CC BY
52
1
БИОТЕРАПИЯ 51
>- УДК 615.371/.372:616-006.81-097 I. N. Mikhailova, K. A. Baryshnikov, O. S. Burova, M. I. Lukashina, A. L. Smirnova, N. N. Petenko, I. A. Utyashev, L. V. Demidov, A. Yu. Baryshnikov PHASE I OF CLINICAL TRIAL OF ANTI-TUMOR GENEMODIFY VACCINE. ASSESSMENT OF IMMUNE STATUS N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT The study assessed response of immune system of patients with recurrent skin melanoma to vaccination by antitumor vaccine “Allogen” in phase I clinical trial. Vaccine ‘Allogen” is prepared from irradiated melanoma cells Mel-Pol [1] that were transitorily transfected by gene Tag-7. Patients’ blood lymphocyte subpopulation contents was determined by the panel of monoclonal antibodies against lymphocyte differentiation antigens before the initial vaccination and prior to every following vaccination. CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD11b, CD16, CD25, CD38, CD71, CD95, CD56 antigen expression was analyzed. CD38/CD4, CD38/CD8, CD16b/CD16, CD11b/CD8, CD11b/CD56 antigen expression was assessed by double staining technique. The results showed that vaccination led to increased percentage of positive cells with activation antigens CD25, CD71, CD38, CD95. Key words: anti-tumor vaccine, melanoma, immune status, activation antigens. И. H. Михайлова, К. А. Барышников, О. С. Бурова, М. И. Лукашина, А. Л. Смирнова, Н. Н. Петенко, И. А. Утяшев, Л. В. Демидов, А. Ю. Барышников ПЕРВАЯ ФАЗА КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ГЕНОМОДИФИЦИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ. ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ Оценена реакция иммунной системы больных рецидивирующей меланомой кожи на вакцинотерапию противоопухолевой вакцины Аллоген, проведенной в рамках 1-й фазы клинических испытаний. Вакцина Аллоген -облученные клетки линии меланомы линии Mel-Pol, транзиторно трансфецированные геном tag-7. У больных до вакцинации и перед каждой последующей вакцинацией оценивали субпопуляционный состав лимфоцитов крови с помощью панели моноклональных антител против дифференцировочных антигенов лимфоцитов. Определяли экспрессию антигенов CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD11b, CD16, CD25, CD38, CD71, CD95, CD56. Методом двойной метки оценивали экспрессию антигенов CD38/CD4, CD38/CD8, CD16b/CD16, CD11b/CD8, CD11b/CD56. Результаты исследований показали, что вакцинотерапия приводила к увеличению процента положительных клеток, а также процента активационных антигенов CD25, CD71, CD38, CD95. Ключевые слова: противоопухолевая вакцина, меланома, иммунный статус, активационные антигены. ТТ17ТТТТ17 холевого эффекта. С целью достижения более выра-ВВЕДЕ-ПИЕ женного иммунного ответа используют молекулы, ко- Меёан°ма считается иммун°зависим°й опухо- торые тем или иным способом могут активировать ль^ поэтому для лечения ее испоёьзуются препара- специфический иммунный ответ на опухолевые анти-ты, вёияющие на р^лтньге звенья специфического гены. Это достигается путем введения в опухолевые противоопухолевого иммунитета. В настоящее время клетки генетических конструкций, кодирующих син-широко изучается активная специфическая иммуноте- тез соответствующих активационных молекул, напри-рапия в виде цельноклеточных вакцин (аутологичных мер, трансфекция опухолевых клеток генами цитоки-иёи аллогенных). Однако специфическое иммуноло- Нов и интерлейкина-2 (ИЛ-2) или гранулоцитарно-ма-гическое воздействие толыш аутологичных кёеток не- крофагального колониестимулирующего фактора достаточно для получения объективного противоопу- (ГМ-КСФ) и др ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
Моноклональные антитела, использованные в работе
Таблица 1
Клон Прямая метка CD Специфичность
ICO-90 F CD3 Т-клетки
ICO-86 F CD4 Т-хелперы
ICO-31 F CD8 Т-супрессоры/ цитотоксические
ICO-180 F CD20 В-лимфоциты
ICO-105 F CD25 Рецептор интерлейкина-2
ICO-92 F CD71 Рецептор трансферрина
ICO-20 PE CD38 Лимфоциты, их предшественники, активированные Т-клетки
ICO-160 F CD95 РА8-антиген, опосредующий апоптоз
ICO-116 F CD16 1ЧК-клетки, моноциты, гранулоциты
ICO-GM1 PE CD lib СЗ^рецептор СЗ копм. комплимента
ICO-186 - CD56 КК-клетки, некоторые Т-клетки (КСАМ)
В Институте биологии гена РАН из лимфоцитов человека выделен и охарактеризован как активный стимулятор специфического противоопухолевого иммунитета ген tag-7 [2]. Он реализует иммуномодулирующее действие посредством усиления хемотаксиса и ускорения созревания дендритных клеток. В опытах на изогенных мышах было показано, что аутологичная трансплантация клеток меланомы B16F10, транфецированных геном tag7, приводила к отмене прививаемости этой опухоли у 50% животных. Аналогичный опыт, проведенный на мышах nude, дефицитных поТ-лимфоцитарному иммунному ответу, не показал подобного эффекта [3]. Эти результаты послужили основанием для использования гена tag7 в качестве трансфецирующего агента при приготовлении препарата Аллоген из клеток человеческой меланомы mel Р [1]. Противоопухолевая вакцина Аллоген приготовлена из клеток меланомы человека, модифицированных геном tag-7. Препарат готовится из клеток меланомы Мел-Р, полученных из метастаза лимфатического узла больного с диагнозом диссеминированной меланомы. Была проведена 1-я фаза клинических испытаний, целью которой была эскалация доз и определение безвредности препарата при введении онкологическим больным. Во время вакцинотерапии изучалось изменение иммунного статуса. Целью данной работы явился анализ изменений иммунной системы в процессе вакцинотерапии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Схема вакцинации: больные получали 2,0х106 клеток. Способ введения: внутрикожно, 6-8 инъекций (в плечо, лопаточную, паховую, околопупочную области), с интервалом раз в 1-2 нед.
Забор крови для исследования иммунного статуса проводили до вакцинации и далее перед каждой последующей вакцинацией.
Экспрессию антигена определяли в реакции прямой поверхностной иммунофлюоресценции с помощью панели моноклональных антител производства ООО «НПЦ МедБиоСпектр» (табл. 1).
Для этого 5х105 клеток инкубировали с 20 мкл МКА, конъюгированных с FITC, в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего 10 мин отмывали в 1 мл PBS при 1500 об/мин. По окончании инкубации к клеткам добавляли 2 мл раствора для лизиса эритроцитов, инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре и осаждали в течение 10 мин при 1500 об/мин. После этого клетки дважды отмывали в 1 мл PBS в тех же условиях, осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл 1%-ного раствора формалина и анализировали на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Beckton Dickinson).
Анализировали результаты определения экспрессии антигенов до вакцинотерапии с максимальными показателями экспрессии в процессе терапии, с использованием программного обеспечения CellQuest, с применением пакета статистических программ Statistica 6.0; при помощи t-критерия Стьюдента.
Результаты считались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ был проведен у 12 пациентов, которые получили от 2 до 31 вакцинаций.
Через неделю после 1-й инъекции исследование иммунного статуса проводили у 8 из 12 больных. Произошли следующие изменения: экспрессия CD3, CD4,
Таблица 2
Изменение процента антиген-положительных лимфоцитов в процессе вакцинации
(—
Антиген До вакцинации x± SD После вакцинации x±SD P Количество больных
CD3 72,74±9,20 78,25±11,45 >0,05 12
CD4 42,33±7,43 49,06± 10,75 >0,05 12
CD8 29,51±9,97 33,46±12,64 >0,05 12
CD4/CD8 1,64±0,77 1,98±0,99 >0,05 12
CD20 9,47±5,37 12,31 ±5,24 >0,05 12
CD25 5,82±4,69 10,09±8,87 =0,05 12
CD71 4,74±3,31 7,87±2,88 <0,02 12
CD38 29,64±17,67 40,7±14,24 >0,05 12
HLA-DR 15,28±6,26 16,52±3,47 >0,05 12
CD95 45,04±10,28 56,58±10,30 <0,02 11
CD16 12,08±5,99 16,27±9,53 >0,05 11
CD lib 34,03±12,27 41±12,26 >0,05 12
CD56 21,35±8,52 21,31±6,85 >0,05 12
CD38PE/CD4F 10,91±5,18 18,74±7,54 <0,02 12
CD38 PE/CD8 F 9,37±4,41 14,23±7,33 >0,05 10
CD lib PE/CD 16 F 14,52±7,75 15,97±7,89 >0,05 6
CD lib PE/CD8 F 14,86±10,03 19,3±1,53 >0,05 10
CD1 lb PE/CD56 F 20,1±7,07 30,4±15,83 >0,05 2
н
0038, С011Ь антигенов повысилась у 4 из 8 пациентов. Через месяц после 1-й вакцинации обнаружили повышение С03 у 5 из 12 больных, С04 у 4 из 12, СО8 у 3 из 12, С038 у 8 из 12, С011Ь у 4 из 12. Для статистического анализа мы сравнили показатели до вакцинации и в момент наивысшего иммунологического ответа (табл. 2).
Было отмечено, что экспрессия С03+ повышалась с 72 до 78 %, однако результаты статистически не значимы.
Как видно из таблицы, процент С04+ клеток повышался с 42,33±7,43 до 49,06±10,75, но статистически не значимо. Процент С08+ клеток существенно не изменялся.
Было обнаружено статистически значимое повышение экспрессии активационных маркеров. Так процент С025+ - клеток увеличился в 2 раза с 5 до 10 % (р=0,05). Экспрессия рецептора трансферрина (С071+) клеток повысился с 4,74±3,31 до 7,87±2,88 (р<0,02), содержание С095+ - клеток увеличилось с 45 до 56 (р>0,01). Содержание С038+ клеток увеличилось с 29 до 40 %
(р<0,05). Процент CD16+ (NK cell), CD11b и CD56 статистически значимо не менялся.
Исследование методом двойной метки продемонстрировало повышение процента клеток, экспрессирующих CD38PE/CD4F антигены (р=0,02).
Изменения субпопуляции NK-клеток CD 11b PE/CD16 F, CD11b PE/CD8 F, CD11b PE/CD56 F были статистически не значимы, что связано, вероятно, с малой численностью групп.
Процент содержания В-клеток не менялся.
Работа была выполнена при финансовой поддержке правительства г. Москвы в рамках научнотехнической программы!”Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний”
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом проведенное исследование показало, что в процессе вакцинотерапии вакциной Аллоген
повышается экспрессия активационных антигенов на Т-клетках.
ЛИТЕРАТУРА
1. Петенко Н.Н., 'Михайлова И. Н., Лукашина М. И., Барышников А. Ю. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. - 2005. - № 7. - С. 37-40.
2. Kiselev S. L. et al. Molecular cloning and characterization of the mouse tag7 gene encoding a novel cytokine // J Biol Chem. - 1998. - 273. - Р. 18633-18639.
3. Larin S. S. et al. Immunotherapy with autologous tumor cells engineered to secrete Tag7/PGRP, an innate immunity recognition molecule // J Gene Med. - 2004. -6(7). - Р. 798-808.
Поступила 25.09.2006
