CC BY
57
БИОТЕРАПИЯ
Л. 3. Болиева1, Ф. К. Джиоев1, А. В. Сергеев2, М. Я. Шашкина2
Влияние каскатола и селена на возникновение опухолей молочной железы, индуцированных ^метил-^нитрозомочевиной
1 Северо-осетинская государственная медицинская академия, Владикавказ
2 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Многочисленные эпидемиологические исследования убедительно продемонстрировали обратную зависимость между поступлением в организм человека бета-каротина (БК), аскорбиновой кислоты (АК), токоферилацетата (ТФ), селена (СЕЛ) и риском развития рака.
Цель исследования. Изучение ингибирующего влияния БК, препарата каскатол (КАС-комплекс БК, АК, ТФ) и СЕЛ на возникновение опухолей молочной железы (ОМЖ) у крыс, индуцированных Ы-метил-Ы-нитрозомочевиной (МНМ).
Материал и методы. ОМЖ индуцировали 170 крысам-самкам линии Wistar 5-кратным с недельным интервалом подкожным введением МНМ в область одной и той же МЖ в разовой дозе 2,5 мг на животное. Исследуемые препараты вводили крысам ежедневно, начиная с 1-го дня инъекции МНМ (1-й режим введения) или через
3 сут после МНМ (2-й режим) до конца опыта (31-37 нед.).
Результаты. МНМ индуцировала у крыс ОМЖ, гистологически квалифицированные как аденокарцинома. БК снижал частоту возникновения ОМЖ до 47 % при 1-м режиме введения и до 50 % — при 2-м. Средний латентный период появления ОМЖ увеличивался соответственно на 84,8 и 56,3 %, а продолжительность жизни животных — на 41,5 и 24,4 %. Применение одного КАС или КАС с СЕЛ приводило к достоверному снижению частоты ОМЖ до 63,2 и 50 % соответственно. Латентный период появления опухолей увеличился на 28,9 и 32,3 %, а средняя продолжительность жизни выросла на 34,9 и 44,4 % соответственно. Выявлено также замедление темпов роста ОМЖ и повышение выживаемости животных.
Выводы. БК, КАС и СЕЛ при раздельном и комбинированном применении оказывали ингибирующее влияние на канцерогенез молочной железы, индуцированный у крыс МНМ.
А. А. Борунова, Г. 3. Чкадуа, Т. Н. Заботина, Л. В. Демидов Динамика экспрессии антигена CD25 на поверхности лимфоцитов больных меланомой при вакцинотерапии
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Цель исследования. Оценить изменения экспрессии активационного антигена CD25 на поверхности лимфоцитов больных меланомой на фоне вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками, нагруженными опухолевыми антигенами больного.
Материал и методы. Были исследованы больные с диагнозом диссеминированная меланома (n=14), получившие более 10 введений вакцины. Клинически у 7 пациентов до начала вакцинотерапии опухоль и метастазы были полностью удалены (1-я группа), у 7 — наблюдались метастатические изменения (2-я группа). В качестве контрольной группы изучали лимфоциты здоровых доноров (n=10). Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови исследовали в реакции иммунофлюоресценции с МКА, конъюгированными FITC и PE, с последующим анализом на проточном цитофлюориметре. Экспрессию антигена CD25 изучали на поверхности Т-лимфоцитов (CD4 и CD8) и NK-клеток (CD16).
Результаты. При исследовании было выявлено, что для больных без опухолевой массы (1-я группа) до начала терапии характерна высокая экспрессия антигена CD25 (28,2±6,9 %), тогда как во 2-й группе уровень экспрессии этого антигена был в пределах нормы. На фоне вакцинотерапии уже после 3-го введения наблюдалось увеличение CD25+-лимфоцитов в 2 группах (35,5±4,2 и 29,9±6,8 % соответственно). При последующих введениях в 1-й группе количество CD25+-лимфоцитов снижалось до нормальных значений, а у больных 2-й группы сохранялся высокий уровень экспрессии мо-
лекулы CD25 (30-35 %). Исследование распределения экспрессии антигена CD25 на поверхности CD4+-, CD8+- и CD16+-лимфоцитов показало, что у больных 1-й группы увеличение CD25+-клеток было преимущественно за счет CD8+-популяции лимфоцитов. В то же время популяции CD4+CD25+ и CD16+CD25+ оставались в пределах нормы как до начала терапии, так и на фоне лечения. У больных 2-й группы количество CD4+CD25+- и CD8+CD25+-лимфоцитов до начала лечения было выше нормы и сохранялось на этом уровне на фоне последующих введений, а наблюдаемое в процессе лечения увеличение уровня экспрессии антигена CD25 происходило преимущественно за счет CD16+-клеток.
Выводы. Таким образом, на фоне вакцинотерапии у больных 2 групп наблюдается различная динамика экспрессии антигена CD25 на поверхности лимфоцитов периферической крови. В 1-й группе больных увеличение CD25+-клеток происходило за счет CD8+-популяции Т-лимфоцитов, а во 2-й — за счет CD16+-популя-ции NK-клеток.
Н. Г. Кормош, С. М. Ситдикова, Б. С. Аманджолов,
К. П. Лактионов, М. В. Киселевский, Ф. В. Доненко Сравнительное изучение эффективности современных вакцин, содержащих различные опухолеассоциированные антигены ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В настоящем исследовании приведены результаты применения оригинальной вакцины на основе аутогенного муцина содержащего антиген СА 125 (СА 125-вакцина) у больных раком яичников III-IV стадии. Антиген выделен у 10 больных, однако в 5 случаях вакцину не вводили из-за быстрого прогрессирования заболевания и гибели больных. СА 125-вакцина введена 5 больным. Минимальный курс вакцинотерапии составил 5 введений, максимальный — 15. Побочных реакций отмечено не было. У 2 из 5 больных после 3-го введения СА 125-вакцины наступило субъективное улучшение состояния, отмечена положительная динамика по данным УЗИ, стабилизация уровня онкомаркера. В обзоре A. Walker (2004) отмечено, что по крайней мере три противоопухолевые вакцины — LipoNova, CancerVax, Dendreon — показали в рандомизированных исследованиях свою эффективность. Так, в течение 70 мес. наблюдения 558 больных прогрессирование заболевания не наблюдали у 72 % больных, получивших вакцину LipoNova, и у 59,3 % невакцинирован-ных. У 263 больных, получивших вакцину CancerVax, эти результаты составили 39 и 19 % соответственно.
Таким образом, мировой опыт использования противоопухолевых вакцин показывает, что их эффективность колеблется от 12,7 до 20 %. В нашем случае из 10 взятых в исследование больных положительный эффект получен у 2, что также составляет 20 %. СА 125-вакцина является единственной используемой при опухолях женской репродуктивной системы. Мы надеемся, что при дальнейшем изучении СА 125-вакцины у очень тяжелой категории больных раком яичников ее эффективность будет сравнима с таковой уже применяемых противоопухолевых вакцин.
В. П. Краснов1, Г. Л. Левит1, А. М. Демин1, И. А. Низова1,
А. Ю. Вигоров1, Е. А. Жданова1, А. В. Осинцев1,
Е. В. Степанова2, Е. М. Трещалина2 Исследование антиангиогенной активности структурных аналогов талидомида
1 Институт органического синтеза УрО РАН, Екатеринбург
2 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Цель и задачи. В последнее время широко проводятся исследования антиангиогенных соединений как потенциальных противоопухолевых препаратов. Нами были разработаны методы синтеза структурных аналогов талидомида — различных производных N-фталоил-аминокислот, в первую очередь С(4)-производных глутаминовой кислоты, N-фталоиламиноспиртов, N-фталоильных производных каркасных соединений, а также проведено изучение их ан-тиангиогенной активности в опытах in vitro.
-Q-
Материал и методы. Синтез стереоизомеров С(4)-производных глутаминовой кислоты, потенциальных биологически активных соединений, был основан на реакциях нуклеофильного замещения галогена в 4-галогенпроизводных глутаминовой кислоты. Для анализа смесей стереоизомеров использовались методы ВЭЖХ и ЯМР-спек-троскопии.
Исследование антиангиогенной активности проводили с использованием методов ингибирования bFGF, стимулированной пролиферации культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10; ингибирования миграции культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (метод «раневой поверхности»), ингибирования образования трубочкоподобных структур эндотелиальными клетками SVEC-4-10.
Результаты. Синтезированы и переданы для оценки антиангиогенной активности 16 соединений. Большую трудность представляла низкая растворимость некоторых из синтезированных веществ в средах, используемых для проведения эксперимента. Среди них выявлено 4 соединения, активно влияющих на пролиферативную активность культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10. Эти препараты оказывают антипролиферативный эффект на клетки в концентрации 10 3-10 5М, а также частично блокируют образование капилляроподобных структур и миграцию эндотелиальных клеток.
Выводы. В рамках настоящего проекта разработаны методы получения 4 производных глутаминовой кислоты, а также аналогов известных противовоспалительных препаратов. Проведено исследование их способности ингибировать ангиогенез в опытах in vivo. Наиболее активные из полученных соединений могут представлять интерес в качестве основы для создания противоопухолевого препарата.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант 0403-96006.
Г. Кулъчар
Теоретические предпосылки использования кулевита как пищевой добавки и опыт его практического применения
Отделение Биохимии, факулътет Медициныi Университета Пеца, Венгрия
При ВИЧ-инфицировании, несмотря на глобальные изменения в иммунной системе, развиваются только несколько типов опухолей. На основе клинических наблюдений можно предположить, что даже в этих случаях причина малигнизации не в дефектах иммунной системы. Вероятно, возникновение опухоли не является следствием недостаточности иммунной системы. Это предположение свидетельствует о том, что известная сегодня система иммунной защиты организма не играет существенной роли в возникновении опухоли. Многие исследователи изучают механизмы ухода от иммунного надзора или заняты поиском иммуномодуляторов. Мы выбрали третье направление. Согласно нашей концепции, тот факт, что опухоль не развивается в большинстве популяций в течение всей жизни, несмотря на неэффективность иммунной системы, указывает на существование других защитных систем клетки. Понятно, что компоненты защитного механизма должны присутствовать в циркулирующей системе организма. Не вызывает сомнений, что захват малых субстратов (аминокислот, моносахаридов, нуклеотидов и др.) нормальной, в отличие от опухолевой, клеткой — строго регулируемый процесс. Именно благодаря этим закономерностям опухолевая клетка аккумулирует контрастные вещества. Подобные качества опухолевой клетки могут быть фатальны для нее вследствие аккумулирования веществ, которые при высокой концентрации становятся токсичными для клетки. Способность таких соединений убивать опухолевую клетку формирует ранее не известную защитную систему, которую мы назвали ППЗС — пассивная противоопухолевая защитная система.
Мы выбрали 16 компонентов из 89 циркулирующих в крови и показали, что эта смесь действительно обладает цитотоксическим эффектом (индуцирует апоптоз) в различных опухолевых линиях клеток. Этот эффект также подтвержден на животных. Смесь из 16 соединений применяли как препарат не только в Венгрии, но и в других странах, включая Россию. На основании дополнительных экспериментов стало известно, что пролиферация опухолевых клеток начинает конкурировать с их гибелью. Соотношение гибели к делению и размножению клеток определяет в конечном итоге ос-
тановку пролиферации опухоли и ее регрессию. Эти данные запатентованы Immunal Ltd., Budapest, Hungary.
Также получены данные о том, что смесь из 16 соединений (ингредиенты таблеток кулевит) улучшает эффективность химиотерапии и снижает ее побочные эффекты. Кулевит разрушает резистентные к химиотерапии клетки, предотвращая рецидив. Эти данные подтверждены клиническими испытаниями, что может послужить аргументом в пользу применения таблеток кулевит совместно с другими методами клинического лечения.
М. Ю. Ларин1, П. К. Иванов1, Д. Ю. Блохин1,
B. И. Филиппов2, О. Л. Ершов2, Н. Г. Мошечков3 Стандартизации магнитоуправляемого иммуносорбента ФерроДекс-115
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 ООО НПО «МедБиоСпектр», Москва
3 ФГУП ЦНИИТОЧМАШ, Климовск, Московская область
Цель настоящей работы состояла в определении критериев оценки и создании методов стандартизации препарата ФерроДекс-115, предназначенного для выделения гемопоэтических стволовых клеток человека из костного мозга и периферической крови методом иммуномагнитной сепарации.
Ключевой особенностью иммуносорбента ФерроДекс-115 является его магнитовосприимчивость, т. е. способность к магнитофоре-зу — направленному движению в неоднородном магнитном поле. Основой для ФерроДекс-115 служит магнетит (смешанный оксид железа Fe3O4), являющийся мягким ферромагнетиком, поэтому количественной характеристикой магнитовосприимчивости выступает намагниченность насыщения. Другая важная особенность сорбента состоит в том, что его частицы обладают небольшим по величине собственным магнитным моментом в отсутствие внешних магнитных полей, что обусловливает устойчивость препарата к спонтанной агрегации. Количественной характеристикой в данном случае является остаточная намагниченность. Для оценки магнитных свойств нами были использованы магнитные весы Фарадея и вибрационный магнитометр.
Важную роль для возможности применения иммуносорбента ФерроДекс-115 в магнитных сепараторах различных модификаций играет седиментационная устойчивость суспензии. Количественно она характеризуется плавучей плотностью частиц иммуносорбента. Оценка последней осуществляется методом центрифугирования в растворах сахарозы различной плотности.
Большое значение имеет распределение частиц сорбента по размерам. Монодисперсность во многом обусловливает стабильность ряда физико-химических характеристик препарата. Размеры частиц важны еще и потому, что гемопоэтические стволовые клетки, выделенные с помощью препарата ФерроДекс-115, планируется вводить пациентам без отделения от частиц сорбента. Оценку дисперсии размеров частиц проводили методом корреляционной спектроскопии светорассеяния на приборе Nicomp 380 (Nicomp PSS).
В результате проведенных исследований определены критерии оценки основных физико-химических характеристик препарата магнитоуправляемого иммуносорбента ФерроДекс-115, служащие для его стандартизации: намагниченность насыщения 18-22 кА^м'1, остаточная намагниченность не более 0,5 кА^м-1, плавучая плотность 1,06-1,08 г^см-3, размеры частиц 50-200 нм при объемной доле фракции частиц размером 70-100 нм не менее 90 %.
И. Н. Михайлова, Г. 3. Чкадуа, А. А. Борунова, Н. Н. Петенко, Е. В. Огородникова, Л. Ю. Вишнякова,
C. А. Хатырев, Е. А. Черемушкин, К. С. Титов,
3. Г. Кадагидзе, Л. В. Демидов, А. Ю. Барышников Аутологичная дендритноклеточная вакцина в лечении диссеминированной меланомы ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Меланома относится к иммуногенным опухолям, поэтому разработка методов специфической иммунотерапии для данной нозологии представляется актуальной.
Цель исследования. Изучить влияние аутологичной дендритноклеточной вакцинотерапии на иммунный ответ и клиническое течение диссеминированной меланомы.
Материал и методы. Применялась противоопухолевая вакцина на основе аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных опухолевым лизатом. ДК вводились внутрикожно в несколько точек (от 2 до 10) вблизи регионарных лимфатических коллекторов. Однократная доза введения — 1-5х106 клеток, интервал между вакцинациями — 2^ нед., кратность введения — до прогрессирования заболевания. Оценка иммунологической и клинической эффективности производилась с помощью следующих методов: фенотипиро-вание лимфоцитов периферической крови в динамике, степень РГЗТ, оценка объективного клинического ответа, безрецидивной выживаемости. С 2003 по 2005 г. в исследование включено 37 пациентов, которые были разделены на две клинические группы: 1) пациенты с метастатической меланомой (регионарные и/или отдаленные метастазы), получающие вакцину в терапевтическом режиме в виде монотерапии (n=13), причем Тлюб^ 3M0 — 15 %, Тлюб^любМ! — 85 %; 2) пациенты с аналогичной распространенностью процесса после радикального оперативного вмешательства, получающие лечение в профилактическом режиме (n=24), причем Тлюб-N! 3M0 — 46 %, Тлюб^любМ! — 54 %. Почти всем пациентам (84 %) до начала вакцинотерапии проводилось комбинированное лечение, на фоне которого отмечено прогрессирование заболевания.
Результаты. В 1-й группе 13 пациентов получили 145 вакцинаций (от 3 до 21 введений, в среднем 11,2), время наблюдения от 1 до 27 мес. Стабилизация заболевания (от 9 до 27 мес.) отмечена у 5 (38 %) больных, прогрессирование заболевания — у 8 (62 %). Во 2-й группе 24 пациента получили 173 вакцинации (от 2 до 30 введений, в среднем 7,2), время наблюдения от 2 до 24 мес. Без признаков прогрессирования заболевания за время наблюдения остаются 16 (67 %) больных, прогрессирование заболевания произошло у 6 (25 %). Не оценено 2 (8 %) наблюдения.
При изучении иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови больных 2 групп на фоне вакцинотерапии было выявлено увеличение количества Т-лимфоцитов (преимущественно за счет CD8+) и NK-клеток, а также уровня экспрессии активационных антигенов на их поверхности. В местах введения вакцины отмечались местные реакции в виде покраснения от 5 до 30 мм, зуда, расцененные как проявление РГЗТ.
Выводы. Данный метод лечения хорошо переносим. При отсутствии объективной клинической эффективности в терапевтической группе в 38 % случаев наблюдалась длительная стабилизация заболевания. Отмечена стимуляция противоопухолевого ответа иммунной системы в виде активации эффекторного звена клеточного иммунитета.
И. Н. Михайлова1, П. В. Иванов2, М. И. Лукашина1, Л. Ф. Морозова1, О. С. Бурова1, Н. Н. Петенко1, Е. А. Черемушкин1, Г. 3. Чкадуа1, Л. В. Демидов1,
А. Ю. Барышников1
Иммунные реакции кожи у больных меланомой при проведении вакцинотерапии
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова
Цель исследования. Изучение лимфоидных структур кожи пациентов с меланомой кожи при проведении им внутрикожной вакцинации.
Материал и методы. Посредством стандартных и иммуногисто-химических методик окраски были исследованы биоптаты кожи 9 пациентов в возрасте от 35 до 58 лет с меланомой различной локализации, проходящих курсы иммунотерапии. Пациентам 1-й группы проводилась внутрикожная вакцинация модифицированными алло-генными клетками, 2-й группы — вакцинация аутологичными дендритными клетками, нагруженными опухолевыми антигенами, in vitro. Биопсия кожи выполнялась из симметричных лопаточных областей накануне вакцинации и в различные сроки после.
Результаты. У пациентов 1-й группы наибольшая выраженность изменений клеточного состава отмечалась в первые дни после вакцинации, проявляясь в значительном увеличении объема скоплений клеток вокруг сосудов (периваскулярных узелков) сосочкового и сетчатого слоев дермы смешанного состава. Иммуногистохимически инфильтраты состояли преимущественно из Т-лимфоцитов, В-клетки были представлены в незначительном коли-
честве в составе периваскулярных узелков и сетчатом слое дермы, также отмечалось наличие в составе инфильтратов дендритных клеток (ДК).
Биоптаты, взятые неделю спустя, характеризовались менее выраженным увеличением объема периваскулярных узелков сетчатого слоя, изменением пропорции Т- и В-клеточного состава узелков в пользу В-клеток, а также снижением количества ДК вокруг сосудов и увеличением их концентрации в сосочковом слое. Спустя 2 нед. выявлено значительное снижение числа Т-клеток с одновременным повышением В-лимфоцитов в составе периваскулярных узелков без выраженного изменения их объема. Отмечалось также существенное увеличение количества ДК вокруг сосудов (за неделю до 2-й биопсии пациенту была проведена повторная вакцинация).
Среди пациентов 2-й группы в первые дни после вакцинации отмечались выраженные периваскулярные инфильтраты смешанного состава (лимфоциты, макрофаги, плазмоциты, моноциты, базофи-лы, нейтрофилы), а также умеренная инфильтрация концевых отделов потовых и сальных желез. Иммуногистохимическая окраска выявляла в составе инфильтратов в основном Т-лимфоциты. Био-птаты более поздних сроков варьировали по клеточному составу в зависимости от интервала между биопсиями, количества промежуточных вакцинаций. Отмечалось наличие умеренно выраженных периваскулярных и перигландулярных инфильтратов смешанного состава с преобладанием Т-лимфоцитов (7-10 дней), приблизительно равным соотношением Т- и В-клеток (19-20 дней), а также наличие небольших скоплений в дерме дендритных клеток (CD83) (20-21-й день).
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта «Terry Fox Run».
И. Н. Михайлова1, Е. С. Воронина2, Н. М. Дышева3,
Л. Ф. Морозова1, О. С. Бурова1, Е. А. Черемушкин1,
Л. В. Демидов1, А. Ю. Барышников1 Кариологическое исследование клеточных линий меланомы кожи человека
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
3 Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова
Одним из новых селективных и эффективных методов противоопухолевой терапии является использование генно-инженерных противоопухолевых вакцин. Для создания таких вакцин требуется тщательное изучение применяемых клеточных линий, в связи с чем кариологическое исследование является необходимым этапом, позволяющим более оптимально подбирать клеточные линии для разработки противоопухолевых вакцин.
Проведено кариологическое исследование 8 клеточных линий меланом. Фиксацию клеток проводили стандартным способом. Готовые препараты окрашивали по G-методу. Кариологическое исследование включало соотносительную оценку размера ядер, характер их окраски, состояние хроматина и кариотипический анализ (число хромосом, симметричные транслокации в длинных хромосомах, наличие или отсутствие идентичных перестроенных хромосом в разных метафазах, нестабильные хромосомные аберрации).
Все изученные культуры характеризуются измененным хромосомным набором как по числу хромосом, так и по их структуре. Модальное число хромосом в 3 культурах соответствует диплоидному набору, в 5 — триплоидному. В 4 культурах встречаются клетки с удвоенным по сравнению с основным пулом клеток числом хромосом (тетра- и гексаплоидные клетки соответственно). Эти культуры характеризуются различающимися диаметрами ядер при одной и той же плотности окраски и состоянии хроматина, характерного для интерфазных ядер. Принимая во внимание дублированность структурных аномалий хромосом (например, кольцевой хромосомы), можно утверждать, что речь идет не о двух различных линиях клеток в одной культуре, а о повышенной полиплоидизации в этих культурах. Числовые нарушения затрагивали также и отдельные хромосомы, наиболее характерна полисомия по хромосоме 7. Структурные перестройки включали в себя транслокации, делеции, инверсии, дупликации. Наиболее часто они затрагивали хромосомы 1, 6, 7 и хромосомы группы D. Три культуры характеризовались высоким уровнем
-Q-
нестабильных хромосомных аберраций (хроматидные и хромосомные обмены).
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы в рамках научно-технической программыы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новыгх методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний».
А. В. Сергеев1, М. Я. Шашкина1, С. А. Хрусталев1, Е. Н. Анашкина1, С. М. Галачиев2, Ф. К. Джиоев2,
A. В. Погабало3, Т. В. Силаева1 Иммуномодулирующая и антитоксическая активность экстракта корня солодки
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Северо-осетинская государственная медицинская академия, Владикавказ
3 Государственная классическая академия им. Маймомида, Москва
Введение. Широкий спектр фармакологической активности экстракта корня солодки (ЭКС) обусловлен наличием глицирризиновой и глюкуроновой кислот (ГЛК), суммой флавоноидов и рядом других соединений. Иммуномодулирующие и антитоксические свойства ЭКС и препаратов на его основе могут найти применение в профилактике и лечении онкологических заболеваний.
Цель исследования. Изучение влияния ЭКС на иммунотоксичность, индуцированную цитостатиками, и на токсичность при хроническом свинцовом отравлении.
Материал и методы. Лиофилизированный ЭКС получен по специальной технологии и содержал не менее 20 % ГЛК. Пролиферативную активность спленоцитов (ПАС) мышей БАЬБ/с определяли по включению 3Н-тимидина в ДНК лимфобластов, трансформированных митогеном Кон А или аллоантигенами в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) селезенки аллогенных мышей, а специфический цитолиз Т-киллеров из СКЛ — по выходу изотопа 51Сг из клеток-мишеней. Хроническую свинцовую интоксикацию у крыс линии ЭД^аг вызывали ежедневным скармливанием животным 30 мг/кг ацетата свинца (АСВ).
Результаты. Ежедневное введение мышам БАЬБ/с ЭКС в дозе 0,02-0,1 г/кг приводило через 4-6 нед. к 1,5-3-кратному увеличению ПАС и дополнительному образованию Т-киллеров в СКЛ. Предварительное многократное введение мышам ЭКС в дозе 0,1 г/кг снижало на 40-60 % иммунотоксичность, индуцированную циклофосфаном или аранозой, которая выражалась в 2-3-кратном подавлении ПАС и образовании Т-киллеров в СКЛ. Хроническое ежедневное введение крысам АСВ приводило через 6-12 мес. к повышению смертности животных на 45-50 %, снижению массы тела на 40-45 %, уровня гемоглобина и эритроцитов на 35-40 %, появлению ретикулоцитов и лейкопении. Одновременное введение крысам АСВ и ЭКС в дозе 0,05 г/кг достоверно (на 20-30 %) уменьшало показатели смертности, снижения массы тела и гематологические симптомы интоксикации.
Выводы. Препараты на основе ЭКС могут найти применение для снижения токсичности в комплексной терапии рака и для профилактики онкологических заболеваний, особенно в группах риска.
B. А. Филов, А. М. Беркович
Олипифат и его модифицированный аналог лигфол — новые отечественные препараты из класса окисленных лигнинов
ГУ НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова, Санкт-Петербург Фармацевтическая фирма «Лигфарм», Москва
Новый оригинальный препарат олипифат, полученный из лигнина медицинского, проявил заметный противоопухолевый эффект в эксперименте на лабораторных животных. При этом он практически лишен токсичности. В настоящий момент заканчиваются клинические испытания олипифата при меланоме и раке почки. При других локализациях злокачественных опухолей человека препарат к существенным положительным эффектам не приводил.
В ветеринарии оказался весьма полезен модифицированный препарат лигфол. Он проявил высокую активность при лечении доброкачественных и злокачественных опухолей домашних животных, в первую очередь, опухолей молочной железы у кошек и собак. Эффективность лигфола проявляется длительными ремиссиями — до года и более. Нередки случаи полного выздоровления даже при дале-
ко зашедших процессах. Применение лигфола при лучевой терапии и лечении цитостатиками обеспечивает снижение токсических эффектов и приводит к потенцированию противоопухолевого действия. Препарат полифункционален. Помимо указанных свойств он обладает выраженным адаптогенным эффектом, оказывает иммуномодулирующее действие, является весьма эффективным репарантом, что показано в разных лабораториях и подтверждено исследователями-практиками. Все эти качества могут быть с пользой применены в онкологической практике. В частности, ранозаживляющий эффект лигфола выше, чем от применения других репарантов.
Касаясь механизмов действия препарата, можно предполагать ведущую роль иммуноантиоксидантных свойств. Показана его анти-радикальная активность, активизация антиоксидантной защиты и иммунокомпетентных органов, мобилизация фагоцитов.
A. А. Филъченков1, В. А. Каминский2’3, М. П. Завелевич1, Р. С. Стойка2’
Активация каспазной системы в клетках лимфобластного лейкоза человека при индукции апоптоза алкалоидами хелидонином и сангвинарином
1 Институт эксперименталъной патологии, онкологии и радиобиологии ИАН Украины, Киев
2 Институт биологии клетки НАН Украины, Львов
3 Львовский национальный университет
Цель исследования. Активация каспазной системы при индукции апоптоза играет важную роль в реализации цитотоксического действия большинства известных противоопухолевых препаратов. Значение этой системы в действии индивидуальных алкалоидов чистотела практически не исследовано. В данной работе изучена способность хелидонина и сангвинарина индуцировать апоптоз и активировать каспазную систему в перевиваемых клетках линии МТ-4 острого лимфобластного лейкоза человека.
Материал и методы. Индукцию апоптоза и образование в клетках активной формы каспазы-3 определяли с помощью проточной цитофлюориметрии (окраска клеток пропидия йодидом или использование набора mAb Apoptosis Kit FITC фирмы BD Biosciences Pharmingen, США). Для оценки уровня цитохрома с (в цитоплазматической фракции), а также прокаспазы-8 и -9, зрелой формы каспазы-8 и -9 использовали иммуноблоттинг с применением моноклональных антител против указанных белков (BD Biosciences Pharmingen и Beckman Coulter, Inc., США). Выявление соответствующих антигенов осуществляли специфическими антисыворотками с титром 1:1000 в течение 12 ч при температуре 4 С. Результаты анализа были визуализированы после связывания вторичных антител и количественной оценки активности конъюгированной с ними пероксидазы.
Результаты. Обработка клеток МТ-4 хелидонином или сангвина-рином в концентрации 2,5 и 1 мкг/мл вызывала существенную гибель клеток: содержание гиподиплоидных (апоптотических) клеток через 24 ч после добавления препарата в среднем составляет 34 и 25 % соответственно. После культивирования клеток МТ-4 с хелидонином или сангвинарином в них активируется каспаза-3. В клетках, обработанных как хелидонином, так и сангвинарином, выявлен выход цитохрома с (м.м. 12 кДа) в цитозоль, а также появление каспазы-9 (м.м. 34 кДа) на фоне уменьшения уровня ее предшественника (м.м. 45 кДа). В то же время в обработанных этими алкалоидами клетках обнаружена только неактивная форма прокаспазы-8 (м.м. 55 кДа).
Выводы. Таким образом, хелидонин и сангвинарин являются типичными индукторами апоптоза митохондриального типа, для которого характерны выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму, активация инициаторной каспазы-9 и эффекторной каспазы-3, которые происходят без вовлечения компонентов рецептор-опосредован-ного пути (каспаза-8) передачи апоптогенного сигнала.
Е. Л. Членова1, Л. М. Михайлова1, М. Ю. Ларин1, И. Б. Меркулова1, О. И. Коняева1, И. П. Ермакова1, И. Ю. Кулъбачевская1, Т В. Абрамова1, И. Г. Мошечков3, B. И. Филиппов2, О. Л. Ершов2, Д. Ю. Блохин1, П. К. Иванов1
Токсичность и побочное действие иммуномагнитного сорбента ФерроДекс-115
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 ООО Научно-производственный центр «МедБиоСпектр», Москва
3 ФГУП ЦНИИТОЧМАШ, Климовск, Московская область
Введение. ФерроДекс-115 — новый отечественный иммунома-гнитный сорбент, используемый в иммуномагнитной сепарации стволовых гемопоэтических клеток для выделения СВ34+-клеток для их последующей аутотрансплантации.
Цель исследования. Изучение токсичности и побочного действия ФерроДекс-115 для оценки его безвредности при клиническом применении.
Материал и методы. Исследования проведены на 60 мышах-гибридах ?! (СБАхСз7Б1/6]), 60 неинбредных крысах, 40 морских свинках, 12 кроликах породы шиншилла и 8 собаках породы английский бигл. При изучении острой и субхронической токсичности ФерроДекс-115 вводили внутривенно однократно и многократно (ежедневно в течение 5 дней) грызунам в диапазоне доз от 9 до 450 мг/кг, собакам — от 2,5 до 62,5 мг/кг. Оценку влияния ФерроДекса-115 на органы и системы животных проводили функциональными, лабораторно-инструментальными и патоморфологическими методами исследования в течение 30-60 дней (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. — ФК М3 РФ. — М., 2005).
Результаты. Определены уровни токсических доз на животных при однократном и многократном введении ФерроДекса-115. Установлена хорошая переносимость препарата животными в условиях как острого, так и субхронического эксперимента при применении в дозах, превышающих предполагаемую начальную (стартовую) дозу для человека в 4-30 раз (мыши), 10-50 раз (крысы), 2,5 раза (собаки). ФерроДекс-115 не влияет на общее состояние животных, не вызывает их гибели, не оказывает токсического влияния на органы и системы организма животных. ФерроДекс-115 при введении собакам в дозах, превышающих предполагаемую дозу для человека в 10 раз (однократное введение) и в 25 раз (многократное введение), оказывает побочное действие на функции ЖКТ (эметическое действие), печени (увеличение активности трансаминаз), вызывает нейропатию у животных. Риску развития указанных побочных эффектов способствует увеличение скорости введения препарата более 60 мл/ч. Гистотоксикологические исследования показали, что препарат вызывает морфологические изменения в легких (микроочаги воспалительных изменений), печени и почках (мелкоочаговые дистрофические изменения). Побочное действие носит пролонгированный дозозависимый характер.
Выводы. Иммуномагнитный сорбент ФерроДекс-115 рекомендуется для проведения клинических исследований.
В. И. Шардаков
Применение дерината в лечении онкологических больных
ФГУ Кировский НИИ гематологии и переливания крови
Цель исследования. Оценка иммунокорригирующих и миело-стимулирующих свойств отечественного препарата деринат (3АО ФП «Техномедсервис»», Москва).
Материал и методы. У 20 пациенток после комплексной терапии рака молочной железы, включавшей лучевое, оперативное и химиотерапевтическое воздействие, оценивались миело- и иммуностимулирующие свойства дерината, который вводился больным по следующей схеме: внутримышечно 5 мл 1,5% раствора (75 мг дерината) первые 5 инъекций через 2 дня, последующие 5 инъекций — через 3 сут, т. е. курсовая доза препарата составляла 750 мг. У наблюдаемых больных исследовались количественные показатели периферической крови, а также определялось число лимфоцитов с маркерами СБ3+, СБ4+, СБ8+, СБ20+, СБ25+. Оценивалась функциональная активность нейтрофилов в латекс- и НСТ-тестах. В сыворотке крови исследовался уровень иммуноглобулинов О, А, М, а также некоторых цитокинов.
Результаты. Исходное содержание лейкоцитов в периферической крови у обследованных лиц колебалось от 3,9 до 4,8х109./л (в среднем 4,4±0,11х109/л). Абсолютное содержание лимфоцитов составляло 1,3±0,2х109/л против 1,9±0,09х109/л у здоровых людей (р<0,05). Обращало на себя внимание снижение количественных по-
казателей, прежде всего, Т-клеточного иммунитета, в то же время у 60 % пациентов формирование вторичной иммунной недостаточности носило сочетанный характер и затрагивало как клеточный, так и гуморальный иммунитет. Исходно оказались сниженными фагоцитарная и микробицидная функции нейтрофилов. После терапии деринатом содержание лейкоцитов возросло и составило 5,8±0,12х109/л (у здоровых людей этот показатель в пределах 6,1±0,26х109/л). Из 18 (67 %) больных со сниженными показателями клеточного иммунитета у 12 пациенток наблюдалась положительная динамика показателей Т-звена. При оценке гуморального иммунитета эффект от дерината оказался более стабильным.
Выводы. Одним из препаратов, способствующих восстановлению числа лейкоцитов и сниженных иммунологических показателей у больных после комбинированного лечения рака молочной железы, является деринат в курсовой дозе 750 мг.
М. Я. Шашкина, А. В. Сергеев
Перспективы создания лекарственных средств-биокорректоров для использования их в комплексной терапии рака
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Современное комплексное лечение больных раком часто сопровождается целым рядом токсических осложнений. Хирургическая, радио- и полихимиотерапия индуцируют свободнорадикальные процессы и способствуют истощению защитной антиок-сидантной системы (АОС). У пациентов развивается вторичный иммунодефицит в сочетании с иммунодепрессией и оксидантным стрессом, вызванными опухолевым процессом. Поэтому актуально создание лекарственных средств, уменьшающих побочное действие комплексной терапии и способствующих нормализации физиологических функций организма.
Цель исследования. Выбор потенциальных компонентов и анализ экспериментально-клинических данных для разработки новых лекарственных средств (биокорректоров) с целью снижения общей токсичности, повышения эффективности противоопухолевой терапии и качества жизни больных.
Результаты. В экспериментах in vivo Р-каротин, препараты ламинарии, каскатол, каскорутол снижали на 30-70 % число хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, индуцированных цитостатиками (араноза, циклофосфан), усиливали торможение роста опухолей Ca0V на 30-60 % по сравнению с контролем, способствовали нормализации ИС. Экстракты солодки и чаги обладали антитоксическим действием, Р-каротин и ликопин — радиопротек-торным. В пилотных клинических испытаниях Р-каротин при применении в предоперационный период (16 больных раком прямой кишки) способствовал нормализации АОС и ИС, снижению в 6 раз ранних послеоперационных осложнений и в 1,6 раза летальных исходов по сравнению с контролем. 10-дневный курс коррекции каска-толом в предоперационный период больных раком яичников (30 пациентов) снижал на 25 % перекисное окисление липидов, нормализовал АОС. Применение каскатола после радикального лечения больных раком молочной железы (60 пациентов) приводило к нормализации АОС, повышению активности СОД и снижению рецидивов. Препараты чаги повышают эффективность лечения и качество жизни больных III и IV стадиями.
Выводы. Все исследуемые препараты нетоксичны и могут быть потенциальной основой создания нового поколения лекарственных средств-биокорректоров для повышения эффективности противораковой терапии.
И. Ж. Шубина, М. В. Киселевский
Апоптоз в популяциях дендритных клеток, генерированных из лимфокин-активированных киллеров
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
При использовании дендритных клеток (ДК) для создания противоопухолевых вакцин важное значение имеет жизнеспособность ДК. На разных стадиях созревания ДК могут подвергаться апоптозу, что снижает их потенциал в реализации антигенпрезентирующих функций. Источником генерации ДК служат в основном мононуклеар-ные лейкоциты (МНЛ) периферической крови, при этом не более 50 %
культивируемых клеток дифференцируется в зрелые ДК. Есть данные (H. R. Bohnenkamp et al., 2004) о том, что около 40 % исходных МНЛ подвергается программированной клеточной гибели и это может быть причиной невысокого выхода генерируемых ДК. Ранее нами было продемонстрировано, что при получении ДК из культуры МНЛ, активированных ИЛ-2, можно достичь большего пула зрелых ДК.
Проведена оценка апоптотической гибели МНЛ, активированных ИЛ-2 (ЛАК). Изучена жизнеспособность незрелых и зрелых ДК, генерированных из ЛАК. МНЛ выделяли на градиенте фиколла-урографина и инкубировали в пластиковых флаконах 4 ч. Отбирали неприлипшие клетки (лимфоциты), культивировали их в течение 48 ч с ИЛ-2 (1000 ЕД/мл). Из полученных ЛАК генерировали ДК в присутствии ГМ-КСФ, ИЛ-4 и ФНО-а (ДКдак). Контролировали иммунофенотипы ЛАК и ДКдак на проточном цитофлюориметре. Апоптоз ЛАК, незрелых и зрелых ДКдак оценивали с помощью теста по окрашиванию аннексином V (An-V) и пропидий йодидом (PI) на проточном цитофлюориметре.
Иммунофенотип ЛАК характеризовался невысокой экспрессией СБ3, но при этом значительной экспрессией поверхностных антигенов естественных киллеров СБ16, СБ56, СБ57, молекул адгезии СБ58 и незначительной экспрессией маркера СБ14 (0-20 %). Окрашивание ЛАК, используемых для генерации ДКдак на 2-е сутки культивирования, Ап-У, Р1 и одновременно Ап-У/Р1 практически не выявило апоптотических или некротизированных клеток. 3релые ДКлак экспрессировали костимулирующие молекулы СБ40 (37^0 %), СБ80 (34-86 %), СБ86 (23-74 %), маркеры ДК СБ83 (38-90 %), СБ1а (10-40 %) и маркер моноцитов СБ14 (0-17 %). При оценке апоптоза незрелых ДКдак было отмечено окрашивание Ап-У+/Р1- в 5 % случаев и практически отсутствие Ап-У-/Р1+ и Ап-У+/Р1+. Анализ зрелых ДКдак показал отсутствие окрашивания Ап-У+/Р1- и Ап-У+/Р1+, а Ап-У+/Р1+ составило 7 %. Таким образом, при созревании ДКЛАК сохраняют высокую жизнеспособность, а также дают больший выход зрелых ДК по сравнению с пулом, получаемым из МНЛ.
ДИАГНОСТИКА
И. Г. Гатауллин, С. В. Петров, А. В. Игуменов, А. И. Тихонов
Оптимизация диагностического алгоритма и выбор хирургической тактики у больных с колоректальными ворсинчатыми новообразованиями
Республиканский клинический онкологический диспансер, Казань
Введение. Ворсинчатые опухоли отличаются особо высокой склонностью к перерождению и рецидивированию. Не решены вопросы достоверного выявления злокачественной трансформации опухоли и единого подхода к ее лечению.
Цель исследования. Улучшение результатов диагностики и хирургического лечения больных с колоректальными ворсинчатыми новообразованиями.
Материал и методы. Работа основана на анализе результатов клинического обследования и лечения 91 пациента с крупными ворсинчатыми опухолями толстой кишки. Диагностический алгоритм включал фиброколоноскопию с биопсией, трансабдоминальное и трансректальное ультразвуковое исследование, компьютерную томографию. Биопсийный и операционный материалы отправляли на морфологическое исследование, включавшее стандартное гистологическое исследование и иммуногистохимический тест на тканевые биомаркеры. Иммуногистохимические исследования проведены с помощью набора моноклональных антител к маркеру Кл-67, мутантному белку гена р53, а также к РЭА. Научная новизна работы состоит в том, что впервые предложен и апробирован алгоритм обследования больных с колоректальными ворсинчатыми новообразованиями, включающий комплекс лучевых и иммуноморфологичес-ких методов исследования.
Результаты. На основании клинических наблюдений установлены дифференциально-диагностические лучевые критерии злокачественной трансформации ворсинчатых опухолей толстой кишки. Показано, что уровень экспрессии тканевых маркеров К1-67, РЭА, р53 в дополнение к ультразвуковым, эндоскопическим, морфологическим критериям определяет прогноз и показания к выбору адекватного метода лечения. Комплексное предоперационное обследование, включающее эндоректальную эхографию, ультразвуковую ко-лографию, компьютерную томографию и иммуногистохимические методы исследования, позволило снизить число местных рецидивов опухоли с 40,7 до 8,3 %.
Выводы. Предложенный алгоритм обследования пациентов способствовал более точной оценке распространенности процесса как по протяженности, так и по глубине инвазии в стенку кишки, позволил заподозрить злокачественную трансформацию ворсинчатой опухоли, что обеспечило выполнение радикальных операций, соответствующих объему и характеру поражения.
Е. И. Захарова1, В. Е. Кузнецова2, А. В. Чудинов2, А. С. Гриневич1, Е. Ю. Лысюк1, Д. Ю. Блохин1, П. К. Иванов1
Производные флюорофора Cy5 для цитометричес-кого анализа клеточных популяций
1 ГУ РОИЦ им. И. И. Блохина РАМИ, Москва
2 Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАИ, Москва
Одним из современных и наиболее информативных инструментов изучения клеточных популяций является проточная цитофлюо-риметрия. Этот метод дает возможность анализировать не только состав зафиксированных клеток, но и прижизненную кинетику клеточных популяций в реальном времени.
Поскольку живые интактные клетки, как правило, обладают незначительной автофлюоресценцией, возможности данного метода прямо зависят от свойств флюоресцентных зондов. Большинство специальных зондов получают конъюгированием специфических биоактивных молекул (антител, лектинов, олигонуклеотидов и др.) с активными формами флюорофоров. Основными характеристиками флюорофоров являются: способность к возбуждению флюоресценции монохроматическим светом конструктивно заданной длины волны с эмиссией вторичных квантов в узких спектральных диапазонах; квантовый выход флюоресценции; коэффициент экстинкции; сдвиг Стокса; перекрывание спектров возбуждения и эмиссии. Для возбуждения флюоресценции чаще всего используют аргоновый (488 нм), гелий-неоновый (633,5 нм) либо диодный (635-650 нм) лазеры.
В качестве флюорофоров наиболее часто используют флюорес-цеин изотиоционат (FITC), Р-фикоэритрин (PE), тетраметилродамин (TRITC), аллофикоцианин (APC). Данные зарубежных исследований свидетельствуют об эффективности использования в проточной цитометрии производных цианинового красителя Cy5 в виде сукци-нимидного эфира, который может связываться с антителами, авиди-ном, ДНК и другими содержащими аминогруппы молекулами. Эти соединения имеют хорошую водорастворимость, нечувствительны к рН, практически не агрегируют при конъюгировании с другими молекулами.
Несмотря на преимущества цианиновых красителей, широкое использование их в проточной цитометрии в нашей стране ограничено в связи с высокой стоимостью. В лаборатории медицинской биотехнологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН были проведены сравнительные испытания трех производных цианинового красителя Cy5, синтезированных в Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН в виде сукцинимидных эфиров, обозначенных как Cy5 ImD504, Cy5 ImD506 и Cy5 ImD507. В качестве специфического носителя использовали мышиные моноклональные ан-
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
