CC BY
57
БИОТЕРАПИЯ
А. Ж. Абилъдаева, С. М. Адекенов
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕАКТИВНОСТИ ЦЕНТРАЛЬНЫХ ОРГАНОВ ИММУНИТЕТА ПРИ ИНДУЦИРОВАННОМ ХРОНИЧЕСКОМ ЭНДОМЕТРИТЕ
Институт фитохимии МОН РК, г. Караганда, Казахстан
Цель исследования — изучить особенности реактивности тимуса и селезенки при экспериментальном хроническом эндометрите в условиях применения арглабина.
Материалы и методы. Эксперименты проведены на белых беспородных крысах-самках массой 180-200 г. Модель хронического эндометрита воспроизводили путем введения 2% водно-солевого экстракта ткани матки и яичника и полного адъюванта Фрейнда. Арглабин вводили внутрижелудочно в крахмальной слизи в дозах 5 и 10 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали тималин (10 мг/кг). По окончании лечения животных забивали декапитацией под легким эфирным наркозом через 14 сут лечения, тимус и селезенку фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин.
Результаты. Применение арглабина в дозе 10 мг/кг значительно влияло на реактивность центральных органов иммунитета. Микроскопическая картина соответствовала наблюдаемой при лечении тима-лином. На 14-е сутки характерным для группы, где применяли арглабин в дозе 10 мг/кг, являлась разнонаправленная реакция тимоцитов коркового и мозгового вещества, уменьшение некоторых показателей ниже цифр контрольных животных. Отмечалось усиленное формирование телец Гассаля. Таким образом, на 14-е
сут эффект арглабина в дозе 10 мг/кг явился более выраженным, чем в дозе 5 мг/кг. По-видимому, арглабин в дозе 10 мг/кг обладает способностью вызывать усиленную миграцию клеток из мозгового вещества.
При микроскопическом исследовании селезенки отмечалось снижение удельной плотности Т-лимфо-цитов в периартериальной зоне. В красной пульпе увеличился объем макрофагально-лимфоцитарных скоплений. На основании этих данных можно предположить, что арглабин в дозе 10 мг/кг стимулировал отток Т-лимфоцитов из Т-зависимой периартериальной зоны и процессы фагоцитоза, которые протекают в селезенке и в норме, в связи с чем мы наблюдали приток макрофагов и увеличение объема лимфоцитарно-мак-рофагальных инфильтратов в красной пульпе.
Выводы. Морфологические исследования показали, что арглабин в дозе 10 мг/кг действовал достаточно эффективно на центральное звено иммуногенеза. Эффект арглабина в дозе 10 мг/кг явился более выраженным, чем его действие в дозе 5 мг/кг или применение препарата сравнения, что проявлялось в уменьшении количества тимоцитов в корковом и мозговом отделах, причем в последнем — до цифр ниже нормы.
Н. К. Ахматова1, М. В. Киселевский2, Е. А. Курбатова1, Н. Б. Егорова1, И. Б. Семенова1, Б. Ф. Семенов1
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВАКЦИНЫ "ИММУНОВАК ВП-4" ДЛЯ АДОПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОБРАЗОВАНИЙ
1 ГУ НИИ Вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва
2 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В настоящее время в качестве индукторов созревания дендритных клеток (ДК) используются различные, как правило не фармакопейные, биологически активные вещества (фактор некроза опухолей, простаг-
ландин E2, бактериальные липополисахариды и др.). Поскольку пульсированные in vitro различными пептидами ДК способны презентировать антигены наивным T-лимфоцитам in vivo и индуцировать иммунные
реакции против опухолей, на их основе создаются и проходят клинические испытания терапевтические вакцины. Поэтому перспективным для генерации зрелых ДК является применение афицинальных иммуномодуляторов микробного происхождения, т. к. они несут патоген-ассоциированные молекулярные структуры (ПАМС), распознаваемые системой врожденного иммунитета. К таким препаратам относится поликом-понентная бактериальная вакцина «Иммуновак ВП-4», в состав которой входят антигены условно-патогенных микроорганизмов, что обеспечивает наличие таких ПАМС, как ЛПС, пептидогликаны, липопротеины, липид А, тейхоевые кислоты. «Иммуновак ВП-4», учитывая ее иммунотропную активность, может также использоваться для получения ex vivo активированных лимфоцитов (Л).
Цель исследования — изучение влияния вакцины «Иммуновак-ВП-4» на иммунофенотип и функциональную активности ДК и Л.
Материалы и методы. Цитотоксический потенциал Л мышей (n=15) определяли на линии клеток Уас-1 и опухоли Эрлиха при помощи МТТ-теста. Пролиферативную активность клеток оценивали колориметрическим тестом с использованием витального красителя alamarBlue (США). ДК получали из клеток костного мозга мышей при инкубации с рекомбинантными ГМ-КСФ и IL-4 (Biosource, США). Для индукции созревания ДК использовали вакцину ВП-4 (50 мкг/мл).
Результаты. У мышей линии СВА, иммунизированных вакциной ВП-4 однократно внутрибрюшинно
(400 мкг/мышь), отмечалось усиление пролиферативной и цитотоксической активности Л (через 24 ч) против КК-зависимой опухолевой линии Уас-1. Цитоток-сическая активность Л у иммунизированных мышей повышалась почти в 2 раза (с 42,85±4,09 до 85,01±2,11 %). У мышей в течение первых 8 ч после вакцинации в сыворотках крови отмечалось повышение уровня следующих цитокинов: ІЬ-1в (в 40 раз), ІЬ-
2 (в 1,7 раз), ІЬ-6 (в 282 раза), ІЬ-10 (в 38 раз), ІЬ-12 (в 9 раз), ТОТ-а (в 5 раз) и ЮТ-у (в 30 раз). Уровень ІЬ-4 снижался по сравнению с интактными мышами в 17 раз. Преимущественное повышение ІЬ-6, ТОТ-а и ІЬ-10 может свидетельствовать о балансе про- и противовоспалительных цитокинов, а возрастание уровня ІЬ-12 и ЮТ-у — об активации антигенпрезентирую-щих клеток, усилении межклеточных взаимодействий и инициации иммунного ответа. Применение ВП-4 позволяет получить зрелые ДК, характеризующиеся типичной морфологией и фенотипом (СБ34-, СБ38+, СБ40+, СБ80+, СБ86+, МНС І+, МНС ІІ+, Б4/80 +). ДК обладали способностью усиливать бласттрансформа-цию сингенных Л и повышать цитотоксичность Л по отношению к клеткам УАС-1 и опухоли Эрлиха. При антигенной стимуляции ДК лизатом клеток УАС-
1 и опухоли Эрлиха получены иммунные лимфоциты, обладающие высокой цитотоксичностью по отношению к одноименным линиям клеток.
Выводы. Полученные данные свидетельствуют
о возможности применения ВП-4 в качестве индуктора созревания ДК при получении ДК-вакцин и активатора киллерной активности Л.
А. Е. Бережной1, С. С. Ларин2, О. С. Бурова1, Л. Ф. Морозова1, И. Н. Михайлова1, С. Л. Киселев2, Л. В. Демидов1, А. Ю. Барышников1
ПОЛУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА, СЕКРЕТИРУЮЩЕЙ ГМ-КСФ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Институт биологии гена РАН, Москва
Ранее в НИИ ЭДиТО совместно с НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН был получен ряд перевиваемых in vitro меланомных клеточных линий от больных с диссеминированной меланомой.
Цель данной работы — получение стабильной клеточной линии меланомы человека, секретирующей ГМ-КСФ в иммунологически активных концентрациях (не менее 36 нг на 106 клеток за 24 ч).
Материалы и методы. В качестве основы для создания линии, секретирующей ГМ-КСФ, была выбрана клеточная линия, не имеющая на своей поверхности антигенов гистосовместимости I и II классов. Для трансфекции была использована созданная в ИБГ РАН генетическая конструкция на основе вектора pBK-CMV (ClonTech), содержащая кДНК человечес-
кого TM-КСФ. В качестве средства доставки ДНК были использованы наборы для липофекции Unifectin M, 21 и 5б, любезно предоставленные канд. хим. наук A. Ю. Суровым (ИБХ Р\Н). Определение продукции TM-КСФ клонами меланомы проводили методом им-муноферментного анализа культуральной жидкости при помощи коммерческих наборов производства Diaclone и BioSource.
Результаты. Была проведена липофекция клеток генетической конструкцией, кодирующей TM-КСФ при помощи набора Unifectin 21. Tpaнсфициpовaнные клоны были получены после 7-дневного культивирования клеток в среде, содержащей селективный антибиотик (G418, фирма Sigma), и последующего отбора и доращивания в планшетах. В результате было полу-
чено 86 стабильно трансфицированных клонов. Образцы супернатанта, собранного за 24 ч культивирования от всех клонов, были исследованы в ИФА; ГМ-КСФ обнаружен в 32 образцах в концентрации от 0,5 до 14 нг/мл (106 кл./мл).
Для дальнейшей работы были отобраны несколько клонов, в одном из которых после двукратного субклонирования удалось достичь продуктивности 88 нг/мл. Продукция ГМ-КСФ высокопродуктивными клонами была подтверждена внутриклеточным окрашиванием ГМ-КСФ-специфическими антителами с последующим анализом на проточном цитофлюори-метре. Биологическая активность секретируемого ГМ-КСФ определялась по способности супернатантов поддерживать пролиферацию ГМ-КСФ-зависи-мой клеточной линии ТБ-1.
Установлено, что облучение в дозе 87 Гр не снижает количества секретируемого ГМ-КСФ, более 50 % клеток сохраняют жизнеспособность в течение 5 дней и при этом инактивированные клетки не пролиферируют in vitro.
Выводы. При помощи липофекции исходной клеточной линии генетической конструкцией, кодирующей ГМ-КСФ, удалось получить стабильные клоны клеток, секретирующие этот цитокин исходно в относительно низкой концентрации. Последующее субклонирование в среде с селективным антибиотиком позволило повысить продуктивность клонов приблизительно в 10 раз от исходного уровня.
Заключение. В результате выполненной работы получен стабильный клон меланомы человека, секре-тирующий 88 H^W^h ГМ-КСФ.
Д. Ю. Блохин1, А. Д. Михайлов2, А. А. Соколовская1
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАНОБИОТЕХНОЛОГИЙ ДЛЯ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМОВ КЛЕТОК ШЯКАТ^Т И А4
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Центр биотехнологии Университета г. Турку, Финляндия
Одно из достижений в области нано биотехнологий — создание измерительных инструментов для мультипараметрического анализа смесей биополимеров без их предварительного разделения. К таким инструментам относятся микрочипы (microchips) — двухмерные матрицы из большого числа измерительных ячеек, аранжированных в формате таблицы: каждая ячейка, представляющая собой биосенсор со строго определенным молекулярным зондом, имеет координаты по вертикали и по горизонтали («адрес»), что позволяет однозначно идентифицировать сигнал, полученный из каждой ячейки чипа.
Синтетические олигонуклеотиды, являющиеся молекулярными зондами в ячейках, могут быть использованы для одновременного анализа экспрессион-ной активности большого числа генов. Применение нескольких флюоресцентных меток в одном анализе позволяет проводить сравнительное измерение активности генов в разных клетках.
Материалы и методы. Из тотальных лизатов ин-тактныхш и ТКАШ-стимулированных8т клеток Jurkat/wt, а также родственного клона А4 изолирована суммарная мРНК, на матрицах которой получены соответствующие библиотеки кДНК, каждая из которых помечена цианиновыми флюорофорами Cy3 (зеленая метка) и/или Cy5 (красная метка). Библиотеки кДНК
попарно смешаны (Су3 + Су5), и смеси гибридизова-ны с зондами ДНК-микрочипов Affymetrix. По соотношению зеленого и красного сигналов из каждой ячейки чипа определено абсолютное и относительное содержание исходных мРНК в исследованных клетках.
Результаты. В клетках А4 обнаружена активация ряда генов, кодирующих «лиганды смерти» (FasL, TRAIL, TNF-a, LTA, LTB, CD70) и «киллерные медиаторы» (гранзимы А и В), что делает их киллерный аппарат более агрессивным. Снижение транскрипционной активности генов Bcl-2 и Bcl-X в клетках А4, а также активация генов 5’-NT (CD73) и HSP90 подтверждена иммунометрическим определением их белковых продуктов (иммуноблоттинг).
TRAIL-стимуляция чувствительных (Jurkat/wt) и резистентных (А4) к индукции апоптоза клеток сопровождается активацией и репрессией в них одних и тех же генов, что соответствует нашим результатам
о независимости активации программы гибели клеток от синтеза в них белка de novo (циклогексимид не предотвращает индукцию их апоптоза).
Выводы. Использование технологии ДНК-микрочипов позволяет рационализировать тактику исследования многокомпонентных молекулярных процессов, провести первичный скрининг генов, кодирующих возможные участники каскадных реакций в разных клетках.
А. А. Борунова, Г. 3. Чкадуа, Т. Н. Заботина, Л. В. Демидов
ИММУНОФЕНОТИП ЛИМФОЦИТОВ БОЛЬНЫХ МЕЛАНОМОЙ НА ФОНЕ ВАКЦИНОТЕРАПИИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Среди биотерапевтических подходов к лечению онкологических заболеваний в последнее время все большее значение приобретает вакцинотерапия.
Цель данной работы — изучить изменения иммунофенотипа лимфоцитов больных меланомой на фоне вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками.
Материалы и методы. В исследование были включены больные диссеминированной меланомой, получавшие вакцинотерапию: в течение 1 мес. — 2 вакцинации (и=15), 3 мес. — 5 вакцинаций (п=9) и 6 мес. — 9-10 вакцинаций (и=6). Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови определяли по экспрессии Т-клеточных — СБ3, СБ4, СБ8, В-клеточно-го — СБ20, КК-клеточного — СБ16 и активационных антигенов — НЬЛ-Бг, СБ38, СБ25, СБ95.
Результаты. При исследовании Т-клеточного звена иммунитета у большинства больных до начала терапии определялась высокая экспрессия СБ3. Через месяц, а также в группах больных, получавших лечение в течение 3 и 6 мес., было отмечено увеличение экспрессии СБ3 у всех больных. До начала терапии у 13 % больных экспрессия СБ8 была ниже нормы, у 20 % — выше, а у остальных больных соответствовала норме. Через месяц от начала вакцинотерапии, а также в группах больных, получавших лечение в течение 3 и 6 мес., у 67 % больных было зарегистрировано увеличение экспрессии СБ8. У 60 % больных до
начала вакцинотерапии экспрессия СБ4 была в пределах нормы, у 26,5 % больных — ниже и у 13,5 % — выше нормальных значений. Через месяц от начала терапии у половины больных отмечалось снижение экспрессии СБ4 и в 40 % случаев — увеличение. В группе больных, получавших вакцинотерапию в течение 3 и 6 мес., в 67 % случаев уровень экспрессии СБ4 был значительно выше нормальных показателей.
В-клеточное звено иммунитета оставалось в пределах нормы на протяжении всей вакцинотерапии. Количество КК-клеток до начала лечения у 60 % больных было ниже нормы, через месяц у всех больных экспрессия СБ16 достигла нормальных значений, а в дальнейшем на фоне терапии у половины больных его экспрессия нарастала, превышая норму.
Исследование активационных антигенов показало, что до начала вакцинотерапии у всех больных экспрессия СБ25 на лимфоцитах была в пределах нормы, уже через месяц было отмечено повышение его экспрессии, увеличивающееся с числом вакцинаций. Аналогичная динамика изменений уровня экспрессии наблюдалась для СБ38 и СБ95. Экспрессия НЬЛ-Бг до начала вакцинотерапии у большинства больных была значительно снижена и на фоне терапии увеличивалась до нормальных значений.
Выводы. На фоне вакцинотерапии наблюдается увеличение экспрессии антигенов Т-клеточного звена иммунитета, КК-клеток и активационных антигенов.
О. А. Бочарова1, Р. В. Карпова1, С. В. Чулкова1, Е. В. Бочаров2, М. В. Мезенцева3
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА IV СТАДИИ К ФИТОАДАПТОГЕНУ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
3 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва
Клинико-иммунобиологическая эффективность нием для дальнейших исследований, направленных комплексного фитоадаптогенного препарата Фито- на коррекцию иммунобиологических нарушений микс-40 (ФМ-40) в лечении доброкачественного про- и клинических проявлений злокачественных патоло-цесса и предракового заболевания является основа- гий, в частности рака желудка. В связи с этим целью
работы явилось определение чувствительности иммунной системы больных раком желудка IV стадии к ФМ-40.
Материалы и методы. Влияние препарата на иммунологический фенотип лимфоцитов больных раком желудка IV стадии оценивали в непрямой реакции иммунофлюоресценции. Применяли одночасовую инкубацию цельной крови с препаратом в 3 дозах с соответствующим спиртовым контролем. Исследовали уровни экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4, CD8, CD16, CD20; молекул адгезии CD11b, CD18. Интерфероновый (ИФН) статус оценивали биологическим методом по 2 ступеням: количественной — определение уровня спонтанного ИФН и качественной — определение влияния разных препаратов ИФН и его индукторов, а также ФМ-40 на интерферо-ногенез лимфоцитов in vitro.
Результаты. Выявлено, что ФМ-40 не нарушал экспрессии антигенов на клеточной поверхности лимфоцитов. Более того, отмечена положительная динамика иммунологических показателей при инкубации
с высокой дозой препарата in vitro, соответствующей 45,0 мл/сут при приеме in vivo: рост хелперно-супрес-сорного соотношения ^D4/CD8), нормализация числа Т-супрессоров, улучшение показателей естественной резистентности (CD16, CD11b), В-клеточного звена иммунитета (CD20). Также под влиянием препарата выявлено повышение процента клеток CD11b и CD18, что предполагает провоспалительную стимуляцию и, соответственно, повышение иммунореактивности организма онкологического больного.
Выработка интерферона клетками крови больных раком желудка IV стадии под воздействием ФМ-40 в результате неспецифической индукции превышает проявляемую известными индукторами (ридостин, неовир, амиксин, циклоферон). Чувствительность клеток крови всех больных к воздействию комплексной фитомикстуры свидетельствует об отсутствии резистентности к препарату у 100 % пациентов.
Выводы. В результате определена эффективная доза (45 мл/сут) и предполагаемая схема применения ФМ-40 у больных раком желудка IV стадии.
О. А. Бочарова1, В. И. Шейченко2, О. П. Шейченко2, Р. В. Карпова1
МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЙ АСПЕКТ ПРИМЕНЕНИЯ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ФИТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ФИТ ОМИКСА-40
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Всероссийский институт лекарственных и ароматических растений, Москва
Препарат Фитомикс-40 — биологически стандартизованный фитоадаптоген, обладающий иммуномодулирующей, интерфероногенной, антиоксидантной, антиметастатической, радиопротекторной активностью. Производство и применение фитопрепарата диктуют необходимость создания методологических основ и способов его фитохимической стандартизации.
Цель работы — определение возможности использования метода ЯМР, в частности двумерной го-моядерной корреляционной ЯМР-спектроскопии (COSY), для изучения химического состава и стандартизации многокомпонентного препарата и установления его подлинности во избежание подделок.
Материалы и методы. ЯМР-спектры регистрировали на спектрометрах Gemini с рабочей частотой 200 и 400 МГц.
Результаты. При разработке метода анализа исследуемых сухих экстрактов с помощью ЯМР-спектроскопии осуществлен подбор растворителя, условий подготовки образцов, параметров снятия спектров. Для каждого из 40 водно-этанольных экстрактов получены одномерные 1Н ЯМР-спектры и двумерные спектры COSY. Получены также спектры этилацетатного и бутанольного извлечений из препарата, которые со-
держат относительно небольшое количество сахаров. Предварительный анализ ЯМР-спектров показывает, что в препарате, а также в экстрактах всех растений преобладают сахара, среди которых основная масса принадлежит глюкозе, дающей два характерных сигнала в виде дублетов. Значительно меньше содержание терпеноидных и флавоноидных гликозидов, танинов и других соединений с ароматическими кольцами. Интенсивные сигналы (2 дублета и 1 синглет) в слабом поле принадлежат моногликозиду арбутину. Существенные различия в положении кросс-пиков в спектрах COSY позволяют предположить, что спектры COSY экстрактов могут быть использованы для идентификации (установления подлинности) растений.
Выводы. Корреляция полученных ЯМР-характери-стик отдельных экстрактов с литературными данными позволяет сделать вывод об эффективности ЯМР-спек-троскопии в изучении химического состава как комплексного препарата, так и экстрактов из растений, входящих в его состав. Вместе с тем полученные различия в положении кросс-пиков для Фитомикса-40 и препарата сравнения позволяют предположить, что двумерные спектры могут быть использованы для идентификации и установления подлинности Фитомикса-40.
П. К. Иванов, А. С. Гриневич, Е. Ф. Чмутин, Н. В. Голубцова, О. Н. Донская, И. В. Чинарева, О. С. Бурова, А. Ю. Барышников
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРЕПАРАТА АТЭМА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ ДЛЯ КЛИНИКИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина PAMH получены мышиные моноклональные антитела ^КЛ) ICO-90 к антигену CD3 T-лимфоцитов человека. Известно, что CD3 селективно экспрессируется на поверхности зрелых T-лимфоцитов и тимоцитов и связывание антител с ним приводит к резкому угнетению клеточного иммунитета. Благодаря этому MKA ICO-90 могут использоваться для купирования реакций отторжения трансплантата и реакции «трансплантат против хозяина» (при пересадке аллогенного костного мозга), в развитии которых T-лимфоциты играют активную роль. На основе MKA ICO-90 создан препарат ATЭMA, который в настоящее время проходит I/II фазу клинических испытаний для лечения реакции острого отторжения трансплантата почки.
Цель работы — изучение влияния препарата ATЭMA на содержание иммунокомпетентных клеток крови.
Материалы и методы. Исследовался иммунный статус больных, получающих препарат ATЭMA. AHa-лиз проводили методом проточной цитофлюоримет-рии с использованием MKA, направленных против следующих антигенов: CD3 (все T-лимфоциты), CD4 (T-хелперы/индукторы), CD8 (T-супрессоры/цитоток-сические лимфоциты), CD 16 (NK-клетки), CD20 (В-лимфоциты), CD38 (активированные лимфоциты).
Результаты. Как и следовало ожидать, после вве-
дения препарата АТЭМА наблюдается резкое (почти до нуля) и быстрое (в течение часа) падение содержания Т-лифмоцитов в крови, оцениваемое по антигену СБ3. При этом параллельно снижается содержание всех фракцией Т-лимфоцитов (Т-хелперы/индукторы, Т-супрессоры/цитотоксические лимфоциты). После первоначального падения содержание Т-лимфоцитов постепенно восстанавливается, несмотря на продолжение курса применения АТЭМА (ежедневно в течение 10 дней); через 7-10 дней содержание этих клеток восстанавливается до исходного. В соответствии со снижением доли Т-лимфоцитов в общем количестве лимфоцитов крови увеличивается доля В-клеток.
Таким образом, АТЭМА селективно воздействует на популяцию Т-клеток, не затрагивая В-лимфоцитов, обеспечивающих гуморальный иммунитет. Не обнаружено также какого-либо стабильного влияния АТЭМА на содержание КК-клеток, что подтверждает селективность иммуносупрессивного эффекта препарата и возможность сохранения неспецифического иммунитета больных. К настоящему времени в рамках клинических испытаний лечение препаратом АТЭМА получили 19 больных с реакцией острого отторжения трансплантата почки.
Выводы. И имеющиеся данные свидетельствуют
о высокой эффективности препарата при слабовыра-женных побочных эффектах.
М. В. Киселевский1, И. Ж. Шубина1, М. Ю. Вершинина1, Е. О. Халтурина2, Ю. И. Патютко1, Д. А. Забежинский1
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИМФОКИН-АКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ БОЛЬНЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ ПОРАЖЕНИЕМ
ПЕЧЕНИ
Лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) используются в клинической практике онкологии уже более 20 лет. Они могут быть получены из лимфоцитов периферической крови, лимфы, злокачественных
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 ММА им. И. М. Сеченова, Москва
выпотов. В качестве источников для генерации ЛАК могут служить инфильтрирующие печень лимфоциты, которые обнаруживают при опухолевом процессе в этом органе.
Цель исследования — изучение фенотипа и функциональной активности ЛАК, полученных из моно-нуклеарных лейкоцитов печени (МЛп) и периферической крови (МЛк) больных с опухолевым поражением печени.
Материалы и методы. В исследование включено 10 больных в возрасте от 15 до 67 лет с опухолевым поражением печени. МЛп и МЛк больных выделены на градиенте фиколла-урографина. МЛ инкубировали в присутствии 1Ь-2 в течение 48 ч для получения ЛАК. Цитотоксическую активность лимфоцитов определяли на НК-чувствительной линии опухолевых клеток К-562 с помощью МТТ-теста.
Экспрессию поверхностных маркеров МЛ СБ3, СБ4, СБ8, СБ16; СБ25, СБ38, НЬЛ-БК; СБ57, СБ58 определяли методом проточной цитофлюориметрии.
Результаты. МЛп из пораженной печени онкологических больных обладали почти в 3 раза большей цитотоксической активностью по сравнению с МЛк. ЭС50 для этих субпопуляций составляет 1,3 и 3,5 соответственно.
ЛАК, полученные из МЛ печени (ЛАКп), по своей киллерной активности почти на порядок превышают
цитотоксичность ЛАК-клеток, полученных из периферической крови (ЛАКк) (ЭС50 равна 0,27 и 2,2 соответственно). При этом выраженные различия отмечаются при меньших соотношениях. ЛАКп также достоверно превосходят цитотоксичность МЛп (ЭС50 равна 0,27 и 1,3 соответственно).
Уровень экспрессии СБ3, СБ4 и СБ8 на ЛАКп и ЛАКк различен. Экспрессия СБ3 и СБ4 на ЛАКк в 2 и 14,5 раз выше, чем на ЛАКп соответственно, в то время как уровень экспрессии СБ8 выше на ЛАКп. Экспрессия СБ25 на этих клетках существенно не отличается. Наиболее выраженные различия наблюдаются в соотношениях активационных антигенов СБ38 и НЬЛ-БК, уровень которых значительно выше на ЛАКп, чем на ЛАКк (в 2 и 6,5 раз соответственно). Существенных различий в экспрессии других антигенов (СБ16, СБ57, СБ58) на данных клетках не выявлен.
Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что из МЛ печени онкологических больных могут быть генерированы ЛАК-клетки, обладающие более высокой цитотоксической активностью, чем ЛАК-клетки, полученные из МЛ периферической крови больных.
А. М. Козлов, Н. М. Перетолчина, Н. С. Сапрыкина
ДЕЙСТВИЕ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА (ГМ-КСФ) НА РОСТ И МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКОГО ЛЬЮИС И ТЕРАПЕВТИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЦИКЛОФОСФАМИДА
Крайне важным для миелопоэза вообще и формирования клеток иммунной системы в частности имеет ГМ-КСФ. Он относится к семейству гемопоэтинов. Продуцируется макрофагами и Т-лимфоцитами. Основное биологическое действие связано со стимуляцией роста и обеспечением дифференцировки клеток ми-ело-моноцитарного ряда.
Цель исследования — изучить влияние экзогенного рекомбинантного человеческого ГМ-КСФ на рост и метастазирование экспериментальной опухоли, а также противоопухолевую и антиметастатическую активность циклофосфамида (ЦФ).
Материал и методы. Исследование выполнено на мышах линии С57 В1/6 с подкожно трансплантированной карциномой легкого Льюис. ГМ-КСФ вводили животным внутрибрюшинно или п/к в дозах 0,05, 0,5 и 5,0 мкг/мышь на 1-7-й, 7-14-й или 1-14-й день после трансплантации опухолей. Циклофосфан применяли однократно в дозах 100 или 200 мг/кг внутрибрюшинно на 3-й или 7-й день эксперимента.
Результаты. Применение ГМ-КСФ стимулировало как рост первичной опухоли Льюис (на 40-90 %), так и ее метастазирование в легкие (на 22-170 % при разных ре-
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва жимах применения). Эффект зависел от дозы и длительности введения препарата, а также способа его введения. Больший стимулирующий эффект отмечен при внутриб-рюшинном способе введения цитокина. Сочетанное применение ЦФ и ГМ-КСФ значительно снижало эффект цитостатика. Однократное применение одного ЦФ в дозе 200 мг/кг на 3-й день после трансплантации опухоли Льюис увеличивало среднюю продолжительность жизни животных на 185 %, а применение ЦФ на фоне одновременного введения ГМ-КСФ в дозе 0,5 мкг/мышь — лишь на 95 %. Один цитокин не влиял на продолжительность жизни животных с опухолью Льюис.
Выводы. Полученные данные, свидетельствующие о способности ГМ-КСФ стимулировать рост и метастазирование экспериментальных опухолей, обосновывают важность разработки рациональных схем сочетанного применения цитостатиков и модификаторов биологических реакций, в частности цитокинов, на стадии доклинического изучения. Можно предположить, что нерациональное использование ростовых факторов гемопоэза может свести на нет как терапевтический эффект их самих, так и эффект комбинированной терапии или даже нанести вред больному.
М. Ю. Ларин1, П. К. Иванов1, Д. Ю. Блохин1, В. И. Филиппов2, О. Л. Ершов3
ТЕХНОЛОГИЯ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ ИММУНОМАГНИТНЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ ОНКОЛОГИИ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН, Москва
3 ФГУП Государственный научно-исследовательский институт химии
и технологии элементоорганических соединений, Москва
В настоящее время в онкологии широко используется трансплантация СБ34-позитивных стволовых кроветворных клеток (СКК). Для их выделения наиболее эффективным является метод иммуномагнитной сепарации с использованием биодеградируемых сорбентов, которые позволяют вводить пациентам выделенную фракцию СКК без отделения их от частиц сорбента.
Цель данной работы — создание биодеградируемых иммуномагнитных сорбентов для выделения СКК из периферической крови или костного мозга.
Материалы и методы. В качестве магниточувствительного компонента иммуномагнитных сорбентов использовали магнетит, обладающий свойствами мягкого ферромагнетика. Для получения устойчивых водных суспензий магнетита с определенными размерами частиц впервые был использован метод стабилизации цитрат-анионом при определенных значениях pH. Это позволило избежать применения поверхностно-активных веществ, что дает значительные методические преимущества.
Результаты. Матрицу сорбента формировали путем адгезии биодеградируемого полисахарида декс-трана на поверхности частиц магнетита в водной суспензии. Для придания частицам механической прочно-
сти и предотвращения десорбции материала матрицы проводили сополимеризацию декстрана с эпихлоргид-рином, который выступал в роли поперечно сшивающего агента.
Для стандартизации частиц носителя по размерам использовали метод корреляционной спектроскопии светорассеяния (Nicomp З80, Nicomp PSS). Maгнитные характеристики измеряли на магнитных весах Фарадея (Bruker). Химический состав контролировали методом инфракрасной спектроскопии (Specord M 80, Carl Zeiss Jena).
Конъюгирование частиц носителя с моноклональными антителами ICO-115 проводили после активации молекул декстрана матрицы периодатным окислением, количественную оценку связывания антител с носителем — методом простой радиальной иммунодиффузии в геле.
Выводы. В результате исследований разработана методика получения и созданы образцы биодеградируемых иммуномагнитных сорбентов со следующими характеристиками: размер частиц — 80±10 нм; удельная намагниченность насыщения — 20±2 A•м2•кг-1; удельная загрузка антителами — 10-50 мкг на 1 мг носителя.
М. Ю. Ларин1, В. И. Филиппов2, П. К. Иванов1, Д. Ю. Блохин1,
Е. А.Голенкина1, О. Л. Ершов3
СОЗДАНИЕ БИОСОВМЕСТИМЫХ ИММУНОМАГНИТНЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ ОНКОЛОГИИ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН, Москва
3 ФГУП Государственный научно-исследовательский институт химии
и технологии элементоорганических соединений, Москва
Метод иммуномагнитной сепарации клеток костного мозга в последнее время все более широко применяется в комплексном лечении онкологических заболеваний. Это обусловлено его высокой избирательностью, значительной производительностью и технологичностью процесса. Ключевую роль в эффективности данного метода играют свойства иммуномагнитных сорбентов.
Целью данной работы явилось создание биосо-вместимых иммуномагнитных сорбентов на основе магнетита и сополимеров стирола для выделения клеток костного мозга путем негативной селекции.
Материалы и методы. Магнетит-полистироловые частицы получали методом радикальной эмульсионной полимеризации. Основу полимерной матрицы составляли сополимеры стирола и поперечно сшивающего
агента дивинилбензола. Для введения в матрицу карбоксильных групп использовали в качестве сомономе-ров метакриловую кислоту и малеиновый ангидрид.
Результаты. Размеры полученных частиц определяли методом корреляционной спектроскопии светорассеяния (Nicomp 380, Nicomp PSS). Магнитные свойства измеряли на магнитных весах Фарадея (Bruker). Химический состав контролировали методом инфракрасной спектроскопии (Specord M 80, Carl Zeiss Jena).
Фракционирование полученных частиц по размерам проводили тангенциальной фильтрацией через фильтрующие элементы из прессованного корунда с заданными размерами пор на установке оригинальной конструкции. Это позволило получать фракции частиц с высокой степенью гомогенности.
Для иммобилизации моноклональных антител использовали активирование магнетит-полистироловых частиц с применением толуолсульфонилхлорида и водорастворимых соединений карбодиимида. Для количественной оценки связывания антител с носителем применяли метод простой радиальной иммунодиффузии в геле.
Выводы. Итогом работы явилось создание методики получения магнетит-полистироловых частиц узкого фракционного состава. Наработанные биосовме-стимые иммуномагнитные сорбенты обладают следующими характеристиками: размер частиц —
1,8±0,1 мкм, намагниченность насыщения — 16±2 А^м^кг-1, удельная загрузка антителами — 20-30 мкг на 1 мг носителя.
В. Ф. Левшин, М. Я. Шашкина, Н. В. Радкевич, В. Г. Дрожжачих, А. В. Сергеев
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФИТОПРЕПАРАТОВ ЧАГОВИТ И СОЛОДКА В ГРУППАХ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО РИСКА
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Задача исследования — оценить эффективность и перспективы применения фитопрепаратов, разработанных в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, в группах онкологического риска: среди лиц, страдающих табакизмом (синдром отмены курения), и больных мастопатией.
Фитопрепарат Чаговит разработан на основе экстракта чаги, обогащен витаминами С, В1, В2, В6, фолиевой кислотой в дозах, обеспечивающих суточную потребность организма. Содержит комплекс полифено-льных соединений (флавоноиды, гуминоподобные пигменты — меланины), фитолектины, микро- и макроэлементы (К, Ка, Са, Мg, 2п) и др., обладает восстанавливающим и адсорбирующим действием, проявляет антиоксидантные, иммуномодулирующие, противовоспалительные, биостимулирующие свойства.
Препарат Солодка разработан на основе экстракта из корней солодки с витамином С. Содержит глицир-ризиновую кислоту, флавоноиды, макро- и микроэлементы. Обладает антиэстрогенным, противовоспалительным и антитоксическим действиями. Участвует в регуляции водно-солевого обмена.
Методы и материалы. Проведена рандоминизи-рованная клиническая апробация фитопрепаратов при лечении 166 пациентов, страдающих табакизмом, из которых 82 человека получали стандартное лечение и 84 пациента в дополнение к нему получали Чаговит
по 2 капсулы 2 раза в день в течение месяца и более с момента отказа от курения, и 164 женщин, больных диффузной формой мастопатии и мастодинии, из которых 56 пациентки принимали Чаговит по 2 капсулы 2 раза в день, 54 — Солодку по 2 драже 2 раза в день и 54 — мастодинон по 30 капель 2 раза в день. Препараты применяли на протяжении минимум 2 менструальных циклов.
Результаты. Доля курящих лиц, достигших абстиненции в сроки больше месяца, составила 35 % в группе с Чаговитом и 12 % (р<0,001) — в группе контроля. У лиц, принимающих Чаговит, чаще улучшалось самочувствие (до 50 %) по сравнению с контролем (17 %; р<0,001). Эффективность лечения мастопатии Чаговитом была сопоставима с эффективностью мастодино-на, который широко используется в клинике при лечении мастопатии. Солодка обладала несколько меньшей активностью. Четкий эффект наблюдался в 68, 67 и 44 случаев (р<0,05) соответственно. Чаговит наиболее эффективен при мастопатиях, развившихся на фоне ас-теноневротического синдрома, который является наиболее распространенным в патогенезе мастопатий.
Выводы. Исследованные фитопрепараты являются перспективными для применения в группах лиц онкологического риска. Они нетоксичны и практически не имеют противопоказаний и побочного действия, за исключением индивидуальной непереносимости.
М. И. Лукашина1, В. А. Алиев1, А. В. Смирнова1, И. В. Самойленко1, И. Н. Михайлова1,
В. П. Вейко2, Ю. А. Барсуков1, А. Ю. Барышников1
СОЗДАНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, ПРИМИРОВАННЫХ СИНТЕТИЧЕСКИМ ПЕПТИДОМ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва
В настоящее время широко исследуется противоопухолевая активность вакцин на основе дендритных клеток. Дендритные клетки (ДК) представляют собой антигенпрезентирующие клетки, контролирующие иммунитет посредством взаимодействия с лимфоцитами. Было показано, что функциональная активность ДК у онкологических больных значительно снижена. Одной из причин этого является неспособность диф-ференцировки ДК в зрелые формы. Культивирование, нагрузка и терминальная дифференцировка ДК in vitro является перспективной стратегией получения зрелых, функционально-активных клеток, пригодных для создания противоопухолевых вакцин.
Материалы и методы. Из периферической крови больных колоректальным раком выделяли мононукле-арные клетки в градиенте плотности фиколла. ДК культивировали из прикрепившихся на пластик моноцитов в присутствии ГМ-КСФ и IL-4, для терминальной дифференцировки использовали TNF-a и PGE2, нагрузку проводили синтетическими пептидами, которые представляют собой 22 тандемных повтора антигена MUC-1, названные rVNTR22 и гёАУ-Ха-'У№Ш22, в концентрации 10, 30 и 50 мкг/мл.
Результаты. После нагрузки синтетическими пептидами и терминальной дифференцировки ДК приобретали фенотип зрелых. Экспрессия CD83 (маркер зрелых ДК) наблюдалась в 30-50 % клеток, CD86
и СБ54 (костимулирующая молекула и молекула адгезии соответственно) — в 50-80 % клеток, НЬЛ-БИ (молекула главного комплекса гистосовместимости II класса) — в 40-80 % клеток, СБ14, СБ3 и СБ20 (маркеры моноцитов, Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов соответственно) — в 1-3 % клеток.
Также определяли наличие остатков синтетических пептидов на поверхности ДК после нагрузки и дифференцировки по связыванию с моноклональными антителами к УЫГК (клоны УЫГКШ_4 и УЫГК1У_6 предоставлены В. Л. Юриным). Наименьшее связывание отмечали при концентрации белка 10 мкг/мл (2-5 % клеток). По мере увеличения концентрации белка увеличивалось количество клеток, связывающихся с антителами клонов УКТКШ_4 и УКТК1У_6, до 15 % при 30 мкг/мл гУ№ГК22 и до 20 % при 50 мкг/мл гУКТИ22. Связывание антител клона УЫТКШ_4 с поверхностью ДК, нагруженных гБЛУ-Ха-УЫТК22, было незначительным (от 1 до 8 % при разных концентрациях пептида). Тогда как антитела клона УЫТК1У_6 связывались с поверхностью ДК, нагруженных гБЛУ-Ха-УЫТК22, в 10-20 % случаев независимо от концентрации белка при нагрузке.
Выводы. Данные пептиды не влияют на созревание и дифференцировку ДК и могут быть использованы для создания противоопухолевых вакцин.
В. М. Моисеенко1, А. О. Данилов1, С. С. Ларин2, А. Б. Данилова1, Н. В. Тюкавина1, И. А. Бал-дуева1, С. Л. Киселев2, Р. В. Орлова1, Е. А. Туркевич1, В. В. Анисимов1, Г. И. Гафтон1,
В. А. Кочнев1, А. С. Барчук1, С. В. Канаев1, К. П. Хансон1, Г. П. Георгиев2
ПРИМЕНЕНИЕ АУТОЛОГИЧНЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ ЦЕЛЬНЫХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ГЕНОМ TAG?, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ КОЖИ И МЕТАСТАТИЧЕСКИМ РАКОМ ПОЧКИ
1 НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова Соцздрава, Санкт-Петербург
2 Институт биологии гена РАН, Москва
Одним из наиболее перспективных подходов к со- продукты, синтезируемые модифицированными опу-зданию противоопухолевых вакцин является модифи- холевыми клетками, активируют антигенпрезентиру-кация опухолевых клеток генами цитокинов. При этом ющие клетки (AnK), стимулируют цитотоксические
Т-лимфоциты, в т. ч. против антигенов клеток данной опухоли. В настоящее время проводится большое количество исследований с целью клинической оценки этого метода биотерапии при опухолях различных локализаций. Белок tag7 является гомологом семейства фактора некроза опухолей, обладает цитотоксически-ми свойствами, способен активировать посредством АПК лимфоциты, которые в свою очередь атакуют и разрушают как модифицированные, так и неизмененные опухолевые клетки.
Цель работы — оценить клиническую и иммунологическую эффективность вакцинотерапии с помощью модификации геном tag7 аутологичных опухолевых клеток у больных диссеминированной меланомой кожи и метастатическим раком почки.
Материалы и методы. Исследование основано на клиническом материале 37 пациентов: 27 больных меланомой кожи (МК) и 10 больных раком почки (РП), получавших лечение в НИИ онкологии им. проф.
Н. Н. Петрова с 2001 по 2004 г. Технология приготовления противоопухолевой вакцины, модифицированной геном tag7, предполагала дезагрегацию образцов опухоли, культивирование клеток, их трансфекцию липосомным методом, анализ экспрессии введенных генов с помощью иммуноблоттинга и облучение с целью блокады пролиферации.
Результаты. Были получены культуры опухолевых клеток, модифицированные геном tag7 (27 культур МК и 10 культур РП), для 37 больных. Минимальное количество трансфицированных клеток в образцах составило 4 %, максимальное — 30 % (в среднем 10,98±1,62 %). Паллиативная вакцинотерапия проводилась 25 пациентам (21 — с МК, 4 — с РП), адъювантная — 12 больным (8 МК после полных циторедуктив-ных операций и 4 РП после радикальной нефрэктомии).
Больные получили от 1 до 18 введений вакцины (в среднем 5 введений). Установлено, что изучаемый
аутологичный вакцинный препарат безвреден для пациентов. Полный регресс у больных не зарегистрирован. У 1 больного МК выявлен частичный регресс метастаза в мягких тканях, продолжительность эффекта составила 16 мес. Стабилизация процесса зарегистрирована у 6 из 21 (29 %) пациентов. Средняя продолжительность безрецидивного периода — 12 мес. (от 1 до 30 мес.). Для больных РП минимальный регресс (менее 50 %) метастазов в легких продолжительностью 12 мес. зарегистрирован у 1 пациента, стабилизация метастазов в легких в течение 7 мес. — у 1 больного. При применении вакцинотерапии с адъювантной целью средняя продолжительность безрецидивной выживаемости составила 5 мес. (от 5 до 7,5 мес.).
Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) через 48 и 72 ч отмечена у 25 пациентов (68 %). У 2 больных МК во время проведения 2-го цикла вакцинотерапии зарегистрирована реакция ГЗТ в контрольной точке — месте введения аутологичных немодифицированных опухолевых клеток («bystander effect»).
Иммунологический мониторинг показателей периферической крови больных в процессе вакцинотерапии выявил тенденцию к увеличению абсолютного содержания Т-клеток в периферической крови и усилению их функциональной активности.
Выводы.
1. Вакцинотерапия аутологичными опухолевыми клетками, модифицированными геном tag7, хорошо переносится больными и сопровождается определенным иммунологическим и клиническим эффектом.
2. Целесообразно повторение курсов вакцинотерапии для поддержания эффекта лечения при контроле состояния иммунной системы пациента.
Исследование поддержано средствами Правительства Москвы.
Д. В. Перлин, С. К. Яровой, П. К. Иванов, Г. Л. Менткевич
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ПРЕПАРАТА АТЭМА: ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН по гибри-домной технологии получены мышиные моноклональные антитела (МКА) 1С0-90 к антигену СБ3 Т-лимфоцитов человека. Внутривенное введение этих антител человеку приводит к быстрому и почти полному удалению Т-лимфоцитов из периферической крови, благодаря чему эти МКА могут использоваться для купирования реакций отторжения трансплан-
тата и реакции «трансплантат против хозяина» (при пересадке аллогенного костного мозга), в развитии которых Т-лимфоциты играют активную роль. На основе МКА ІС0-90 создан препарат АТЭМА, который в настоящее время проходит І—II фазу клинических испытаний. Основным показанием к применению препарата является купирование реакции острого отторжения трансплантата после пересадки почки.
К настоящему времени препарат применялся для купирования реакции острого отторжения у 19 больных, и в 16 (84 %) случаях криз отторжения купирован с восстановлением функции трансплантата. У 2 (10,5 %) больных развились побочные эффекты (преходящая энцефалопатия и отек легких), потребовавшие дополнительного лечения. Однако у этих больных курс применения препарата АТЭМА не прерывался, и криз отторжения трансплантата был успешно купирован.
Помимо применения для купирования реакции острого отторжения, вне протокола исследования, препарат АТЭМА успешно применялся для профилактики отторжения у больного с высоким риском отторжения
(имевшего эпизод острого отторжения трансплантата в анамнезе).
Кроме того, в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН проведены предварительные испытания применения препарата АТЭМА для лечения реакции «трансплантат против хозяина» после аллогенной трансплантации костного мозга онкологическим больным и показана возможность некоторого ослабления тяжести этой реакции по показателю потребности больных в переливаниях тромбоцитной массы.
В целом имеющиеся данные подтверждают высокую иммунологическую селективность и клиническую эффективность и безопасность препарата АТЭМА.
К. А. Скрытник, В. С. Косоруков
СОЗДАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА Е. СОЫ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО ЧГ-КСФ В РАСТВОРИМОЙ ФОРМЕ
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (чГ-КСФ) — один из основных гемопо-этических факторов, применяемых в онкологической клинической практике для стимуляции размножения и созревания нейтрофилов, участвующих в защите организма от инфекций. Введение препарата, содержащего чГ-КСФ, при нейтропении позволяет восстановить уровень нейтрофилов, повысить иммунитет и избежать возникновения сопряженных инфекций. Существующие в настоящий момент рекомбинантные аналоги чГ-КСФ, полученные с использованием бактериальных продуцентов, экспрессируются в нерастворимой форме. Получение чГ-КСФ в растворимой форме позволило бы избежать дополнительных этапов очистки и упростить процесс получения рекомбинантного аналога.
Цель данной работы — получение штамма, экспрессирующего чГ-КСФ в растворимой форме.
Материалы и методы. Последовательность чГ-КСФ была модифицирована путем сайт-направленно-го мутагенеза с использованием ПЦР. PTYB11 (NEB) с интеином и хитинсвязывающим доменом (CBD) был использован в качестве экспрессионного вектора. В результате клонирования интеин был слит с N-концом чГ-КСФ. Индукцию экспрессии проводили с помощью IPTG. ИФА и вестерн-блоттинг использовали для идентификации домена чГ-КСФ в бактериальных
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
лизатах. Для очистки белка использовали Chitin beads (NEB), а ДТТ — для индукции автопротеолитической активности интеина.
Результаты. Ген чГ-КСФ клонирован в вектор pTYB11. B жидкой фракции лизатов была обнаружена растворимая форма гибридного белка. Домен чГ-КСФ обладает третичной структурой, соответствующей таковой в нативном белке. Гибридный белок практически полностью связывается с хитиновым сорбентом, что свидетельствует о том, что CBD функционально активен. Однако оказалось, что автопротеолитическая активность интеина не индуцируется под действием тиольных реагентов. На N-конце чГ-КСФ расположены аминокислоты Thr и Pro. Несмотря на то, что наличие Thr в сайте гидролиза обеспечивает эффективный разрыв связи между интеином и целевым белком, нахождение циклической молекулы Pro непосредственно у сайта гидролиза вызывает конформационные изменения, что, очевидно, ингибирует протеолитическую активность интеина, внося стерические изменения, препятствующие эффективному гидролизу.
Выводы. Интеин повышает растворимость белка. Создан экспрессионный вектор, несущий гибридный белок с CBD, интеином и чГ-КСФ. Белок экспрессируется в растворимой форме. Белок правильно свернут и идентифицируется в растворимой фракции. Биологическая активность белка исследуется.
Е. Г. Славина, А. И. Черткова, О. В. Короткова, С. Л. Гуторов, Н. Н. Петенко,
Т. Н. Заботина, А. А. Буркова
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВ И ЦИТОКИНОВ В ЦИТОТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ И ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Химиотерапия — основной метод лечения при злокачественных опухолях, осложненных метастазами, оказывается эффективной и обеспечивает значительное увеличение продолжительности жизни больных лишь в части случаев. Большинство метастатических вариантов рака или резистентны к химиотерапии, или становятся таковыми в процессе лечения. Повышение эффективности противоопухолевой лекарственной терапии в ряде случаев достигается совместным применением химиопрепаратов и различных иммуномодуляторов и цитокинов. В настоящее время в клинике широко используются препараты цитокинов, в частности интерферон, интерлейкин-2, фактор некроза опухолей-а. Имеется обширная литература с описанием усиления интерферонами чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевым лекарствам. Однако практически ничего не известно о механизмах этого усиления.
Цель исследования — изучить зависимость усиления цитотоксичности и апоптозиндуцирующей активности противоопухолевых лекарств интерфероном-а и фактором некроза опухолей-а от интенсивности экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (МБК-1) и гена, сдерживающего апоптоз (Вс1-2).
Методы и материалы. В работе были использованы культуры опухолевых клеток НТ-29 (аденокарцинома толстой кишки человека), интактные и инфицированные геном МБК-1, а также клетки линии НеЬа, интактные и инфицированные геном Вс1-2. Эффективность цитотоксического действия доксорубицина и 5-фторурацила в отношении этих опухолевых клеток определяли с использованием высокочувствительного полуавтоматического колориметрического метода — МТТ-теста. Интенсивность процессов апоптоза оценивали проточной цитофлюориметрией клеток, окрашенных после спиртовой фиксации пропидиума йоди-
дом. Рекомбинантные препараты цитокинов — интерферон-a (Roferon A, F. Hoffman La Roche, Швейцария) и фактор некроза опухолей-a (отечественный препарат альнорин) использовали в нетоксичных и не индуцирующих апоптоз концентрациях.
Результаты. Показано, что как интерферон, так и альнорин существенно усиливают цитотоксический эффект противоопухолевых препаратов в отношении панели опухолевых клеток. Это действие, по-видимому, не зависит от модуляции экспрессии гена MDR-1, т. к. проявляется в равной мере против как неизмененных, так и гиперэкспрессирующих этот ген клеток. Кроме того, они усиливают также цитотоксичность 5-фторурацила, действие которого не регулируется механизмами множественной лекарственной устойчивости. Интерферон и фактор некроза опухолей (альнорин) также значительно повышают интенсивность цитотоксического действия доксорубицина и 5-фторурацила в отношении клеток HeLa и индукцию в них апоптоза; однако в большей степени этот эффект выявляется на клетках, гиперэкспрессирующих ген Bcl-2, чем на ин-тактных. Усиление цитотоксического действия цито-кинами в большей степени проявляется в отношении доз противоопухолевых лекарств, убивающих клеток путем апоптоза, и значительно слабее или вовсе не определяется в отношении высоких доз, вызывающих некротическую гибель клеток.
Выводы. Сопоставляя эти экспериментальные данные с результатами клинических исследований по использованию интерферона и альнорина для лечения онкологических больных, мы пришли к заключению, что в противоопухолевой терапии успешное применение интерферона (и вероятно, фактора некроза опухолей) связано не столько с их иммуномодулирующими свойствами, сколько с воздействием на процессы апоптоза.
А. А. Соколовская, Н. К. Власенкова, Д. С. Баранов, Д. Ю. Блохин
ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ ЕА8/ЕА8Ь-СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В ЛЕКАРСТВЕННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК
Противоопухолевые лекарственные препараты разных классов активируют программу гибели клеток-мишеней по механизму апоптоза. Имеются данные, что экспозиция культур опухолевых клеток с различными цитостатиками, ионизирующей радиацией или УФ-светом сопровождаются экспрессией на клеточной поверхности «рецепторов смерти» CD95/Fas/APO-1, а также их мембраносвязанного лиганда FasL. Одновременно преинкубация CD95-позитивных клеток разных линий с F(ab’)2-фрагментами моноклональных антител (МКА) анти-CD95 предотвращает их лекарственно-индуцированный апоптоз. Эти факты позволили предположить, что в основе цитотоксического эффекта противоопухолевой химиотерапии может лежать ауто- или паракринная активация Fas-опосредованной клеточной гибели.
Материалы и методы. Использована клеточная культура Jurkat Т-лимфобластного лейкоза человека, F(ab’)2-фрагменты МКА анти-CD95 (клон IPO-4), МКА анти-FasL (клон NOK-1). Долю апоптически гибнущих гиподиплоидных клеток в популяции определяли методом проточной цитофлюориметрии (FACSCalibur) после окраски ДНК пропидиума йодидом, живых клеток — по окрашиванию FDA.
Результаты. Краткосрочная (4 ч) инкубация клеток с этопозидом (1 ug/ml) вызывает достоверную экспрессию на их поверхности лиганда FasL, в отличие от
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
действия доксорубицина и циклоплатама, при использовании которых экспрессия «лиганда смерти» нами не выявлена.
Предварительная обработка клеток-мишеней Б(аЪ’)2-фрагментами МКА анти-СБ95 существенно снижает долю гибнущих после применения этопозида и доксорубицина клеток, но не влияет на их выживаемость при использовании в качестве индукторов гибели цисплатина или циклоплатама.
Инкубация клеток-мишеней с метил-бета-цикло-декстрином (МрСБ), эффективно разрушающим холе-стерин-обогащенные липидные микродомены (рафты) клеточной мембраны, не изменяет их чувствительности к этопозиду.
Выводы. Наши собственные результаты и анализ данных других авторов позволяют полагать, что цитотоксический эффект этопозида, доксорубицина, цисплатина и циклоплатама не связан с активацией БаБ-опосредованной клеточной гибели. При этом экспрессия БавЬ является следствием стресс-акти-вируемых процессов адаптации, а блокирование лекарственно-индуцированной гибели клеток их пре-инкубацией с Б(аЪ’)2-фрагментами МКА анти-СБ95 — результатом альтернативной активации «рецепторов смерти», обладающих функциональным дуализмом в отношении генерирования сигналов смерти/выживания.
Е. В. Степанова, А. А. Вартанян, А. Ю. Барышншов, М. Р. Личкницер
ВАСКУЛОГЕННАЯ МИМИКРИЯ IN VITRO: НОВЫЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ АНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛИ
Способность опухолевых клеток в отсутствии эндотелиальных клеток и фибробластов формировать высокоструктурированные васкулярные каналы, ограниченные базальной мембраной, или «васкулогенная мимикрия» (ВМ), является уникальной особенностью клеток с высокозлокачественным клеточным фенотипом. Менее агрессивные опухолевые клетки таких структур не образуют. Подобные качества высокоагрессивные клетки приобретают в результате их способности возвращаться к эмбриональноподобному фенотипу.
Нами была разработана легко воспроизводимая модель формирования васкулярной сети, имитирующая ВМ in vivo. Было обнаружено, что васкулярную сеть формировали те клеточные линии, которые активно экспрессировали маркеры эндотелиальных клеток
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва (ЭК). Физические характеристики образованных структур — количество образовавшихся узлов, длина трубочек, степень ветвления — были практически одинаковы для клеток меланомы, рака молочной железы, рака яичников и повторяли рисунок сосудистой сети, образованной ЭК. Неожиданным, но стабильно воспроизводимым свойством ВМ оказалось заметное уменьшение количества клеток к моменту, когда образование сосудистой сети уже необратимо. Получен экспериментальный материал, позволяющий утверждать, что запуск программированной гибели клетки является необходимым для организации клеток в васкулярную сеть. Кроме сосудистоподобных структур опухолевые клетки в оптимизированных нами условиях формировали in vitro также тубулярные структуры.
Критический параметр для подобного поведения клеток — изначально высокая плотность посадки клеток.
На сегодняшний день неизвестно ни одного физиологического процесса — аналога ВМ у взрослых или детей. Практически формирование цитотрофобластами васкулярных каналов в плаценте является единственным
васкулогенным событием, встречающимся у человека. Этот факт открывает новые возможности воздействия на рост агрессивной опухоли с минимальным эффектом на нормальные физиологические процессы. Разработанный нами метод может быть использован для скрининга веществ на способность блокировать ВМ.
Е. В. Толчева1, М. А. Кортава1, Т. Н. Палкина1, Н. С. Егорова2, Т. Б. Стойлова2,
А. Ю. Суровой2, А. Ю. Барышников1
АНТИ-СБ5-ИММУНОЛИПОСОМЫ: МОДИФИКАЦИЯ ПЭГИЛИРОВАННЫХ ЛИПОСОМ МОНОКЛОНАЛЬНЫМИ АНТИТЕЛАМИ 1СО-80
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва
Недостатком липосомальных форм является их быстрая опсонизация при внутривенном введении и последующий захват клетками ретикулоэндотели-альной системы (РЭС). Для защиты липосом от захвата клетками РЭС липосомальную поверхность обычно модифицируют гидрофильным полимером, таким как полиэтиленгликоль. Направленную доставку пространственно стабилизированных (пэгилированных) липосом к клеткам-мишеням обеспечивают присоединенные к поверхности липосом специфические лиганды. В качестве лиганда могут быть использованы углеводы, пептиды, белки и др.
Цель работы — подобрать оптимальные условия модификации моноклональных антител (МКА) ICO-80 активированным полиэтиленгликоль-фосфатидилэ-таноламином (pNP-PEG-PE), проверить специфическую активность полученных иммунолипосом на клеточной линии MOLT-4.
Материалы и методы. В работе были использованы яичный фосфатидилхолин (РС) (Avanti Polar Lipids), холестерол (Chol) (Avanti Polar Lipids), полио-ксиэтилен (MW 2000) — 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламин (PEG-DOPE) (Avanti Polar Lipids), паранитрофенил-полиоксиэтилен (MW 2000) — DOPE (pNP-PEG3400-DOPE) (получен в Лаборато-
рии химии пептидов ИБХ РАН), моноклональные антитела ICO-80 (анти-CD5).
Результаты. Для получения конъюгата ICO-80 — PEG3400-DOPE было исследовано влияние рН, температуры и соотношение исходных реагентов на протекание реакции. В результате были подобраны оптимальные условия для получения конъюгата. Липосо-мы получали экструзией липосомальной суспензии через ядерные фильтры (последовательно через 400, 200 и 100 нм). Размер частиц контролировали с помощью Submicron Particle Sizer NICOMP-380. С целью модификации полученных пэгилированных липосом реакционную смесь, содержавшую ICO-80 — PEG3400-DOPE, инкубировали с липосомами. Несвязавшиеся антитела отделяли диализом (использовали диализные мешки с размером пор 250 000 Да). Специфическую активность полученных ICO-80-липосом на клеточной линии MOLT-4 анализировали на проточном цитофлю-ориметре FACScalibur (Becton Dickinson). Результаты экспериментов показали, что антитела ICO-80, связанные с поверхностью липосом, сохраняют свою специфическую активность к Т-клеточному антигену CD5.
Выводы. Таким образом, получены анти-CD5-имму-нолипосомы и показано сохранение специфической активности антител, связанных с поверхностью липосом.
Р. И. Якубовская, Т. А. Кармакова, Н. А. Волченко, Г. А. Франк, Л. В. Телегина,
В. В. Соколов, В. И. Чиссов
ОПУХОЛЬ-АССОЦИИРОВАННЫЙ МУЦИНОПОДОБНЫЙ АНТИГЕН MUC1: ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ, ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ
МНИОИ им. П. А. Герцена, Москва
МиС1, известный также как эпителиальный мем- трансмембранным гликопротеидом, в норме локализу-
бранный антиген (ЭМА), Аг4, СА15-3 антиген, эписи- ющимся в апикальной мембране клеток железистого
алин, является высокомолекулярным (>400 кДа) эпителия. При опухолевой трансформации наблюдает-
ся аберрантное гликозилирование MUC1 и его высокое накопление в цитоплазме и на поверхности мембраны малигнизированных клеток.
На основании многочисленных исследований in vitro и in vivo показано, что MUC1 участвует в адгезии и миграции, в дифференцировке и пролиферации клеток, а также в иммунных реакциях и ангиогенезе. Физиологические функции MUC1 и его опухолеспецифические изменения делают этот антиген чрезвычайно важным объектом для изучения процессов, происходящих при малигнизации и опухолевой прогрессии, а также для разработки методов иммунотерапии и иммунодиагностики.
Антиген Аг4, впоследствии идентифицированный как MUC1, выделен нами из мембран жировых глобул женского молока (1982). К нему, совместно с проф. А. Ю. Барышниковым, получена серия моноклональных антител (1986), охарактеризована их специфич-
ность и показана диагностическая и терапевтическая пригодность одного из них — ИКО25. Так, в иммуноги-стохимических исследованиях установлено, что высокий уровень MUC1 в опухолевых тканях наблюдается при гистологически неблагоприятных формах рака молочной железы (РМЖ), а также в клетках неизмененного покровного эпителия при рецидивах первично-множественного плоскоклеточного рака легкого. С использованием разработанной системы для конкурентного иммуноферментного анализа на основе ИКО25 выявлена корреляция уровня антигена MUC1 в сыворотке крови больных РМЖ с распространенностью опухолевого процесса. В экспериментальных исследованиях на мышах nude с гетеротрансплантатом рака толстой кишки человека показана терапевтическая эффективность ИКО25 и совместно с РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН создан препарат, который находится в настоящее время во II фазе клинических испытаний.
С. П. Ярмоненко, В. В. Мещерикова, Н. Н. Касаткина, А. А. Вайнсон
УСИЛЕНИЕ ЭФФЕКТА РАДИО-ТЕРМОТЕРАПИИ ПЕРЕВИВНЫХ ОПУХОЛЕЙ МЫШЕЙ ИНГИБИТОРОМ АНГИОГЕНЕЗА КАРТСЕЛЕМ
В настоящее время проводятся экспериментальноклинические исследования биологически активной добавки Картсел (АЕ-9411), сертифицированной во многих странах, включая Россию, в качестве ингибитора ангиогенеза.
Одним из звеньев многофакторного механизма противоопухолевого действия Картселя является подавление ангиогенеза на ранних этапах роста опухоли, что само по себе должно способствовать ингибированию последнего. В связи с этим логично ожидать, что проведение на этом фоне радио-термотерапии может привести к аддитивному повышению эффективности сочетанного воздействия.
Методы и материалы. Эксперименты, проведенные с целью проверки данного предположения, выполнены на двух экспериментальных моделях — меланоме В16 и карциноме легких Льюис, привитых в голень мышей.
Результаты. Картсель вводили в желудок по 0,4 мл или внутрибрюшинно по 0,2 мл ежедневно в течение месяца, начиная с 3-го дня после прививки опухолей. Сеанс лучевой и последующей термотерапии проводили через 6-8 дней после прививки, когда диаметр голени в месте прививки опухоли составлял 10 мм.
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАНМ, Москва
Локальное гамма-облучение новообразований проводили в дозе 20 Гр на установке АГАТ в дозе 20 Гр, а через 2 ч опухоли прогревали локально в течение 30 мин при температуре 41 °С на термостатируе-мой водяной бане. Динамику регрессии и рецидивиро-вания опухолей прослеживали в течение 40 дней или до смерти животного.
Установлено, что время удвоения размеров меланомы В16 увеличивается с 9-12 дней после одной радио-термотерапии до 20-22 дней после радио-термотерапии, проводимой на фоне введения животным Картселя. Средняя продолжительность жизни мышей с меланомой В16 увеличивалась соответственно с 22-24 до 34-36 дней. Заметных отличий в модифицирующем действии препарата в зависимости от способа его введения не отмечено. Для карциномы Льюис модифицирующий эффект Картселя оказался менее выраженным.
Выводы. Полученные данные свидетельствуют о возможности усиления терморадиационного поражения опухолей с помощью изучаемого препарата Картселя, причем его эффективность варьирует для разных видов опухолей.
