CC BY
117
Ирина Олеговна Чикилева1, Надежда Павловна Велижева1,
Ирина Жановна Шубина1, Константин Сергеевич Титов2,
Михаил Валентинович Киселевский1
СОДЕРЖАНИЕ Т-РЕГУЛЯТОРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ CD4+CD25+Foxp3+ В ПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОКИН-АКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ
1 Лаборатория клеточного иммунитета НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 Отделение биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, лаборатория клеточного иммунитета, Шубина Ирина Жановна; e-mail: irinashubina@mail.ru
Изучено содержание популяции естественных Т-регуляторных клеток CD4 + CD25 + Foxp3+ в культуре лимфокин-активированных киллеров онкологических больных и здоровых доноров в зависимости от сроков инкубации мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с интерлейкином-2.
Показано, что при стандартных режимах (в течение 2—3 сут) генерации лимфокин-активированных киллеров из мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров и онкологических больных увеличение количества Т-регуляторных клеток не наблюдается. Увеличение содержания Т-регуляторных клеток CD4 + CD25 + Foxp3+ отмечается при длительных сроках культивирования в популяции лимфокин-активированных киллеров онкологических больных. С учетом способности Т-регуляторных клеток подавлять активность натуральных киллеров для повышения эффективности иммунотерапии представляется целесообразным удаление из лимфокин-активированных киллеров Т-клеток CD4 + CD25+ либо выделение из активированных лимфоцитов чистой культуры натуральных киллеров с использованием иммуномагнитной сепарации.
Ключевые слова: естественные Т-регуляторные клетки CD4 + CD25 + Foxp3 + , транскрипционный фактор Foxp3, лимфокин-активированные киллеры, метод иммуномагнитной сепарации, адоптивная иммунотерапия.
Т-клетки CD4 + CD25+ составляют 5—10% от периферических T-лимфоцитов CD4+ и участвуют в поддержании гомеостаза периферической аутотолерантности посредством супрессии аутореактивных Т-клеток [6]. В настоящее время считается, что супрессорную функцию оказывает фракция CD4 + CD25+ Т-клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор Foxp3 [4].
Т-регуляторные клетки (Трег) вызывают угнетение литической и секреторной функции натуральных киллеров (НК) in vitro и контролируют их пролиферацию. В условиях гомеостаза удаление T-клеток CD4 + CD25 + вызывает резкое увеличение темпов пролиферации НК и их цитотоксической активности. Однако из этого не следует, что гомеостаз НК зависит только от функциониро-
© Чикилева И. О., Велижева Н. П., Шубина И. Ж., Титов К. С., Киселевский М. В., 2008 УДК 616.155.32:615.37
вания Трег и что любое изменение их численности может привести к нарушению функциональной активности НК. Тем не менее активность НК обратно пропорциональна содержанию Трег у онкологических больных, а удаление Трег может стимулировать НК-опосредованный лизис опухолевых клеток ex vivo [3].
Данные наблюдения представляются весьма важными для иммунотерапии, поскольку лимфокин-активированные киллеры (ЛАК), как и НК, оказывают избирательное цитотоксическое действие на трансформированные клетки. Невысокая эффективность активированных интерлейкином-2 (ИЛ-2) лимфоцитов при лечении онкологических больных может быть связана с субпопуляцией супрессорных Трег CD4 + CD25 + Foxp3 + , активируемых ИЛ-2 одновременно с НК. Это обусловливает различие эффектов ИЛ-2 в регуляции иммунологической толерантности и активации [1; 2; 7; 8]. Высокий уровень экспрессии молекулы
CD25 на поверхности Трег позволяет им успешно конкурировать за ИЛ-2. Механизм, посредством которого ИЛ-2 поддерживает функцию Трег CD4 + CD25 + , связывают с регуляцией экспрессии транскрипционного фактора супрессии Foxp3 [4; 5]. Несмотря на активное исследование роли Трег в подавлении противоопухолевого иммунного ответа, в литературе отсутствуют однозначные данные о содержании Трег в культуре ЛАК, обладающих высокой цитотоксичностью. Поэтому целью настоящей работы явилось изучение содержания Трег CD4 + CD25 + Foxp3+ в популяции ЛАК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мононуклеарные лейкоциты периферической крови (МНЛ) 10 здоровых доноров и 10 больных (4 больных диссеминированной меланомой, 4 — диссеминированным раком почки, 2 — диссеминированным раком прямой кишки) выделяли из стабилизированной гепарином (25 ед/мл) периферической крови на одноступенчатом градиенте фиколла («Pharmacia», плотность 1,077 г/см3) с помощью центрифугирования при 400 g в течение 30 мин. Мононуклеарные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трижды отмывали в среде RPMI 1640. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали с помощью центрифугирования при 200 g.
Выделенные из периферической крови больных и здоровых доноров МНЛ культивировали в присутствии ИЛ-2 («Proleukine», «Chiron», Голландия) в концентрации 1000 МЕ/мл в 4,5% атмосфере СО2 в течение 20 сут при температуре 37°С. Из популяции ЛАК на 3, 7, 10 и 20-е сутки культивирования выделяли Т-лимфоциты CD4 + CD25+ методом магнитной сепарации с использованием набора «Dynabeads» для сепарации Трег CD4 + CD25+ («Dynal Biotech Asa», Норвегия).
Используя моноклональные антитела («Beckman-Coulter», США), на исходных МНЛ и ЛАК больных и здоровых доноров исследовали уровень экспрессии молекул CD4, CD25. Уровень экспрессии Foxp3 определяли с помощью внутриклеточного окрашивания МНЛ моноклональными антителами к Foxp3 («Miltenyi Biotec Inc.», Германия). Клетки окрашивали моноклональными FITC (флуоресциинизотиоцианат) либо PE (фикоэри-трин) -меченными антителами против CD25, FITC-либо PE-меченными антителами против CD4 и APC (аллофикоцианин) -меченными антителами против Foxp3. Для определения количества НК использовали моноклональные антитела к CD16, меченные FITC, и к CD56, конъюгированные с PC5 (фикоцианин-5) («BeckmanCoulter», США).
Результаты учитывали на проточном цитометре «FacsCalibur» («Becton Dickinson», США). Популяцию лимфоцитов идентифицировали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 5000 лимфоцитов. Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WIN MDI 2.8.
Для определения функциональной активности ЛАК проводили анализ сравнительной цитотоксической активности ЛАК и МНЛ здоровых доноров и онкологических больных с использованием НК-чувствительной линии
эритробластного лейкоза человека К-562. Опухолевые клетки (104мл-1) инкубировали в культуральной среде с ЛАК (в соотношениях клетки-мишени/эффекторы 1:5; 1:2; 1:1) в плоскодонных 96-луночных микропланшетах («Costar», Франция) в течение 18 ч. Затем в лунки добавлялся витальный краситель МТТ («Sigma», США) и по оптической плотности, измеряемой на мультискане МСС-340 («Labsystem», Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Световую микроскопию и фотографирование клеток во взвеси и в окрашенных мазках проводили с помощью системы «AxioVision 4» («Carl Zeiss», Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты иммунофлуоресцентного анализа свидетельствовали, что достоверное повышение содержания Т-клеток CD4 + CD25+ в ЛАК, генерированных из МНЛ здоровых доноров и онкологических больных, наблюдается только при длительных сроках культивирования (10—14 сут). На 3-и сутки инкубации МНЛ с ИЛ-2 (хотя у ряда пациентов и доноров отмечено увеличение содержания Т-клеток CD4 + CD25 + ) эти изменения достаточно вариабельны — от 1 до 18% и достоверно не отличаются от данного показателя у нестимулированных МНЛ. Выделенные из крови здоровых доноров и больных МНЛ содержат около 2% Трег лимфоцитов CD4 + CD25 + Foxp3+ (табл. 1, рис. 1).
При генерации ЛАК из МНЛ больных и здоровых доноров в течение 3 сут не происходит достоверного изменения содержания Т-лимфоцитов CD4 + CD25 + Foxp3 + (см. табл. 1, рис. 2 и 3). Дальнейшее увеличение длительности культивирования лимфоцитов с ИЛ-2 ведет к значимому возрастанию субпопуляции Т-клеток CD4 + CD25 + Foxp3+ преимущественно в культуре активированных лимфоцитов, выделенных из крови онкологических больных. В частности, у здоровых доноров содержание Т-лимфоцитов CD4 + CD25 + Foxp3+ на 10-е сутки инкубации хотя и возрастает, но остается на уровне, не превышающем 5%, в среднем 3,2% (см. табл. 1, рис. 4). В то же время с увеличением длительности культивирования процентное содержание Трег в культуре ЛАК, генерированных из МНЛ больных, к 10-м суткам возрастает до 10%, в среднем 7 ± 3% (см. табл. 1, рис. 5). Вместе с тем в среднем процентное содержание Трег CD4 + CD25 + Foxp3+ в популяции ЛАК больных и доноров независимо от длительности культивирования с ИЛ-2 достоверно не различалось.
Установлено лишь достоверное увеличение содержания Трег CD4 + CD25 + Foxp3+ в ЛАК по сравнению с МНЛ у онкологических больных на поздних сроках инкубации. В МНЛ и ЛАК независимо от сроков инкубации доля клеток Foxp3+ в субпопуляции Т-лимфоцитов CD4 + CD25+ может достигать 50% и более, но только в тех случаях, когда содержание данной субпопуляции не превышает 1—6%. При значительном увеличении рассматриваемой субпопуляции лимфоцитов содержание клеток Foxp3+ в ней составляло лишь 5—6%. На поздних сроках культивирования ЛАК наряду с увеличением содержания Трег CD4 + CD25 + Foxp3+ отмечается снижение цитотоксической активности стимулированных лимфоцитов, в большей степени у онкологических больных
Таблица 1
Содержание Т-клеток CD4+CD25+Foxp3+ в МНЛ и ЛАК онкологических больных и здоровых доноров
Тип клеток (длительность инкубации, сут) Доля Т-клеток CD4+CD25+ в популяции лимфоцитов, % Доля Т-клеток CD4+CD25+Foxp3 + в популяции лимфоцитов, %
МНЛ доноров (3) 5 ± 2 1,6 ± 0,5
ЛАК доноров (3) 7 ± 3 2 ± 1
МНЛ онкологических больных (3) 6 ± 3 2,1 ± 0,9
ЛАК онкологических больных (3) 8 ± 3 1,8 ± 0,6
ЛАК доноров (10) 18 ± 5а 3,2 ± 1
ЛАК онкологических больных (10) 20 ± 6а 7 ± 3а
а Достоверные изменения по сравнению с МНЛ (р < 0,05).
(табл. 2). Одновременно значительно (практически на порядок) уменьшается содержание основной субпопуляции НК (CD16 + CD56 + ) в культуре ЛАК (с 10 ± 3 до 0,9 ± 0,4%) (рис. 6).
При исследовании морфологии Т-клеток CD4 + CD25 + , выделенных методом магнитной сепарации из культуры ЛАК на 10-е сутки, отмечаются незрелые формы типа иммунобластов (рис. 7), что может свидетельствовать об их пролиферативной активности.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные в настоящей работе данные указывают на то, что при стандартных режимах (в течение 2—3 сут) генерации ЛАК из МНЛ здоровых доноров и онкологических больных увеличение содержания Трег не наблюдается.
Несмотря на значительные колебания содержания клеток Foxp3+ в субпопуляции Т-лимфоцитов CD4 + CD25 + , доля Трег CD4 + CD25 + Foxp3+ в популяции ЛАК и МНЛ здоровых доноров остается прак-
тически неизменной (1—4%). Вероятно, это может свидетельствовать о существовании регуляторных механизмов, которые поддерживают невысокий уровень Трег CD4 + CD25 + Foxp3+ среди лимфоцитов. При длительных сроках культивирования в популяции ЛАК онкологических больных происходит увеличение содержания Трег CD4 + CD25 + Foxp3 + . Эти данные позволяют сделать вывод о преимуществах аллогенных ЛАК по сравнению с аутологичными при использовании в целях адоптивной иммунотерапии. Вместе с тем следует отметить, что наблюдаемое снижение цитотоксичности ЛАК больных и доноров при культивировании на протяжении более 10 сут может быть связано не только с супрессивным действием Трег, но и со снижением количества НК.
С учетом способности Трег подавлять НК-активность лимфоцитов для повышения эффективности иммунотерапии представляется целесообразным удаление из популяции ЛАК Т-клеток CD4 + CD25+ либо выделение из активированных лимфоцитов чистой культуры НК с использованием иммуномагнитной сепарации.
Таблица 2
Цитотоксическая активность МНЛ и ЛАК онкологических больных и здоровых доноров, %
Тип клеток (длительность инкубации, сут) Эффектор/мишень
1:1 1:2 1:5
МНЛ доноров (3) 42 ± 2 58 ± 4 70 ± 8
ЛАК доноров (3) 72 ± 3 88 ± 6 98 ± 8
МНЛ онкологических больных (3) 32 ± 3 52 ± 4 67 ± 5
ЛАК онкологических больных (3) 43 ± 3 63 ± 6 82 ± 6
ЛАК доноров (10) 24 ± 5а 44 ± 3а 52 ± 5а
ЛАК онкологических больных (10) 14 ± 6а 31 ± 3а 45 ± 3а
а Достоверные изменения по сравнению с ЛАК на 3-и сутки инкубации (р < 0,05).
104
о
Cl
С
Д
CD4-PE
104
^ 10
101 102
CD25-FITC
4
Е
Рисунок 1. Экспрессия CD4, CD25 и транскрипционного фактора Foxp3 МНЛ здорового донора.
А. Представлено распределение всех лейкоцитов здорового донора в координатах прямого (FSC по оси Х) и поперечного (SSC по оси Y) светорассеяния. Ломаной кривой выделена популяция лимфоцитов. Б. Распределение флуоресценции лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и PE (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и CD4 соответственно. Кривой отмечена субпопуляция Т-клеток CD4+CD25+. В. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей PE (ось Х), конъюгированного с антителами к CD4, и APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Г. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и APC (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и Foxp3 соответственно. Д. Распределение флуоресценции Т-клеток CD4+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Е. Распределение флуоресценции Т-клеток CD25+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3.
Рисунок 2. Экспрессия CD4, CD25 и транскрипционного фактора Foxp3 ЛАК здорового донора после инкубации с ИЛ-2 в течение 3 сут.
А. Распределение в координатах FSC (ось Х) и SSC (ось Y) ЛАК здорового донора после инкубации с ИЛ-2 в течение 3 сут. Ломаной кривой выделена популяция лимфоцитов. Б. Распределение флуоресценции лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и PE (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и CD4 соответственно. Кривой отмечена субпопуляция Т-клеток CD4+CD25+. В. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей PE (ось Х), конъюгированного с антителами к CD4, и APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Г. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и APC (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и Foxp3 соответственно. Д. Распределение флуоресценции Т-клеток CD4+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Е. Распределение флуоресценции Т-клеток CD25+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3.
104
»'і • .**'■ fcf
•ж
Ж* V г
О 10 10 10 10
CD4-FITC
Д
104
103
C
P
С 102
101
* •• -V ’ .V *Ьґ. '
.■>..і *?.• • •
\% ’ ‘ • ‘ y :* •
V , , -v . ■ ■
101 102
CD25-PE
103
104
0
Е
Рисунок 3. Экспрессия CD4, CD25 и транскрипционного фактора Foxp3 ЛАК онкологического пациента после инкубации с ИЛ-2 в течение 3 сут.
А. Распределение в координатах FSC (ось Х) и SSC (ось Y) ЛАК онкологического пациента после инкубации с ИЛ-2 в течение 3 сут. Ломаной кривой выделена популяция лимфоцитов. Б. Распределение флуоресценции лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и PE (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и CD4 соответственно. Кривой отмечена субпопуляция Т-клеток CD4+CD25+. В. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей PE (ось Х), конъюгированного с антителами к CD4, и APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Г. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и APC (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и Foxp3 соответственно. Д. Распределение флуоресценции Т-клеток CD4+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Е. Распределение флуоресценции Т-клеток CD25+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3.
104
103
о
Cl
< 102
101
•/•fer
101 102
CD4-PE
103
104
104
C P < 1
Д
104
103
C
< 102
101
, "Л'Х > ' * • шШ, pçk- ’
101 102 103
CD25-FITC
104
104
103
C
P
< 102
101
. * ■
•.*••• ’
. K&;k У.-.
■ ~ ■' — i —
101 102 103
CD25-FITC
104
0
0
В
Г
0
Е
Рисунок 4. Экспрессия CD4, CD25 и транскрипционного фактора Foxp3 ЛАК здорового донора после инкубации с ИЛ-2 в течение 10 сут.
А. Распределение в координатах FSC (ось Х) и SSC (ось Y) ЛАК здорового донора после инкубации с ИЛ-2 в течение 10 сут. Ломаной кривой выделена популяция лимфоцитов. Б. Распределение флуоресценции лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и PE (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и CD4 соответственно. Кривой отмечена субпопуляция Т-клеток CD4+CD25+. В. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей PE (ось Х), конъюгированного с антителами к CD4, и APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Г. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и APC (ось Y), конъюгированных с антителами к CD25 и Foxp3 соответственно. Д. Распределение флуоресценции Т-клеток CD4+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3. Е. Распределение флуоресценции Т-клеток CD25+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя APC (ось Y), конъюгированного с антителами к Foxp3.
Рисунок 5. Экспрессия CD4, CD25 и транскрипционного фактора Foxp3 ЛАК онкологического пациента после инкубации с ИЛ-2 в течение 10 сут.
А. Распределение в координатах FSC (ось Х) и SSC (ось У) ЛАК онкологического пациента после инкубации с ИЛ-2 в течение 10 сут. Ломаной кривой выделена популяция лимфоцитов. Б. Распределение флуоресценции лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и РЕ (ось У), конъюгированных с антителами к Сй25 и Сй4 соответственно. Кривой отмечена субпопуляция Т-клеток Сй4+Сй25+. В. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей РЕ (ось Х), конъюгированного с антителами к Сй4, и АРС (ось У), конъюгированного с антителами к Foxp3. Г. Распределение флуоресценции субпопуляции лимфоцитов, выделенной на изображении Б, в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и АРС (ось У), конъюгированных с антителами к Сй25 и Foxp3 соответственно. Д. Распределение флуоресценции Т-клеток Сй4+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя АРС (ось У), конъюгированного с антителами к Foxp3. Е. Распределение флуоресценции Т-клеток Сй25+ в координатах интенсивности флуоресценции красителя АРС (ось У), конъюгированного с антителами к Foxp3.
Рисунок 6. Содержание НК в ЛАК.
А. Распределение флуоресценции лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х), конъюгированного с антителами к CD16, и красителя PC5 (ось У), конъюгированного с антителами к CD56, на 3-и сутки культивации ЛАК. Б. Распределение флуоресценции лимфоцитов в координатах логарифма интенсивности флуоресценции красителей FITC (ось Х) и PC5 (ось У), конъюгированных с антителами к CD16 и к CD56 соответственно, на 14-е сутки культивации ЛАК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Antony P. A., Restifo N. P. CD4 + CD25+ T regulatory cells, immunotherapy of cancer, and interleukin-2 // J. Immunother. — 2005. — Vol. 28. — P. 120—128.
2. Antony P. A., Paulos C. M, Ahmadzadeh M. et al. Interleukin-2-Dependent Mechanisms of Tolerance and Immunity In Vivo // J. Immunol. — 2006. — Vol. 176, N 9. — P. 5255—5266.
3. Chen A., Liu S., Park D. et al. Depleting Intratumoral CD4 + CD25 + Regulatory T Cells via FasL Protein Transfer Enhances the Therapeutic Efficacy of Adoptive T Cell Transfer // Cancer Res. — 2007. — Vol. 67, N 3. — P. 1291—1298.
4. Fontenot J. D., Rasmussen J. P., Williams L. M. et al. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3 // Immunity. — 2005. — Vol. 22. — P. 329 —341.
5. Furtado G. C., Curotto de Lafaille M. A., Kutchukhidze N. et al. In-
terleukin 2 signaling is required tor CD4+ regulatory T cell function // J. Exp. Med. — 2002. — Vol. 196. — P. 851—857.
6. Sakaguchi S. Naturally Arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses // Ann. Rev. Immunol. — 2004. — Vol. 22. — P. 531—562.
7. Sharfe N., Dadi H. K., Shahar M. et al. Human immune disorder arising from mutation of the — chain of the interleukin-2 receptor // Proc. Natl. Acad. Sci USA. — 1997. — Vol. 94. — P. 3168—3171.
8. Thornton A. M., Donovan E. E., Piccirillo C. A. et al. Cutting edge: IL-2 is critically required for the in vitro activation of CD4 + CD25 + T cell suppressor function // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172. — P. 6519—6523.
Поступила 15.01.2008
A
Рисунок 7. Микрофотография исходной взвеси ЛАК и Т-лимфоцитов CD4+CD25+ (окраска азуром II и эозином).
А. ЛАК в мазках культуральной взвеси (х 400). Б. Лимфоциты с магнитными шариками в мазках культуральной взвеси. После положительной магнитной сепарации Т-клетки CD4+CD25+ образуют розетки с магнитными шариками (х 900).
Irina Olegovna Chikileva1, Nadezhda Pavlovna Velizheva1,
Irina Zhanovna Shubina1, Konstantin Sergeyevich Titov2,
Mikhail Valentinovich Kiselevsky1
CONTENT OF T-REGULATORY LYMPHOCYTES CD4+CD25+Foxp3+ IN LYMPHOKINE-ACTIVATED KILLER POPULATION
1 Cellular Immunity Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, Russian Federation)
2 Tumor Biotherapy Department, Clinical Oncology Research Institute,
N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478,
Russian Federation)
Address for correspondence: Shubina Irina Zhanovna, Cellular Immunity Laboratory, Tumor Experimental Diagnosis and Therapy Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478,
Russian Federation; e-mail: irinashubina@mail.ru
Content of natural CD4 + CD25 + Foxp3+ T-regulatory cell population was evaluated in lymphokine-activated killer cell cultures from cancer patients and healthy donors with respect to incubation time of peripheral mononuclear lymphocytes with interleukin-2.
There was no increase in T-regulatory cells under standard conditions (for 2—3 days) of generation of lymphokine-activated killers from mononuclear lymphocytes from healthy donors or cancer patients. However, CD4 + CD25 + Foxp3+ T-regulatory cell population did increase in lymphokine-activated killers from cancer patients after long-term culture. Since T-regulatory cells can inhibit natural killer activity of lymphocytes, to increase immunotherapy efficacy it is reasonable to remove CD4 + CD25+ T-cells from lymphokine-activated killers or to separate pure natural killer culture from activated lymphocytes by immunomagnetic separation.
Key words: natural CD4 + CD25 + Foxp3+ T-regulatory cells, transcription factor Foxp3, lymphokine-activated killers, immunomagnetic separation, adoptive immunotherapy.
