили установить, что достоверное (р<0,05) уменьшение физиологической активности на опухолевых клетках отмечается только при температуре не ниже 45 °С, на нетрансформированных клетках аналогичный эффект отмечался при температуре 47^8 °С. Статистически достоверное снижение пролиферативной активности (р<0,01) опухолевых и нетрансформированных клеток отмечалось при 44 °С и 45 °С соответственно. Было исследовано изменение цитотоксической активности ЛАК крови человека по отношению к подвергшимся воздействию ГТ клеткам К-562. Было выявлено, что цитотоксичность ЛАК возрастает с 37 % до 67-70 % (р<0,01) после прогревания опухолевых клеток в течение 2 ч при 44-45 °С.
Выводы. Таким образом, ГТ достоверно подавляет пролиферацию опухолевых клеток только при температуре не менее 44 °С. Температурные режимы, рекомендованные для клинической практики (41—43 °С), не оказывают существенного влияния на жизнеспособность опухолевых клеток в культуре. Однако ГТ (44-45 °С) значительно увеличивает их чувствительность к цитотоксическому воздействию ЛАК. Не-трансформированные (эмбриональные) клетки (КСТ, ЛЭК, VERO) менее чувствительны к воздействию гипертермии, чем опухолевые. Значительное снижение их физиологической активности наблюдалось только при температуре >47 °С, а угнетение способности к пролиферации наблюдалось после прогревания клеточной взвеси при >45 °С.
A.Ю. Барышников, О.В. Короткова, Т.Н. Заботина,
B.М. Шелепова, С.А. Хатырев, З.И. Токарева, З.Г. Кадагидзе Исследование
клинико-иммунологических параметров больных злокачественной меланомой кожи
ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Меланома представляет наибольший интерес с точки зрения использования биологических методов терапии. Неоднозначное течение заболевания способствует поиску современных иммунологических маркеров, коррелирующих с клиническим течением и прогрессированием заболевания. Показано, что в процессе развития меланомы иммунная реакция играет определяющую роль, которая может приводить как к подавлению опухолевого роста, так и к его активации. Особое значение в негативной иммунорегуляции имеют Т-регуляторные клетки с фенотипом CD4+CD25+ (Трег), а также лимфоциты с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (NKT-подобные клетки).
Цель исследования. Изучение динамики супрессорных субпопуляций у больных меланомой.
Материалы и методы. С помощью многопараметрового метода проточной цитофлюориметрии был изучен иммунофенотип лимфоцитов периферической крови больных с первично выявленной меланомой кожи до и после операции, с распространенной стадией заболевания, а также больных в динамическом наблюдении без клинических признаков заболевания. В качестве контроля изучался фенотип лимфоцитов здоровых доноров.
Результаты. Было выявлено, что у первичных больных с локализованной формой меланомы и у больных без клинических проявле-
ний болезни количество ЫКТ-клеток соответствовало показателям доноров. В то же время у больных с локализованной формой меланомы и с метастатическим процессом обнаружен более высокий уровень Трег-клеток по сравнению с контрольной группой. При удалении первичного очага количество СD4+CD25+ клеток уменьшалось вдвое. Кроме того, в этой группе пациентов выявлена положительная корреляция со снижением уровня белка 8100, который экспрессируется в нервных клетках головного мозга и опухолях нейроэктодермального происхождения, в частности, злокачественной меланоме. В группе динамического наблюдения без клинических признаков заболевания повышение уровня ЫКТ клеток зафиксировано в 16 % случаев, в дальнейшем у этих больных были выявлены метастазы. У пациентов после удаления первичного очага и получающих в дальнейшем цитокинотерапию при раннем прогрессировании зафиксировано нарастание Трег и ЫКТ-подобных лимфоцитов.
Выводы. Мониторинг супрессорных клеток необходим для контроля за эффективностью лечения и клиническим состоянием больного.
К.А. Барышников, И.Н. Михайлова, О.С. Бурова,
М.И. Лукашина, Л.В. Демидов Оценка иммунного статуса
при терапии геномодифицированной вакциной
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Меланома считается иммунозависимой опухолью, поэтому для лечения используются препараты, влияющие на различные звенья специфического противоопухолевого иммунитета. В институте Биологии гена РАН выделен и охарактеризован ген \ag-l. Он реализует иммуномодулирующее действие посредством усиления хемотаксиса и ускорения созревания дендритных клеток. Была проведена первая фаза клинических испытаний. Во время вакцинотерапии проводились изучения изменения иммунного статуса.
Цель исследования. Анализ изменений иммунной системы в процессе вакцинотерапии.
Материалы и методы. Больные получали 2,0х106 клеток внутри-кожно, 6-8 инъекций (плечо, лопаточную, паховую, околопупочную области), с интервалом раз в 1-2 нед. Забор крови для исследования иммунного статуса проводили до вакцинации и далее перед каждой последующей вакцинацией. Экспрессию антигена определяли в реакции прямой поверхностной иммунофлюорисценции с помощью панели моноклональных антител производства ООО НПЦ МедБиоСпектр.
Результаты. Анализ был проведен у 12 пациентов, которые получили от 2 до 31 вакцинаций. Для статистического анализа мы провели сравнение показателей до вакцинации и в момент наивысшего иммунологического ответа. Произошли следующие изменения: экспрессия CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD11b, CD38+ и CD56 клеток существенно не изменялась. Было обнаружено статистически значимое повышение экспрессии активационных маркеров. Так процент CD25+ клеток увеличился в 2 раза с 5 до 10 % (р=0,05). Экспрессия рецептора транс-феррина (CDl1+) клеток повысилась с 4,14±3,31 до 1,81±2,88 (р<0,02), содержание CD95+ клеток увеличилось с 45 до 56 (р<0,02). Исследование методом двойной метки продемонстрировало повышение процента клеток, экспрессирующих CD38PE/CD4F анигены (р=0,02). Изменения субпопуляции ЫК-клеток CD11b PE/CD16 F, CD11b PE/CD8 F, CD11b PE/CD56 F были статистически не значимы, что связано, вероятно, с малой численностью групп. Процент содержания В клеток не менялся.
Выводы. Проведенное исследование показало, что в процессе вакцинотерапии вакциной аллоген происходит повышение экспрессии активационных антигенов на Т-клетках.
Н.П. Велижева, И.Ж. Шубина, М.В. Киселевский €В4+/€В25+ Т-регуляторные клетки и адоптивная ИЛ-2/ЛАК-терапия злокачественных опухолей
ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Невысокая эффективность активированных интерлейкином-2 (ИЛ-2) лимфоцитов при лечении онкологических больных в настоящее время связывается с субпопуляцией супрессорных CD4+/CD25+ Т-регуляторных клеток. Вместе с тем в литературе отсутствуют данные о возрастании данной субпопуляции в культуре активированных лимфоцитов с высокой степенью цитотоксичности.
Поэтому целью работы было изучение роли CD4+/CD25+ Т-регуляторных клеток в модуляции активности стимулированных ИЛ-
2 лимфоцитов.
Материалы и методы. Исследование проводили с использованием метода магнитной сепарации CD4+/CD25+ Т-регуляторных клеток. Уровень цитотоксической активности лимфоцитов определяли МТТ-тестом на НК-чувствительной линии эритробластного лейкоза человека К-562 и на линии В-клеточного лейкоза Raji.
Результаты. В популяции лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) с увеличением сроков инкубации с ИЛ-2 возрастает содержание CD4+/CD25+ Т-клеток. Сравнительный анализ цитотоксической активности ЛАК, используемых для адоптивной биотерапии, и ЛАК после удаления субпопуляции CD4+/CD25+ Т-лимфоцитов показал, что в отсутствии CD4+/CD25+ Т-клеток ЛАК обладают более высокой степенью цитотоксичности по отношению к линиям опухолевых клеток (85 % для К-562 и 79 % для Raji). Значительно ниже была цитотоксическая активность ЛАК, коинкубированных с CD4+/CD25+ Т-лимфоцитами. Лизису под воздействием этих ЛАК подвергается не более 39 % и 27 % клеток от исходного числа, что почти в 2 раза меньше спонтанной киллерной активности свежевыделенных мононуклеарных лейкоцитов крови (63 и 58 % соответственно).
Выводы. Таким образом, для повышения эффективности адоптивной ИЛ-2/ЛАК-терапии представляется перспективным удаление субпопуляции CD4+/CD25+ Т-клеток из культуры активированных лимфоцитов. С этой целью предлагается использовать современный метод магнитной сепарации, позволяющий с высокой степенью достоверности (чувствительность метода составляет 9599 %) получать определенные субпопуляции клеток.
А.Ф. Лазарев1, А.Г. Котельников2, К.Г. Мамонтов1,
А.В. Белоножка1, А.А. Карпенко1 , А.А. Пономаренко1,
Е.Л. Секержинская 1 , В.Д. Петрова1 , С.А. Терехова1 Первый опыт
неоадъювантной регионарной химио- и биотерапии в лечении метастазов колоректального рака в печень
1АФ ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, ГУЗ «Алтайский краевой
онкологический диспансер», Барнаул
2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Метастазы колоректального рака в печень являются частой причиной смертности данных больных в ближайшие 2 года. Химиотерапия и хирургическое удаление метастазов практически не влияют на выживаемость. Нами разработана методика неоадъю-вантной внутриартериальной химио- и биотерапии для повышения эффективности лечения этих больных.
Материалы и методы. 26 пациентам было проведено комбинированное лечение по поводу колоректального рака с метастазами в печень. Солитарные и единичные метастазы в печени диагностированы у 10 больных, множественные - у 16; билобарное поражение печени - у 14. 4 пациентам были проведены 3 курса неоадъювантной химиотерапии внутриартериально через печеночную артерию в режиме FOLFOX-6 с последующей внутриар-териальной 3-ч инфузией авастина в дозе 5 мг/м2. 22 больным было проведено то же лекарственное лечение, но без авастина. Спустя месяц после лечения всем пациентам были выполнены операции в объеме от экономной резекции печени до расширенной гемигепатэктомии. В последующем пациентам проводилась аналогичная химио- и биотерапия.
Результаты. Эффективность дооперационного лекарственного лечения: полный эффект - 0; частичный - 15,4 % (у 4 больных), стабилизация - 53,8 % (у 14 пациентов), прогрессирование - 30,8 % (у 8 больных). Послеоперационные осложнения развились у 11 больных, 1 умер. У больных, получавших до операции авастин, послеоперационных осложнений не отмечено. 1 год пережили 100 %. 2-летняя выживаемость составила 61,0±18,0 % (Kaplan-Meier). Ни у одного из 4 пациентов, получавших авастин, не выявлено признаков прогрессирования.
Выводы. Неоадъювантная внутриартериальная химио- и биотерапия позволяет предупредить повторное метастазирование в ос-
тавшейся доле печени в ближайшие 2 года и не сопровождается повышением частоты осложнений, связанной с лечением.
М.И. Лукашина, Ю.В. Стукалов, А.В. Смирнова, Е.Ю. Колдаева, А.А. Козлов,
A.Ю. Барышников, Е.Ю. Григорьева Биологическая активность конструкций дендримеров
с антителами и рением-188 ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. В настоящее время перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний считается таргетная радиоиммунотерапия. Радиофармпрепараты нового поколения характеризуются высокой эффективностью, клинической и радиационной безопасностью. Такими свойствами, например, обладают фармпрепараты на основе дендримеров, которые могут стать универсальной системой доставки альфа- и бета-радионуклидов. Денд-римеры представляют собой молекулы сферической формы размером 5-10 нм, со множеством реакционноспособных групп для присоединения других молекул. Нами были получены и исследованы дендримеры нового класса, содержащие эпоксигруппы во внешней сфере и конструкции на их основе с моноклональными антителами (МАТ) и радионуклидами. В качестве радионуклида в конструкциях использовался рений-188.
Материалы и методы. Созданные конструкции исследованы на моделях in vitro. Моделями были выбраны линии SKOV-3 (рак яичника) и Jurkat (Т-лимфобластная лимфома). Количество клеток на лунку составило 200 000, количество МАТ на лунку - 20 мкл (ICO-25 - 4 мкг/мл, IC0-80 - 10 мкг/мл). Активность Rе-188 - 0,05 МБк.
Результаты. Были получены конструкции радионуклида Re-188 с дендримерами и МАТ - ICO-25 (MUC1), связывающимися с поверхностными рецепторами опухолевой клетки (К1), и конструкции радионуклида Re-188 (R-е) с дендримерами и анти-1С0-80 (CD5), которые после связывания со своим рецептором интернализуются (К2). В качестве контролей использовали чистую среду, к которой добавляли Re-188 и клетки, к которым также добавляли Re-188. Культивирование клеток в течение 0,5; 1; 3 и 6 ч в присутствии дендримера со связанным с ним Rе-188 показало 62-68%-ную гибель клеточной популяции. При культивировании клеток с К1 через 0,5 ч культивирования количество погибших клеток составило 84 %, через 1 ч - 90 % и далее существенно не менялось. При культивировании клеток с К2 количество погибших клеток через 0,5 ч составляло 57 %, через 1 ч - 98 % и далее не изменялось.
Выводы. Конструкция дендримера с Re-188 обладает цитотокси-ческим действием на клетки. При этом активность конструкций денд-ример - МАТ - Re-188 выше на 25-35 %, и максимальной активностью обладает конструкция К2. Таким образом, была подтверждена эффективность таргетной доставки поражающего агента Re-188 при помощи конструкции дендримера с МАТ.
B.М. Моисеенко, И.А. Балдуева
Иммунологические аспекты опухолевого роста и возможности вакцинотерапии
ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий», Санкт-Петербург
Разработка методов биотерапии для больных раком, основанных на иммунопатологических особенностях заболевания, с целью поиска новых подходов к лечению злокачественных опухолей является актуальным направлением исследований в современной клинической онкологии. Неуклонный рост частоты онкологических заболеваний, низкий уровень выживаемости у больных IV стадией заболевания, недостаточная эффективность традиционных методов лечения у этой категории больных обусловливает социальную значимость данной проблемы. В связи с этим понимание механизмов иммунобиологической защиты, исследование причин их несостоятельности и разработка методов коррекции представляет несомненный научный интерес.
Вместе с тем данные о взаимодействии опухоли с Т-лимфоцитами, NK- и NKT-клетками, дендритными клетками, макрофагами достаточно противоречивы. В отличие от ранних работ, в которых состоянию этих клеток отводилась ведущая роль в проти-
воопухолевом иммунитете, в работах последних лет более пристально изучаются возможные воздействия на иммунную систему с помощью специфических противоопухолевых вакцин. Эффективность неспецифической противоопухолевой иммунотерапии как одного из методов лечения злокачественного процесса рассматривается уже не только с точки зрения непосредственных цитотокси-ческих эффектов, но и с учетом иммуномодулирующих эффектов адъюванта антигенспецифических противоопухолевых вакцин. Выраженность таких эффектов зависит от многих параметров, характеризующих и сам вакцинный препарат, и клинико-биологические свойства опухоли, и состояние иммунной системы пациента с опухолью. Пока очевидно лишь, что различные иммунокомпетентные клетки неоднозначно реагируют на одни и те же вакцины, что, вероятно, и определяет иммуномодулирующие эффекты. По-прежнему актуальным остается выражение W. Woglom (1929): «Иммунизировать против рака так же трудно, как добиться отторжения правого уха, оставив левое».
В.М. Моисеенко, А.С. Жабина, А.Г. Иевлева, Е.Н. Соколенко, Ю.М. Улыбина, К.Г. Буслов, Е.Н. Суспицын,
А.В. Того, Е.Н. Имянитов Экспрессия маркеров чувствительности к цитостатикам в опухолях различных локализаций
ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий», Санкт-Петербург
Введение. Лечение рака обычно носит эмпирический характер и основано, скорее, на клинических данных, чем на понимании механизмов чувствительности к химическим агентам. В результате больные часто подвергаются воздействию высокотоксических препаратов и страдают от побочных эффектов в отсутствие каких-либо положительных результатов. Поэтому изучение экспрессии маркеров чувствительности к химиотерапии в опухолях различной локализации представляется актуальным для индивидуализации подходов и лечения.
Материалы и методы. В работу были включены парафиновые блоки первичной опухоли больных раком молочной железы, ободочной кишки, легкого. На данной панели новообразований рассмотрен спектр экспрессии ферментов DPD (дигидропиримидин-дегидрогеназа), Т8 (тимидилат-синтетаза), ТР (тимидин-фосфорилаза) и ERCC1. Экспрессия перечисленных генов измерялась посредством ПЦР в режиме реального времени.
Результаты представлены в таблице. В ней не учтены случаи с промежуточными значениями экспрессии._____________________
Показатели РМЖ РТК НМРЛ
n=29 n=78 n=29
DPD низкий 20 (69%) 46 (59%) 16 (55,2%)
высокий 7 (24,2%) 8 (10,3%) 13 (44,8%)
ТР низкий 10 (34,5%) 31 (40,3%) 11(39,3%)
высокий 14 (48,3%) 16 (20,8%) 14 (50%)
TS низкий 14 (48,3%) 27 (37%) 15 (51,7%)
высокий 11 (38%) 27 (37%) 14 (48,3%)
n=25 n=41 n=19
ERCC1 низкий 12 (48%) 18 (43,9%) 7 (36,8%)
высокий 10 (40%) 13 (31,7%) 9 (47,4%)
Выводы. Экспрессия маркеров в опухолевой ткани носит гетерогенный характер. Определение уровня DPD, TP, Т8, ERCC1 позволяет прогнозировать эффективность терапии фторпиримидина-ми и производными платины.
6
БИОТЕРАПИЯ
Л.А. Островская, Д.Б. Корман, М.М. Фомина, Н.В. Блюхтерова, В.А. Рыкова
Чувствительность экспериментальных тест-систем к противоопухолевому препарату мабтера
Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля РАН, Москва
Введение. Создание «таргетных» лекарственных средств на основе моноклональных антител к специфическим антигенам опухолевых клеток является одним из признанных направлений онкологических исследований. В современной клинической практике используется 4 моноклональных антитела различного механизма действия, 10 подобных препаратов находятся на различных этапах клинического изучения. Одним из таких лекарственных средств является препарат мабтера (ри-туксимаб), представляющий собой моноклональное антитело к трансмембранному антигену CD20, экспрессируемому на поверхности В-лимфоцитов. Основным показанием к применению препарата является В-клеточная неходжкинская лимфома всех форм. С целью разработки экспериментальных основ для создания новых более совершенных таргетных препаратов - аналогов моноклонального антитела мабтеры -проведено изучение пригодности ряда опухолевых моделей для доклинической оценки противоопухолевой эффективности препаратов типа мабтеры. Следует отметить, что в настоящее время отбор таргетных препаратов производится на основе испытания их цитотоксичности в отношении стабильных клеточных линий опухолей человека в условиях in vitro, а также при оценке их эффективности на некоторых моделях ксенографтов опухолей человека на мышах «nude» в условиях in vivo. Данные о пригодности перевиваемых опухолей животных для оценки противоопухолевого эффекта таргетных препаратов в литературе отсутствуют. Вместе с тем выявление среди перевиваемых опухолей животных моделей, чувствительных к терапевтическим моноклональным антителам, могло бы способствовать созданию новых эффективных таргетных препаратов за счет совершенствования методов их доклинического отбора и углубленного изучения.
Материалы и методы. Исследована эффективность препарата мабтера при различных схемах применения в отношении 6 моделей перевиваемых опухолей животных: лейкоз L1210, лейкоз Р388 (асцитная и солидная формы), карцинома легких Льюис, меланома В16, карцинома 755, аденокарцинома Акатол. Использован коммерческий препарат мабтера (ритуксимаб) производства фирмы «Roche», Франция, предоставленный Центром инженерной иммунологии биотехнологической компании «Био-кад». Препарат вводился внутрибрюшинно в суточных дозах 5 и 10 мг/кг при различных схемах применения - ежедневно, 5-кратно, либо 3- или 4-кратно с интервалом 7 сут между инъекциями. Применение препарата начиналось на следующие сутки после перевивки опухоли.
Результаты. Установлено, что изученные экспериментальные тест-системы, широко применяющиеся в доклинических исследованиях при отборе и углубленном изучении цитостатиков, проявляют различия в чувствительности к препарату мабтера. Торможение роста опухолей под влиянием мабтеры колеблется в пределах от 30 до 90 % по сравнению с контролем, изменяясь в зависимости от штамма опухоли и схемы применения препарата.
Выводы. Совокупность полученных данных позволяет рекомендовать солидные опухоли карциному 755 и меланому В16 в качестве моделей для доклинического отбора и изучения новых потенциальных таргет-ных препаратов на основе моноклональных антител - аналогов мабтеры.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта «Терапевтические антитела против маркерных белков онкотрансформирован-ных клеток» в рамках Программы фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах РАН «Биомолекулярная и медицинская химия» (раздел II.3. №10) за 2006-2007г.г. (Координатор Программы - академик Н.С.Зефиров).
О.П. Пузанова, Е.В. Степанова, О.С. Бурова,
Л.Ф. Морозова, И.Н. Михайлова, А.Ю. Барышников Иммуноцитохимический анализ экспрессии фактора роста эндотелия сосудов VEGF и его рецепторов VEGF R1/ Flt-1 и VEGF R2/Flk-1 перевиваемыми линиями меланомы человека ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и его рецептор второго типа (VEGFR-2) являются ключевыми регуляторными
молекулами, опосредующими неоангиогенез, инвазию и метастатическое распространение опухолей. Оценка экспрессии VEGF и его рецепторов является необходимым этапом при изучении регуляции проангиогенных факторов и особенностей иммунофенотипа опухолевых клеток. В ходе настоящей экспериментальной работы проведена оценка экспрессии VEGF, VEGF R1/ Flt-1 и VEGF R2/Flk-1 на клетках 17 линий меланомы человека.
Материалы и методы. После 3-дневного культивирования клеток исследуемых линий на стекле в питательной среде на основе RPMI-1640, при 37 °С, в атмосфере 5% СО2 проводили иммуноцитохимический анализ экспрессии VEGFR2/Flk-1, VEGFR1/Flt-1 и VEGF при окраске кроличьими поликлональными антителами специфичными к VEGFR2/ Flk-1, VEGFR1/ Flt-1 человека Neomarkers и мышиными поликлональными антителами специфичными к VEGF человека Dako, с использованием проявочной системы Dako Cytomation envision system-HRP (DAB). Интенсивность окрашивания (от + до +++) и количество окрашенных клеток в поле зрения (%) оценивали по отношению к неокрашенному контролю.
Результаты. 16 из 17 исследуемых линий экспрессируют VEGF R1/ Flt-1 и VEGF R2/Flk-1 молекулы: интенсивное окрашивание цитоплазмы и клеточной мембраны (+++, 73 % ± 3 ,4). При исследовании 11 из выше описанных линий выявлена экспрессия лиганда VEGF интенсивное окрашивание цитоплазмы (+++, 58 % ± 8,3). В одной линии клеток меланом, mel Ibr, выявлена экспрессия рецепторов VEGF R1/ Flt-1 и VEGF R2/Flk-1 значительно меньшей интенсивности (+, 60 %) и не выявлена экспрессия лиганда VEGF.
Выводы. Исследуемые линии меланомы человека характеризуются высоким уровнем экспрессии VEGF , VEGF R1/ Flt-1 и VEGF R2/Flk-1 молекул.
М.А. Рубцова, М.И. Лукашина, Л.Ю. Вишнякова,
Е.В. Огородникова, А.Ю. Барышников Дендритомы стимулируют пролиферацию лимфоцитов in vitro
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Одной из стратегий вакцинотерапии опухолей является использование гибридов дендритных и опухолевых клеток (дендритом). В них сочетаются антиген-презентирующая функция дендритных клеток и иммуногенная опухолевых клеток. Дендритные клетки (ДК) сохраняют способность захватывать, процессировать и презен-тировать антиген, а опухолевые клетки (ОпК) - пролиферировать и представлять антиген. Одним из характерных свойств адаптивного иммунного ответа является усиленная пролиферация клеточных клонов, успешно распознающих определенный антиген. Такую особенность клеток иммунной системы можно использовать для характеристики иммунного ответа на определенный антиген.
Цель исследования. Оценка пролиферативной активности лимфоцитов при стимуляции гибридными клетками.
Материалы и методы. Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли из лейкомассы здоровых доноров, полученной в отделении переливания крови с банком костного мозга (ГУ РОНЦ РАМН) в градиенте плотности фекол-урографин (С=1,077). Незрелые ДК получали из МПК, которые культивировали в течение 5-6 сут при 37 °С и 5% СО2 в соответствующей среде. ДК сливали с облученными при 100 Гр ОпК линии melKor. МПК окрашивали CFSE согласно инструкции производителя. Окрашенные МПК смешивали с гибридными клетками в соотношении 5:1 и 10:1 соответственно. Негативным контролем служили окрашенные не стимулированные клетки, позитивным контролем были клетки, стимулированные конконовалином А (КонА) (5 мкг/мл). Для стимуляции использовали гибридные клетки через 24; 48 и 72 ч после слияния, культивировали в течение 7 дней (37 °С, 5%СО2), после чего отмывали, лизировали остатки эритроцитов, учет реакции проводили на проточном цитофлюориметре.
Результаты. Дендритомы через 24 и 48 ч после слияния активируют пролиферацию МПК при соотношениях 1:5 и 1:10 в течение 7 сут. При активации дендритомами МПК проходят большее количество делений по сравнению с МПК стимулированными конконовалином А.
Выводы. Дендритомы способны активировать пролиферацию лимфоцитов in vitro.
Н.М. Сураева1, Е.А. Воротеляк2, М.И. Прокофьев3,
А.В. Самолов3, А.В. Васильев2, А.Ю. Барышников1 Получение, характеристика и долгосрочное культивирование примордиальных половых клеток кур }ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2Институт биологии развития РАН, Москва 3Научно-исследовательский институт кролиководства и пушного звероводства, Московская область
С целью разработки метода долгосрочного культивирования плю-ропотентных гонадных первичных половых клеток (ППК) для получения трансгенных химерных эмбрионов кур был изучен ряд факторов, влияющих на этот процесс. ППК от индивидуальных эмбрионов птицы культивировали в течение 2 мес. В процессе долгосрочного культивирования ППК сохраняли свои специфические характеристики, а именно, большой размер, наличие многочисленных гранул и позитивное окрашивание на гликоген. Были выявлены 2 лимитирующих фактора, влияющих на процесс пролифирации: смена среды и сворачивание фидерного монослоя стромальных клеток. Для преодоления указанных негативных явлений ППК были пассированы на STO фидерный монослой до сворачивания стромального монослоя на 5-7-е сут культивирования и после сворачивания, когда ППК вновь начинали активно делиться на оставшихся стромальных клетках. Через 5-6 сут ППК активно делились на STO монослое, но не дольше, так как монослой к этому времени требовал замены. Добавление кондиционной среды, полученной после культивирования STO-клеток, оказывало негативное воздействие на рост ППК. Нами также было отмечено, что добавление куриной сыворотки благотворно влияет на скорость роста ППК и ответственно за суспезионной характер культуры, тогда как без указанной сыворотки ППК прикрепляются к фидерному слою.
И.Ж. Шубина, И.О. Чикилева, О.С. Жукова, Н.В. Малахова, М.В. Киселевский
Индукция активированных лимфоцитов отечественными препаратами различного происхождения
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Цитотоксические лимфоциты и натуральные киллеры играют ключевую роль в системе противоопухолевого иммунитета. Рядом исследований было показано, что наряду с ИЛ-2 способностью активировать лимфоциты обладают иммуномодуляторы различной природы. В частности, подобные свойства при исследованиях in vitro и in vivo были обнаружены у колониестимулирующих факторов, мие-лопептидов, бактериальных и синтетических препаратов.
Цель исследования. В настоящей работе была исследована возможность активировать лимфоциты периферической крови человека
с помощью иммуномодуляторов: Г-КСФ, миелопептида (МП-2), вакцины иммуновак ВП-4 и препарата галавит.
Материалы и методы. Мононуклеарные лейкоциты (МНЛ) выделяли из периферической крови здоровых доноров по стандартной методике на одноступенчатом градиенте фиколла-урографина. МНЛ культивировали в полной среде RPMI в присутствии различных активационных индукторов: ИЛ-2 (10 000 МЕ), Г-КСФ (100-1000 МЕ), миелопептид МП-2 (0,05-0,00005мкг/мл), иммуновак ВП-4 и галавит (1-10 мкг/мл) и без добавления агентов (контроль) в течение 3 сут при 37 °С, СО2 4,5%. По окончании инкубации проводили морфологический и иммуно-фенотипический анализ полученных популяций лимфоцитов. Цитотоксическую активность лимфоцитов определяли с помощью МТТ-теста по отношению к опухолевым клеткам миелобластного лейкоза человека К-562, немелкоклеточного рака легкого А-549, рака яичников SCOV3 и рака молочной железы MCF 7.
Результаты. Все исследованные иммуномодуляторы вызывали пролиферацию лимфоцитов, хотя и в меньшей степени, чем ИЛ-2, при этом в культурах появлялись активирванные формы типа иммунобластов и пролимфоцитов. В исследованном диапазоне концентраций все испытанные препараты усиливали спонтанную НК-активность МНЛ периферической крови здоровых доноров по отношению к линии опухолевых клеток К562. Исследованные препараты также повышали цитотоксический потенциал МНЛ здоровых доноров по отношению к опухолевым клеткам различного гистогенеза. Также как и ЛАК, активированные иммуномодуляторами МНЛ обладали наиболее высокой киллерной активностью по отношению к линии клеток немелкоклеточного рака легкого А-549. Исследование иммунофенотипа активированных лимфоцитов, генерированных из МНЛ периферической крови здоровых доноров, позволило установить, что данные клетки активно экспрессируют на своей мембране активационные молекулы (CD38), молекулы главного комплекса гистосовместимости
II класса (HLA-DR), антигены натуральных киллеров (CD16, CD56, CD57), а также характеризуются высоким уровнем экспрессии молекул адгезии (CD58). Показатели экспрессии указанных маркёров на поверхности активированных исследованными препаратами лимфоцитов значительно выше, чем у ин-тактных мононуклеарных лейкоцитов крови.
Выводы. Результаты генерации ex vivo активированных лимфоидных элементов с высоким уровнем цитотоксичности при помощи отечественных иммуномодуляторов могут иметь важное значение для клинической и экспериментальной онкологии, где в связи с развитием методов адоптивной клеточной иммунотерапии возникает потребность в клетках, которые могут быть использованы для получения противоопухолевых вакцин и активированных цитотоксических лимфоцитов.
