CC BY
156
БИОТЕРАПИЯ
Б. С. Аманджолов, С. М. Ситдикова, И. М. Лученко,
М. В. Киселевский, Ф. В. Доненко ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСА БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ ВБЛ/2
С МЕЛАНОМОЙ КЛАУДМАНА Б 91
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В предыдущих исследованиях на мышах-самцах линии С57В1/6 с внутрибрюшинно и внутримышечно трансплантированной карциномой Эрлиха было показано, что введение гемоглобинсодержащего комплекса белков сыворотки крови, выделенного у животных с опухолью приводит к полной регрессии опухоли. Вылеченные животные были устойчивы к повторной трансплантации карциномы Эрлиха даже при увеличении прививочной дозы до 40х106 клеток/мышь. Наблюдение за животными продолжалось в течение года, и на вскрытии не было обнаружено никаких признаков опухолевого процесса. Учитывая, что карцинома Эрлиха не является сингенной, в последующих исследованиях было изучено влияние комплекса белков сыворотки крови на индукцию устойчивости мышей к росту сингенной опухоли. Целью настоящего исследования явилось изучение влияния комплекса белков сыворотки крови мышей с трансплантированной меланомой Клаудмана 8 91 на индукцию устойчивости мышей к росту опухоли.
Мышам линии ДВА/2 был введен комплекс белков в используемых ранее режимах. Контрольная группа животных получала адекватные объемы раствора альбумина (1мг белка/мышь). Количество введений составляло от 2 до 5. В каждой группе было использовано по 6 животных. Меланому Клаудмана трансплантировали подкожно через 4 нед после последнего введения комплекса белков. В контрольной группе животных опухоль развилась в 100 % случаев, гибель мышей отмечена в сроки от 1,5 до 2 мес. В экспериментальных группах развитие опухоли отмечено в 0-30 % случаев. Наблюдение за экспериментальными животными продолжалось еще 3 нед, после чего животным с неразвившейся опухолью была проведена повторная перевивка меланомы. В контрольной группе опухоль была трансплантирована интактным мышам. После повторной трансплантации мышам меланомы Клаудмана развитие опухоли было отмечено у 30 % животных, и опухоли появлялись на 2-3 нед позднее по сравнению с контролем. Почти половина животных (40 %) от общего количества используемых в эксперименте оказались резистентными к обеим трансплантациям опухоли.
Предполагается, что в гибели опухолевых клеток после введения комплекса белков сыворотки крови как в случае несингенной карциномы Эрлиха, так и в сингенной меланоме Клаудмана участвуют регуляторные Т-лимфоциты. В дальнейших исследованиях планируется проведение идентификации белков, входящих в состав комплекса.
Г. С. Бадмаева, В. О. Дагбаева, А. О. Арбошкин, Н. Д. Ванданова, И. А. Шагдурова, Д. В. Аюшина,
Э. С. Красник, А. П. Перинов ПРИМЕНЕНИЕ ЭПРЕКСА В ЛЕЧЕНИИ ОНКОБОЛЬНЫХ
Бурятский республиканский онкологический диспансер
Большой удельный вес в терапии больных раком различных локализаций принадлежит консервативным методам химиотерапии и лучевому лечению. При химиотерапии и лучевом лечении часто развивается анемия. При этом уменьшение содержания гемоглобина существенно снижает качество жизни больных: развиваются общая слабость, одышка, повышенная утомляемость, сонливость. Развитие анемии ведет к снижению эффективности химио- и лучевой терапии.
С 2006 г. в Бурятском республиканском онкологическом диспансере для лечения анемии у больных злокачественными новообразованиями стали применять эпрекс (7 поэтин-альфа, компания Янссен-Силаг).
Применяется эпрекс в стандартных дозах по 10.000 МЕ п/к 3 раза в нед под контролем анализов крови. Его применение приводило к улучшению общего физического состояния. Ни одному больному в
процессе терапии эпрексом не понадобилось переливания фильтрованной эритроцитарной массы. В зоне инъекции местных реакций (отека, гиперемии кожи) не отмечалось ни у одного пациента.
Эпрекс хорошо переносится, удобен в применении, может применяться самим больным в амбулаторных условиях. Включение препарата эпрекс в Перечень льготных лекарственных средств по программе ДЛО очень важно, так как позволяет шире использовать его в лечении онкобольных.
А. Е. Бережной1, И. Р. Закеева, А. В. Кибардин1,
А. Д. Чернышева1, В. М. Моисеенко2, А. О. Данилов2,
И. Н. Михайлова3, А. В. Данилова2, Л. В. Демидов3,
А. Ю. Барышников3,Н. В. Гнучев1,
Г. П. Георгиев1, С. С. Ларин1 ВЫХОД МОЛЕКУЛЫ ИЬЛ-Е НА ПОВЕРХНОСТЬ КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЮТ-у ЗАЩИЩАЕТ КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА ОТ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ Ж-КЛЕТОК
1 Институт биологии гена РАН, Москва
2ГУН НИИ онкологии им .проф. Н. Н. Петрова Росздрава,
Санкт-Петербург
3ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В последнее время различные методы иммунотерапии опухолей не дают ожидаемого результата при внедрении в клиническую практику. Одним из объяснений является возможное ускользание опухолевых клеток от иммунного надзора или индукция толерантности опухолеспецифических лимфоцитов трансформированными клетками. Описан целый ряд факторов, продуцируемых опухолью и блокирующих противоопухолевый иммунный ответ. Считается, что связывание ингибиторных рецепторов на поверхности лимфоцитов с соответствующими лигандами, представленными на поверхности клеток-мишеней, может подавлять эффекторные функции лимфоцитов. Для проверки этой гипотезы в настоящей работе была проанализирована экспрессия молекулы HLA-E, которая является лигандом гетеромер-ных ингибиторных рецепторов лимфоцитов лектинового семейства -CD94/NKG2A,B.
С помощью ПЦР в реальном времени, а также иммуноблот-анализа в работе была проанализирована экспрессия молекулы HLA-E под действием ЮТ-у в ряде меланомных клеточных линий, полученных из биопсийного материала от пациентов с IV стадией меланомы. Была обнаружена дозозависимая индукция экспрессии молекулы HLA-E в клетках меланомы. С помощью метода проточной цитометрии было показано, что выход молекулы HLA-E на клеточную мембрану зависит от присутствия в культуральной среде ЮТ-у. С использованием цитотоксических NK-клеток линии NKL (KIR',CD94/NKG2A+) было показано, что присутствие на поверхности клеток меланомы молекулы HLA-E приводит к защите последних от лизиса.
Таким образом, показан новый ЮТ-у индуцированный HLA-E, опосредованный механизм ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора цитотоксическими КК-клетками.
А. А. Борунова, Г. З. Чкадуа, Т. Н. Заботина,
З. Г. Кадагидзе, И. Н. Михайлова, Л. В. Демидов СУБПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА ЭФФЕКТОРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ПРИ ВАКЦИНОТЕРАПИИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Цель исследования. Изучить субпопуляционную структуру эф-фекторных перфорин-содержащих лимфоцитов у онкологических больных на фоне вакцинотерапии дендритными клетками, нагруженными опухолевым лизатом.
Материалы и методы. Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови исследовали в реакции иммунофлюоресценции с ком-
мерческими МКА к CD4, CD8, CD16-aernreHaM и перфорину, конъюгированными FITC, PE и PE-Cy5, с последующим анализом на проточном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson). В исследование были включены больные меланомой, у которых до начала вакцинотерапии не было клинических признаков заболевания (группы №1 (n=7) и №2 (n=4)), больные диссеминированной меланомой (группы №3 (n=7) и №4 (n=14)), получившие 6-15 вакцинаций, и доноры (n=15). До начала вакцинотерапии у больных в группах №1 и №3 значение иммунорегуляторного индекса (CD4/CD8) было в пределах нормы (N=1,75±0,4), и на фоне лечения наблюдалась стабилизация процесса. У больных в группах №2 и №4 - снижено и в процессе вакцинотерапии наблюдалось прогрессирование основного заболевания.
Результаты. При исследовании перфорин-позитивных лимфоцитов было выявлено, что у всех больных на фоне лечения эта популяция увеличивается от 10 % до 22 % вне зависимости от клинического течения заболевания (N=9-12 %). Популяция CD8+CD16
Т-лимфоцитов, экспрессирующих перфорин у больных 1-й и 3-й групп, на фоне лечения увеличивалась от 7 % до 15 % (N=7,1±2,2 %), а CD16+CD8 NK клеток оставалась в пределах нормы - 8-10 %. У больных 2-й и 4-й групп, напротив, количество перфорин+ Т-лимфоцитов и NK-клеток уменьшалось до 2-3 %. Более того, у этих больных была выявлена популяция CD16+CD8+-лимфоцитов, содержащих перфорин, которая на фоне вакцинотерапии увеличивалась до 17-20 %. Следует отметить, что у больных 2-й группы эта популяция появляется после 6 введения вакцины, тогда как у больных 4-й группы она выявляется еще до начала лечения. У больных 1-й и 3й групп количество CD16+CD8+перфорин+-клеток оставалось в пределах нормы как до начала лечения, так и в процессе терапии (N=0,6± 0,1 %).
Выводы. Было выявлено различие в субпопуляционной структуре эффекторных лимфоцитов у больных с различным клиническим течением заболевания на фоне вакцинотерапии. Увеличение перфорин+ популяции клеток у прогрессирующих больных происходило преимущественно за счет CD16+CD8+ популяции клеток, а у больных при стабилизации - за счет CD8+CD16 Т-лимфоцитов и CD16+CD8 NK-клеток.
Е. В. Володина, А. С. Островская, А. Е. Бережной, С. С. Ларин ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЦЕЛЬНОКЛЕТОЧНЫХ ГЕННОИНЖЕНЕРНЫХ ВАКЦИН НА ГУМОРАЛЬНЫЙ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ИММУНИТЕТ
Институт биологии гена РАН, Москва
Введение. Специфические иммуноглобулины - один из ключевых факторов защиты организма от инфекционных агентов, в то время как роль антител в противоопухолевом иммунитете остается не ясной. Блокирующие антитела способны защищать опухолевые клетки от действия опухолеспецифических Т-лимфоцитов, однако существуют примеры иммуноглобулинов с противоопухолевым действием. Ранее в нашей лаборатории была разработана генно-инженерная противоопухолевая вакцина на основе опухолевых клеток, секретирующих ГМ-КСФ, и вакцина на основе опухолевых клеток, секретирующих Таг-7. Была показана эффективность их раздельного и совместного применения.
Цель исследования. Используя данные вакцины в качестве средства модулирования противоопухолевого иммунитета, мы проанализировали наличие иммуноглобулинов в сыворотке крови неиммунных животных, а также животных, иммунизированных разными вак-цинопрепаратами.
Материалы и методы. Мышей линии C57BI/6 иммунизировали 106 инактивированных клеток, секретирующих ГМ-КСФ, Таг-7 либо смесью клеток. Через 7 дней у животных забирали образцы крови, выделяли сыворотку, которую в различных разведениях инкубировали с клетками линии мышиной меланомы B16-F10. Специфическое окрашивание детектировали при помощи FACS-анализа после инкубации со вторичными антителами (конъюгированные с FITS поликлональные козлиные антитела против иммуноглобулинов мыши).
Результаты. Показано, что в сыворотке неиммунизированных животных в титре 1:256 обнаруживались иммуноглобулины, способные специфически распознавать опухолевые клетки (10 % клеточной популяции окрашивалось с высокой интенсивностью). Применение
вакцинации инактивированными клетками, секретирующими ГМ-КСФ и Таг-7, снижало количество антител, распознающих клетки линии B16-F10. В то же время комбинированная вакцинация смесью клеток секретирующих различные цитокины стимулировала образование антител, которые с низкой интенсивностью окрашивали всю клеточную популяцию.
Выводы. Предположительно, антитела детектируемые у неиммуни-зированных животных способствуют формированию опухолей. Вакцинация животных индуцирует исчезновение антител с проопухолевым действием и в некоторых случаях противоопухолевых антител.
Д. В. Гольдштейн1,2
БЕЗОПАСНОСТЬ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ: ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КУЛЬТУР СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
1НП «Институт стволовой клетки и клеточных технологий», Москва 2ЗАО «РеМеТэкс», Москва
Для применения клеточных технологий в широкой медицинской практике требуется создание методической платформы биобезопасности клеточных трансплантатов и тканеинженерных конструкций. При культивировании клеток in vitro отсутствует контроль со стороны иммунной системы, что при длительном культивировании может приводить к накоплению трансформированных клеток и в конечном итоге к малигнизации культуры. Показана спонтанная трансформация стволовых клеток при культивировании, сопровождающаяся хромосомной нестабильностью, что свидетельствует о необходимости цитогенетического контроля клеточных трансплантатов. Для обеспечения безопасности клеточной терапии необходимо изучение механизмов и закономерностей хромосомной изменчивости стволовых клеток в процессах изолирования, культивирования и криопрезервации, он-когенного и туморогенного потенциала клеточных трансплантатов.
Методика приготовления цитогенетических препаратов из культур стволовых клеток разработана совместно с лабораторией мутагенеза ГУ МГНЦ РАМН («Клеточные технологии в биологии и медицине», 2007, №1). Исследовали культуры мультипотентных стро-мальных клеток (МСК), полученных из жировой ткани по стандартной методике. Хромосомная изменчивость МСК выражалась в виде нестабильных хромосомных аберраций, транслокаций хромосом и анеуплодий. Частота хромосомных аберраций в исследованных культурах на ранних пассажах соответствует верхней границе нормы для культур лимфоцитов периферической крови. Доля аберрантных клеток варьирует в культурах разных индивидов от 1,5 % до 5,95 %. В
2 культурах клеток на 11-14-м пассажах выявлены клоны с измененным кариотипом. Показано, что при длительном культивировании имеет место селективное размножение клеток с аномальным карио-типом. Для безопасной клеточной терапии необходимо использовать протоколы культивирования, оказывающие минимальное воздействие на хромосомную изменчивость клеточных культур.
С. Г. Дониня
НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ ВО ВРЕМЯ ТЕРАПИИ ИММУНОМОДУЛЯТОРАМИ RIGVIR И LARIFANS
Латвийский онкологический центр, Рига.
Задачи исследования. Определить влияние иммуномодуляторов вирусного происхождения RIGVIR и LARIFANS на количественные показатели клеточного иммунитета онкологических больных.
Материалы и методы. Препараты RIGVIR и LARIFANS - иммунопрепараты с противоопухолевой активностью, зарегистрированные в Латвии и с 2005 г.
В амбулаторных условиях 23 больным после эксцизии меланомы кожи вводили RIGVIR внутримышечно по индивидуальной схеме в течение 12 мес с октября 2005 г. 27 больным с различными солидными опухолями вводили подкожно LARIFANS в комплексной терапии по определенной схеме курсовыми дозами.
Кроме полного анализа крови и серологических маркеров в периферической крови определяли CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+,CD38+, CD4+ и CD95+-клетки в процессе динамического наблюдения через 3, 6 и 12 мес во время терапии иммуномодуляторами.
Результаты. В период лечения КЮУІК у больных меланомой увеличилось количество лимфоцитов в 1 мм3 крови, в том числе CD19+ и CD38+-клеток, и появилась тенденция к увеличению числа CD8+-клеток.
У больных, получивших ЬЛКІЕЛНЗ , наблюдали значительное увеличение числа CD16+ и CD38+-клеток и увеличение общего количества лимфоцитов в 1 мм3 крови. Изменения количества иммуно-компетентных клеток отмечались через 3 мес после начала терапии и сохранились в дальнейшем.
Побочных эффектов в период лечения не наблюдали за исключением 2 случаев субфебрилитета в течении 24 ч после инъекции ЬЛКІ-ЕЛШ
Выводы. Наши наблюдения по применению препаратов КЮУІК и ЬЛКІЕЛНЗ в комплексном лечении онкологических больных показали их положительное влияние на количественные параметры клеточного иммунитета, в особенности на эффекторное звено. Препараты не вызывали неблагоприятных побочных эфектов во время лечения.
П. К. Иванов1, Е. Ф. Чмутин1, Д. В. Перлин2,
А. С. Сокольский3, А. С. Гриневич1,
Н. В. Голубцова1, А. Ю. Барышников1
АТЭМОНАТ: ОТ ЭКСПЕРИМЕНТА К КЛИНИКЕ
1 ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2НИИ Урологии МЗиСР РФ, Москва 3Городская клиническая больница № 7, Москва
Препарат Атэмонат представляет собой лекарственную форму мышиных моноклональных антител ГСО-90 к антигену CD3 Т-лимфоцитов человека, полученных в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН по гибридомной технологии. Связывание антител с Т-лимфоцитами приводит к быстрому и почти полному удалению Т-лимфоцитов из периферической крови, благодаря чему этот препарат может использоваться для купирования реакции отторжения трансплантата, в развитии которой Т-лимфоциты играют активную роль. В НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН был проведен комплекс предклини-ческих исследований, которые показали идентичность или превосходство физико-химических, иммунологических, фармакологических и токсикологических свойств Атэмоната по сравнению с препаратом Ортоклон ОКТ-3 (Орто Фармасьютикалс, США), который давно и успешно применяется по этому показанию. Эти данные послужили основой для начала клинических испытаний Атэмоната, который тоже предполагается применять для лечения РООТ. Во II фазе клинических испытаний участвовали 20 больных с реакцией острого отторжения трансплантата после пересадки почки. В 18 случаях (90 %) применение Атэмоната дало положительный результат по показателям восстановления функции или нормализации УЗИ-картины трансплантата. У 2 больных развились побочные эффекты (преходящая энцефалопатия и отек легких), потребовавшие дополнительного лечения. Однако у этих больных курс применения препарата Атэмонат не прерывался, и криз отторжения трансплантата был успешно купирован. Другие побочные эффекты соответствовали ожидаемым, исходя из механизма действия препарата (лихорадка, связанная с синдромом выброса цитокинов). После введения препарата Атэмонат содержание Т-лимфоцитов в крови быстро падало и нормализовалось через 7-10 дней. При этом параллельно снижалось содержание Т-хелперов/индукторов и Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов. В то же время введение препарата Атэмонат существенно не влияло на количество В-клеток и ЫК-клеток; таким образом, Атэмонат селективно подавляет клеточный иммунитет, не затрагивая гуморального иммунитета и неспецифических иммунных реакций больных, что позволяет свести к минимуму риск инфекционных осложнений. В целом результаты II фазы клинических испытаний подтверждают высокую иммунологическую селективность, клиническую эффективность и безопасность применения препарата Атэмонат для купирования реакции отторжения трансплантата почки.
З. Г. Кадагидзе
КЛЕТКИ-СУПРЕССОРЫ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ИММУНИТЕТЕ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В настоящее время полагают, что в процессе развития злокачественных опухолей реакции иммунной системы отличаются большим
разнообразием. Практически одновременно может происходить активация противоопухолевого иммунитета, ускользание опухоли от иммунного ответа, стимуляция опухолевого процесса, иммунологическая толерантность. Тот или иной результат является следствием взаимодействия различных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, продукции цитокинов клетками как иммунной системы, так и опухолевыми. Особое значение в регуляции противоопухолевого иммунного ответа придается клеткам-супрессорам. В настоящее время считается, что супрессорными свойствами обладают клетки как Т-клеточной популяции, так и миелоидные. Среди Т-клеточной популяции это Tr1 и ТЬ3-клетки (образуются после антигенной стимуляции), CD4+CD25+ регуляторные клетки и NKT-клетки. В последнее время большое внимание уделяется миелоидным супрессорным клеткам (МСК), которые имеют большое значение для обеспечения прогрессивного роста опухоли: они не только функционируют как эффекторы «ускользания» опухоли от иммунологического надзора, но также обеспечивают опухоль молекулярными и клеточными компонентами, необходимыми для нео-ангиогенеза. Нарушение цитокино-вого гомеостаза, которое вызывает растущая опухоль, может приводить к накоплению этих клеток в лимфоидных органах и крови и к их созреванию в направлении супрессорного фенотипа. Другая уникальная популяция - NKT-клетки (CDM-зависимые NK-подобные лимфоциты) играет большую роль как в естественной защите, так и в модуляции противоопухолевого иммунитета. Особенностью этих клеток является их способность распознавать липидные/гликолипидные антигены, презентируемые неклассической молекулой CD1d в отличие от обычных Т-клеток и Трег, распознающих пептидные антигены, презентируемые классическими молекулами MHC I и II классов. В настоящее время разрабатываются методы подавления супрессорной активности этих популяций как в эксперименте, так и в клинике. Большие успехи достигнуты в изучении роли Трег в противоопухолевом иммунитете и разработке подходов к блокаде их функциональной активности. Имеющиеся клинические данные указывают, что уменьшение количества Трег способствует активации противоопухолевого иммунитета и подавлению опухолевого роста. Таким образом, в последнее время появилось новое направление в иммунотерапии опухолей, заключающееся в воздействии на иммуносупрессию за счет удаления супрессорных клеток или блокады их дифференцировки или их супрессивных молекул.
Д. Б. Казанский
ВНУТРИТИМУСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ И ИММУНОТЕРАПИЯ РАКА
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Злокачественная трансформация является следствием генетических и эпигенетических нарушений. Чтобы «увидеть» мутантный или аберрантно экспрессированный белок, иммунная система должна иметь возможность «заглянуть» внутрь клетки. Эту возможность ей предоставляют молекулы MHC, способные прочно связаться с пептидами внутриклеточных белков и вынести их на поверхность клетки. Единственными клетками иммунной системы, способными специфически распознать такие комплексы, являются Т-лимфоциты, и поэтому именно они рассматриваются как центральное звено для стимуляции специфического противоопухолевого иммунитета.
Мутантные опухолеспецифические антигены редко становятся мишенью противоопухолевых иммунных ответов. Причиной этого может быть высокая эффективность иммунологического надзора, отбирающего неиммуногенные клоны трансформированных клеток. Вместе с тем далеко не все мутации в структуре онкогенных белков могут быть обнаружены иммунной системой, поскольку молекулы MHC избирательно связываются лишь с пептидами, содержащими специфичные для данного аллеля структурные мотивы.
Опухолеассоциированные антигены - нормальные (немутантные) белки, экспрессированные «не в том месте и не в то время», к которым иммунная система в норме толерантна и иммунный ответ развивается с трудом. Толерантность к ним формируется в тимусе путем устранения клонов Т-клеток, эффективно распознающих «свои» комплексы молекул MHC и пептидов. Активность гена AIRE (аутоиммунный регулятор) в медуллярном эпителии тимуса приводит к экспрессии широкого ряда стадио- и тканеспецифических белков, включая хорошо известные мишени терапевтических противоопухолевых
вакцин (а-фетопротеин, антигены тестиса и меланом). Презентация пептидов этих белков собственными молекулами MHC внутри тимуса приводит к делекции клонов Т-клеток, способных стать мишенями специфической иммунотерапии онкологических заболеваний. С одной стороны, это предотвращает возникновение аутоиммунных заболеваний, а с другой - из тимуса в периферические лимфоидные органы могут попасть лишь низкоавидные клоны Т-клеток, не способные к полноценному иммунному ответу на опухолеассоциированные антигены. Это означает, что главным условием эффективности специфической иммунотерапии опухолей должна быть ее способность предотвращать негативную селекцию Т-клеток с нужной специфичностью внутри тимуса. Таким образом, центральной задачей специфической иммунотерапии следует считать поиск путей индукции «полезного» аутоиммунитета к опухолеассоциированным антигенам.
А. Ф. Киркин, К. Н. Джанджугазян ПЕРСПЕКТИВЫ ДЕНДРИТО-КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ
Сканселл Лимитед, Хорсхолм, Дания
Иммунотерапия, основанная на применении дендритных клеток, поначалу подававшая большие надежды, привлекает сейчас гораздо меньше внимания вследствие в целом довольно низкой эффективности этого вида терапии. В числе возможных причин можно предположить неадекватный выбор опухолевых антигенов в качестве мишеней, а также низкое качество полученных ex vivo дендритных клеток.
Мы попытались сконцентрироваться на решении обеих этих проблем. В качестве мишени была выбрана группа опухолесеменниковых антигенов, которая, за исключением семенников, где она не узнается Т-лимфоцитами, избирательно экспрессирована только в опухолевых клетках. В качестве источника антигенов для нагрузки дендритных клеток была выбрана клеточная линия меланомы, экспрессирующая широкий спектр опухоле-семенниковых антигенов и лишенная дифференцировочных антигенов меланоцитов. Метод получения дендритных клеток был оптимизирован таким образом, чтобы достигалось их полное созревание, равномерная высокая экспрессия костимуляторных молекул CD80 и CD86, а также продукция IL12p70, цитокина, важного для иммунного ответа типа Th1. Клетки также экспрессировали CCR-7-молекулу, участвующую в их миграции к лимфоузлу. Первые результаты использования такой дендритоклеточной вакцины в клинических испытаниях против рака толстой кишки, проведенные Национальным онкологическим центром Сингапура совместно с датской компанией, владеющей правами на технологию, показали весьма обнадеживающие результаты.
Дальнейшее развитие вакцин на основе дендритных клеток должно концентрироваться на усилении антигенной презентации и повышении способности дендритных клеток к стимуляции образования СD8+-центральных клеток иммунологической памяти.
А. Ф. Лазарев, В. Д. Петрова, Е. Л. Секержинская,
Л. С. Скрябина, Л. А. Чурилова, О. А. Кремлева,
Е. И. Россоха, В. П. Цивкина ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА ГЕРЦЕПТИН В УСЛОВИЯХ ДНЕВНОГО СТАЦИОНАРА
Алтайский филиал ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Барнаул ГУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер», Барнаул
Введение. Одним из факторов, свидетельствующим об агрессивности рака молочной железы (РМЖ), является протоонкоген HER2. HER2/neu относится к семейству эпидермальных факторов роста, его повышенная экспрессия имеет место в 25-30 % случаев РМЖ, причем ампликация гена обнаруживается в 30 % случаев (М. Р. Личиницер, 2006; В. Ф. Семиглазов, 2006). Результатом многолетних исследований явилось получение гуманизированных антител к HER2 - трастузумаба (герцептина). Герцептин - моноклональное антитело, направленное на внеклеточный домен белка HER2, продукта протоонкогена HER2/neu. В настоящее время установленным является факт положительного эффекта таргетной терапии Герцептином,
проявляющимся в увеличении выживаемости и улучшении качества жизни больных РМЖ.
Задачи исследования. Оценить возможности применения препарата Герцептин в амбулаторных условиях.
Материалы и методы. В 2005-2006 гг. в условиях дневного стационара ГУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» получали Герцептин 15 больных РМЖ в возрасте от 26 до 55 лет, имеющие различные стадии процесса (кроме IV). Все они закончили специальное лечение согласно существующим стандартам. Показанием для таргетной терапии явилась гиперэкспрессия HER2/neu+++, подтвержденная иммуногистохимическим методом. До начала лечения пациентки были проконсультированы кардиологом с выполнением ЭКГ и эхокардиографии, контроль за данными которых проводили не реже 1 раза в 3 мес. Герцептин назначался в нагрузочной дозе 4 мг/кг массы тела в виде 90-мин внутривенной инфузии, затем в поддерживающей дозе - 2 мг/кг 1 раз в нед в виде 30-мин инфузии. Продолжительность лечения составила 12 мес. 14 пациенток получали терапию Герцептином в адъювантном режиме - по завершении комплексного лечения, 1 - по поводу генерализации процесса.
Результаты. 5 пациенток на сегодняшний день закончили лечение. Одной было выполнено 43 введения Герцептина, препарат был отменен вследствие неудовлетворительных показателей эхокардио-графии. Одной пациентке, получившей специальное лечение в 2005 г., было выполнено 51 введение Герцептина, на фоне которого выявлены метастазы в печень. Две пациентки после комплексного лечения РМЖ завершили биотерапию Герцептином (52 введения препарата), данных за рецидив и генерализацию процесса нет. У пациентки, проходившей лечение по поводу генерализации процесса (получила до биотерапии 6 курсов химиотерапии в режиме гем-зар + цисплатин, курс дистанционной лучевой терапии, эндокриноте-рапию ингибиторами ароматазы), после 51 введения Герцептина регистрируется полная регрессия опухоли. 11 пациенток находятся в процессе лечения Герцептином, на момент сообщения признаков прогрессирования заболевания не выявлено. Из побочных эффектов следует отметить в 100 % случаев гипертермическую реакцию на первое введение препарата и проявление кардиотоксичности в 6,6 % у больных, получавших ранее антрациклины.
Выводы. Таким образом, препарат Герцептин обладает хорошей переносимостью и может быть рекомендован для широкого применения в амбулаторных условиях.
В. В. Лебедев, С. А. Новиков ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ -ПРОТОТИПА ТИМИЧЕСКОГО ГОРМОНА (ИМУНОФАН)
И ПРОТОТИПА БУРСОПОЭТИНА НА ТРАНСПОРТНЫЕ БЕЛКИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва
Цель исследования. Изучение влияния регуляторных синтетических гексапептидов на активность транспортных белков множественной лекарственной устойчивости.
Материалы и методы. В работе использовали перевиваемые линии клеток рака гортани человека Нер-2, асцитной карциномы Эрлиха и лимфолейкоза Р388. В качестве исследуемых фармакологических агентов использовали гидрофильные синтетические гексапептиды - прототипы тимического гормона (имунофан) и бурсопоэтина. Активность в клетках транспортных белков, ответственных за множественную лекарственную устойчивость (МЛУ), определяли по скорости выхода из клеток родамина 123 и каль-цеина АМ. Влияние регуляторных гексапептидов на белки МЛУ сравнивали с действием известного конкурентного ингибитора -циклоспорин А.
Результаты. Сравнительный анализ действующих концентраций гексапептидов и циклоспорина А на активность транспортных белков демонстрирует их различия не менее, чем в 1000 раз. Так имунофан оказывает ингибирующее влияние на выход Ю23 из клеток Нер-2 при концентрации 0,12 нМ. Напротив, циклоспорин А не действует до концентрации 10 нМ. Пептиды оказывают максимальный эффект в
диапазоне концентраций 1-3 нМ, а циклоспорин А - при концентрациях 0,8-2,5 мкМ.
Выводы. Специфическая активность пептидов по тесту ингибирования МЛУ превосходит известные субстратные аналоги не менее, чем в 1000 раз. Гидрофильные гексапептиды - имунофан и прототип бурсопоэтина - оказывают регуляторное действие на активность транспортных белков МЛУ в зависимости от их функционального состояния. Обнаруженные свойства гексапептидов открывают возможность их клинического применения для преодоления МЛУ.
М. И. Лукашина1, А. В. Смирнова1, В. А. Алиев1,
В. П. Вейко2, И. Н. Михайлова1, Л. В. Демидов1,
Ю. А. Барсуков1, А. Ю. Барышников1 ДЕНДРИТНОКЛЕТОЧНЫЕ ВАКЦИНЫ В СОЧЕТАНИИ С ПОЛИХИМИОТЕРАПИЕЙ В ЛЕЧЕНИИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА
1ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов,
Москва
Введение. Дендритные клетки (ДК), как полагают, являются наиболее мощными стимуляторами иммунологических реакций организма. Они способны распознавать и представлять антигены Т- и В-лимфоцитам в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Однако функциональная активность ДК у онкологических больных значительно снижена, основной причиной этого явления считается невозможность их дифференцировки в зрелые формы в организме больного. Создание противоопухолевых вакцин с использованием ДК - перспективная стратегия терапии онкологических заболеваний.
Цель исследования. Возможность использования ДК для терапии больных колоректальным раком.
Материалы и методы. В исследование были включены 18 больных с метастатическим колоректальным раком после циторедуктив-ной операции с удалением первичного очага; у всех верифицированы множественные метастазы в печень; средний возраст составил 56,7±6 лет. ДК культивировали из моноцитов периферической крови в присутствии ГМ-КСФ, ИЛ-4, ФНО-а и ПГЕ-2. Нагрузку ДК проводили рекомбинантным пептидом, который представляет собой 22 тандемных повтора антигена МиО-1, названным VNTR22 (12 больных), или аутологичным лизатом (6 больных). Плотность вводимой клеточной суспензии составляла 1-6 млн. Трансплантацию аутологичных ДК проводили подкожно, в паховую, затем, после заживления послеоперационного шва, в пупочную область. Все больные получили по 4 введения ДК с интервалом 2-3 нед. После вакцинотерапии больным проводили полихимиотерапию с использованием томудекса и кампто.
Результаты. Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) развилась у 9 больных, после 2-го, 3-го и 4-го введений, из них: 4 пациента получали вакцину ДК, нагруженных лизатом, 5 - белком. Анализ общей выживаемости проводили в группах: 1-я - контрольная группа, больные получали только полихимиотерапию (28 человек);
2-я - больные получали вакцину и полихимиотерапию (12 человек);
3-я - только вакцину (6 человек). Было показано, что в 1-й группе медиана выживаемости составила 23,6 мес; во 2-й медиана выживаемости не достигнута; в 3-й - 8,3 мес. Токсических эффектов при введении вакцины у больных не отмечалось.
Выводы. Таким образом, сочетанное применение вакцино- и полихимиотерапии улучшает общие результаты лечения больных колоректальным раком
Л. В. Манзюк1, Е. В. Артамонова1, А. Г. Бородкина1,
Л. В. Болотина2, Т. А. Кармакова2, Е. Р. Немцова2,
Р. И. Якубовская2 ИМУТЕРАН - ПЕРВЫЙ ОТЕЧЕСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ
МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
(I - II ФАЗА КЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ)
1ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2ФГУ «МНИОИ им. П. А. Герцена Росздрава», Москва
Применение моноклональных антител (МКА) - это новое перспективное направление терапии злокачественных новообразований.
Одним из таких лекарственных агентов является имутеран - оригинальный российский препарат, созданный совместно РОНЦ им. Н. Н. Блохина и МНИОИ им. П. А. Герцена на основе субстанции МКА ICO-25, полученных к эпитопу MUC-1 (CD227). Доклинические исследования продемонстрировали высокую специфичность, значительную противоопухолевую активность in vivo и низкую токсичность ICO-25.
Клинические испытания имутерана по I фазе проведены у 10 больных с распространенным опухолевым процессом. Имутеран вводился в/в капельно 1 раз в неделю - 4 введения. Проводилась эскалация разовых доз по модифицированной шкале Фибоначчи от стартовой (5 мг - 100 %) до максимальной (46,25 мг - 925 %). Основные побочные эффекты - аллергические реакции. Для II фазы клинических испытаний был рекомендован режим введения имутерана по 35 мг (700 % от стартовой дозы) в/в капельно 1 раз в неделю - 4 введения с премедикацией димедролом.
На настоящий момент в исследование по II фазе включены 42 больных с распространенным опухолевым процессом, у которых все возможности химиотерапии были исчерпаны. Проведено 79 курсов лечения имутераном. Из-за развившихся осложнений (у 4 больных -аллергическая реакция, у 1 - парез кишечника) у 5 пациенток лечение прекращено. Оценено 34 больных. Объективных регрессий опухоли не наблюдали. У 12 (35,3 %) из 34 больных отмечена стабилизация процесса продолжительностью от 8 до 44 нед, в среднем 15,67±9,7 нед, медиана 13 нед (7/18 - с диагнозом рак молочной железы, 2/5 -рак толстой кишки, 2/2 - рак маточной трубы и 1/3 - немелкоклеточный рак легкого). У 22/34 больных (11 - рак молочной железы, 6/6 -рак яичников, 3 - рак толстой кишки, 2 - немелкоклеточный рак легкого) выявлено прогрессирование. Исследование продолжается.
А. А. Михайлова1, Р. Г. Белевская1, С. А. Гурьянов1,
Л. А. Фонина1 , Е. М. Трещалина2, Л. А. Седакова2 ПРЕПЕРАТ БИВАЛАСП (МИЕЛОПЕПТИД-5) -ИММУНОМОДУЛЯТОР
С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
1 Институт биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва 2ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Иммунная система играет основную роль в защите организма от любых чужеродных агентов, в том числе против опухолевых клеток. Но существуют разнообразные механизмы «ускользания» опухоли от иммунологического контроля. Поэтому в проблеме лечения злокачественных новообразований важны не только препараты, убивающие опухолевые клетки, но и иммунотерапия, восстанавливающая опу-холь-индуцированную иммуносупрессию.
Миелопептиды (МП) - группа эндогенных иммунорегуляторных пептидов, обнаруженных российскими учеными. МП обладают иммунокорригирующим действием и являются элементами системы поддержания постоянства иммунного статуса организма. Действующая основа Биваласпа - синтетический аналог эндогенного иммуно-регуляторного пептида МП-5 структурной формулы Val-Val-Tyr-Pro-Asp. Клеткой-мишенью для МП-5 является CD4+-лимфоцит. Известно, что продукты метаболизма опухоли снижают синтез эндогенного ИЛ-2 человека, а также экспрессию ИЛ-2-Р на Т-лимфоците. Бива-ласп способен восстанавливать подавленный опухолью синтез эндогенного ИЛ-2 и экспрессию ИЛ-2-Р, активируя тем самым пролиферативный ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, что лежит в основе его противоопухолевого эффекта.
Нарушения в системе ИЛ-2/ИЛ-2-Р происходят в организме опу-холеносителя под влиянием как опухоли, так и цитостатиков при химиотерапии онкобольных. В экспериментах in vivo на 3 перевиваемых опухолях мышей (лимфолейкоз Р388, рак шейки матки РШМ-5, плазмацитома МОПС-406) показано, что комбинированная терапия цитостатиками (циклофосфаном или цисплатином) и Биваласпом достоверно более эффективна, чем монохимиотерапия, что выявлено по торможению роста опухоли, увеличению продолжительности жизни, уменьшению лимфогенного метастазирования.
Биваласп - новый иммунокорригирующий препарат с противоопухолевым действием, перспективный для применения в комплексной терапии онкологических заболеваний. В настоящее время проводится 1-я фаза клинических испытаний.
И. Н. Михайлова, Н. Н. Петенко, Г. З. Чкадуа, Е. В. Огородникова, Л. Ю. Вишнякова, С. А. Хатырев, Е. А. Черемушкин, А. А. Борунова, З .Г. Кадагидзе,
Л. В. Демидов, А. Ю. Барышников ВАКЦИНОТЕРАПИЯ МЕТАСТАТИЧЕСКОЙ МЕЛАНОМЫ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Меланома в стадии регионарного и отдаленного мета-стазирования остается на данный момент заболеванием с неблагоприятным прогнозом и не имеет эффективных методов лечения. Она относится к иммуногенным опухолям, поэтому разработка методов специфической иммунотерапии для данной нозологии представляется актуальной.
Цель исследования. Изучить токсичность и переносимость вакцины на основе аутологичных дендритных клеток, а также оценить ее влияние на иммунный ответ и клиническую эффективность в лечении метастатической меланомы, как в терапевтическом режиме, так и после радикального хирургического вмешательства.
Материалы и методы. В качестве лечебного препарата применялась противоопухолевая вакцина на основе зрелых аутологичных дендритных клеток (ДК), нагруженных аутологичным опухолевым лизатом. ДК вводились внутрикожно, разовая доза введения составляла от 1,0 до 5,0х106 клеток, интервалы между вакцинациями 2-6 нед, кратность введения - до прогрессирования заболевания. С 2003 по 2006 гг. в исследование включены 42 пациента с метастатической меланомой в возрасте от 26 до 82 лет (в среднем 54 года), мужчины/женщины = 24/18. Больные были разделены на 2 клинические группы: 17 пациентов с регионарными и/или отдаленными метастазами получали вакцину в терапевтическом режиме в виде монотерапии; 25 пациентам с той же распространенностью заболевания вакцинотерапия проводилась после радикального хирургического лечения, т.е. в профилактическом режиме. Токсические побочные эффекты оценивались по шкале токсичности (СТСАЕ у.3). Иммунологическая эффективность исследовалась при помощи иммунного статуса и РГЗТ. Объективный клинический ответ в терапевтической группе оценивался согласно критериям RECIST, в профилактической группе оценивалась безрецидивная выживаемость, и для обеих групп - общая выживаемость. Анализ выживаемости пациентов проводился по методу Кар1ап-Ме1ег. Большинству пациентов (75 %) до начала вакцинотерапии проводилось интенсивное лекарственное лечение, на фоне которого отмечено прогрессирование заболевания. Оценивались пациенты, завершившие вводную фазу лечения из первых 4 вакцинаций, к настоящему времени это 33 пациента (79 %). В терапевтической группе (п=13) проведено 210 вакцинаций (от 4 до 21 на пациента, в среднем 10,5); в профилактической группе (п=20) - 205 вакцинаций (от 4 до 38 на пациента, в среднем 15,8).
Результаты. Переносимость лечения хорошая. Выраженных побочных эффектов вакцинотерапии не отмечено. Клиническая эффективность в терапевтической группе составила 15,4 % (1 полный ответ, 1 частичный). Стабилизация заболевания длительностью от 2 и более мес отмечена в 5 случаях СЗ (38,5 %), 1-летняя выживаемость составила 42,5 %; медиана выживаемости - 9,5 мес. К настоящему моменту живы 5 пациентов. Время наблюдения от 4 до 39+ мес. В профилактической группе время до прогрессирования (медиана) составляет 10 мес, без признаков прогрессирования заболевания 45 % больных. 1-летняя выживаемость - 84 %. При медиане наблюдения 12 мес (от 3 до 20+) медиана выживаемости не достигнута. При изучении иммунного статуса больных 2 групп на фоне вакцинотерапии было выявлено увеличение количества Т-лимфоцитов (преимущественно за счет CD8+) и НК-клеток, а также уровня экспрессии активационных антигенов на их поверхности. В местах введения вакцины отмечались местные реакции в виде гиперемии, индурации и зуда, которые носили нарастающий характер и расценивались как проявление РГЗТ в ответ на опухолевые антигены, представленные дендритными клетками.
Выводы. Данный метод лечения хорошо переносим, не обладает выраженными побочными эффектами. Отмечена стимуляция противоопухолевого ответа иммунной системы в виде активации эффек-торного звена клеточного иммунитета, а также умеренная клиническая эффективность.
Л. М. Михайлова, Н. П. Ермакова, И. Б. Меркулова, О. И. Коняева, Е. Л. Членова, Н. Ю. Кульбачевская, Т. В. Абрамова, А. И. Мишин
ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ МЕЛАВАК
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Противоопухолевая вакцина Мелавак представляет собой клеточную линию Mel Kor, стабильно трансфицированную человеческим геном ГМ-КСФ. Исходная клеточная линия Mel Kor получена из биопсийного материала от пациентки с метастазами меланомы в мягкие ткани и генетически модифицирована конструкцией кДНК ГМ-КСФ, встроенной в вектор рВК-CMV.
Цель исследования. Оценка безопасности вакцины Мелавак и прогноз побочных и токсических эффектов при клиническом применении больным меланомой.
Материалы и методы. Программа токсикологического исследования включала изучение безвредности вакцины Мелавак при однократном внутрикожном введении мышам Б^СВА х С57В1/6_^ и неин-бредным крысам в условиях «острого» эксперимента; изучение безвредности при многократном ежедневном внутрикожном применении крысам в течение 7 дней в условиях краткосрочного «хронического» или «субхронического» эксперимента, изучение аллергизирующего действия и туморогенности. Для оценки безопасности применения вакцины Мелавак проведены морфо-функциональные исследования ее локального токсического (кролики, крысы) и системного (общетоксического) действия (мыши, крысы); исследованы аллергенные свойства (морские свинки) и туморогенность вакцины в сравнении с исследованием туморогенности неинактивированной меланомной клеточной линии Mel Kor, являющейся основой для вакцины Мела-вак, при введении мышам Nude.
Результаты. При изучении токсических свойств вакцины Мела-вак установлена ее хорошая переносимость животными в условиях как «острого», так и «субхронического» экспериментов, при применении в дозах, превышающих предполагаемую дозу для человека в 1000 - 10 раз (однократное введение) и в 100 - 10 раз (многократное введение). Вакцина Мелавак не влияет на общее состояние животных, не вызывает их гибели, клинических проявлений токсичности и изменений в поведенческих реакциях, токсических морфофункциональных изменений со стороны органов и систем организма за исключением влияния на печень (обратимое воспалительнодеструктивное изменение паренхимы; увеличение активности тран-саминаз и ЛДГ), а также на углеводный обмен при применении вакцины в токсических дозах.
Вакцина Мелавак обладает местнораздражающим действием, слабыми аллергенными свойствами и в отличие от неинактивированной жизнеспособной клеточной линии Mel Kor не обладает туморогенным действием.
Выводы. Противоопухолевая вакцина Мелавак нетоксична и рекомендована для клинической апробации.
Л. М. Михайлова, Н. П. Ермакова, И. Б. Меркулова, Т. В. Абрамова,
А. И. Мишин, А. Ю. Барышников ИССЛЕДОВАНИЕ ТУМОРОГЕННОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ МЕЛАВАК
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Противоопухолевая вакцина Мелавак представляет собой клеточную линию меланомы человека Mel Kor, стабильно трансфицированную геном человеческого ГМ-КСФ и инактивированную облучением в дозе 100 Гр. Создана учеными ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН и Института биологии гена РАН.
Цель исследования. Оценка способности вакцины Мелавак вызывать развитие опухолей в месте ее подкожного введения и развитие метастазов во внутренних органах иммунодефицитных мышей.
Материалы и методы. Использованы 22 гибридные иммунодефи-цитные мыши-самки (BALB/с-Nude) разведения ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 11 мышам подкожно в область спины вводили вакцину Мелавак в дозе 1х107 клеток в объеме 0,2 мл. В качестве позитивного контроля 11 мышам вводили неинактивированные клетки опу-
холевой линии Mel Kor в том же объеме и количестве. Места введения вакцины и инокуляции неинактивированных опухолевых клеток на протяжении опыта регулярно осматривали и пальпировали в течение всего срока наблюдения (средняя продолжительность жизни интактных бестимусных мышей в условиях эксперимента - 63±7 сут). Критериями туморогенности вакцины Мелавак и неинактивированной клеточной линии Mel Kor служили количество и размеры развившихся опухолевых узлов, время их развития и частота метастазирования. Проводили макроскопическую и гистологическую оценку опухолевых узлов, мест инокуляции и возможного метастазирования: лимфатические узлы, легкие, почки, печень, головной мозг, сердце, селезенка.
Результаты. На 14-е сут у всех мышей группы позитивного контроля обнаружены подкожные опухоли, объем которых составил от 14,4 до 266 мм3. При гистологическом исследовании опухоли представляли собой меланомы солидного строения, состоящие из округлых и полигональных эпителиоидных клеток. У мышей, получавших вакцину Мелавак, на месте инокуляции опухолей не обнаружено, у отдельных животных наблюдались фиброзные изменения. При исследовании внутренних органов и головного мозга мышей, получавших вакцину и клетки линии Mel Kor, метастатических поражений не выявлено.
Выводы. Опухолевая вакцина Мелавак не вызывает развития опухолей (меланом) на месте ее инокуляции, а также образования метастазов во внутренних органах и головном мозге бестимусных мышей. Клеточная линия Mel Kor вызывает развитие меланом на месте подкожной инокуляции.
А. Я. Муцениеце, Г. Я. Фелдмане, Е. А. Шаповалова,
Р. Ж. Брувере, О. Г. Хейселе, Д. Р. Венскус БИОТЕРАПИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРАМИ ВИРУСНОЙ ПРИРОДЫ RIGVIR И LARIFANS ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ПРОГРЕССИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ: КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ С 1968 ГОДА
Институт Микробиологии и вирусологии им. А. Кирхенштейна Рижского университета им. Страдыня, Латвия
Задача исследования. На основе протокола № 9 заседании Ученого совета ВОНЦ АМН СССР 4 июня 1985 г. в Латвии была продолжена апробация оригинального препарата - вирусного иммуномодулятора RIGVIR™ в комплексной терапии злокачественной меланомы. Одновременно изучалось противоопухолевое действие второго оригинального иммуномодулятора, индуктора интерферона - LARIFANS™.
Материалы и методы. Оба препарата, иммуномодуляторы с противоопухолевой активностью, разработаны в институтах АН Латвии. Анализ выживаемости проводили на больных меланомой кожи и глаз, раком прямой кишки, получивших биотерапию RIGVIR-ом, частично в рамках рандомизированного исследования. LARIFANS был включен в комплексную терапию меланомы и метастатического плеврита. Регулярно проверялись данные иммунного статуса. Опухоли исследовались морфологическими методами, а также определяли уровень экспрессии опухолеассоцированных антигенов.
Результаты. 5-летняя выживаемость больных меланомой, получивших RIGVIR, против других методов согласно стадиям: 11А - 92,6 % против 66,7 %; 11В - 88,9 % против 28,6 %; III - 76,5 % против 14,3 %; IV - 84 % против 9 %. Средняя продолжительность жизни при подкожных метастазах - 12 лет, при наличии метастазов в легкие - 4 года. 5-летняя выживаемость больных, получивших лечение после удаления метастатического регионального лимфоузла, - 75 % по сравнению с 21 % при применении других иммуномодуляторов. Полная регрессия подкожных метастазов во время лечения препаратами RIGVIR и LARIFANS сопровождается повышением числа CD8+-клеток в периферической кровы. Первичные (в первые 3-6 сут) морфологические изменения выявляются в основном цитологическим методом и соответствуют цитолизу опухолевых клеток. Регрессия опухолей сопровождается инфильтрацией в опухоли Т-лимфоцитов и плазматических клеток, апоптозом опухолевых клеток и атрофией опухолевых розеток.
Выводы. Основой противоопухолевого действия препаратов RIGVIR и LARIFANS является вирусный онколиз в комбинации с реакцией иммунологического отторжения опухоли.
К. Д. Никитин, А. М. Козлов, М. И. Лукашина,
А. В. Смирнова, А. Ю. Барышников КОМБИНАЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК И ЛОКАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕРМИИ ДЛЯ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Дендритные клетки (ДК) играют важнейшую роль в функционировании иммунной системы. Они являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК). Способность к захвату, процессингу и презентации антигенов у ДК в сотни раз выше, чем у других АПК. Предполагается, что противоопухолевые вакцины на основе ДК могут способствовать развитию эффективного иммунного ответа, направленного на опухолевые антигены.
Цель исследования. В данной работе исследуется способ повышения эффективности противоопухолевых вакцин на основе незрелых ДК за счет комбинации их с локальной гипертермией опухоли.
Материалы и методы. Мышам С57Ы/6 (возраст 2 нед, вес 15-18 г) была подкожно трансплантирована меланома B16/F10 (взвесь 7х105 клеток в среде RPMI-1640). Перед введением опухолевые клетки культивировались in vitro в полной среде RPMI-1640 с добавлением 10% ТЭС. Дендритные клетки выделялись из костномозговых предшественников, полученных из бедренных и большеберцовых костей сингенных мышей, путем культивирования в течение 7-8 дней в полной среде RPMI-1640 с добавлением 10% ТЭС, 60-100 Ед/мл рекомбинантного мышиного GM-CSF, 6-10 Ед/мл рекомбинантного мышиного IL-4, 6-10 Ед/мл рекомбинантного мышиного SCF.
Результаты. Мыши были разделены на 4 группы: 1-я группа -контроль, 2-я - только гипертермия, 3-я - только дендритноклеточная вакцина, 4-я - гипертермия + вакцина. На 9-й день после трансплантации выросшие опухоли мышей в группах 2-й и 4-й были подвергнуты лазерной гипертермии: опухоль локально нагревалась до 46 °С, такая температура поддерживалась в течение 15 мин. На 10-й день мышам в группах 3-й и 4-й внутрь опухоли были введены незрелые дендритные клетки в дозе 1 млн/мышь. В дальнейшем размер опухолей измерялся каждые 2-3 дня.
Наименьшая динамика роста опухолей наблюдалась в группах 2-й и 4-й, очевидно, за счет физического разрушения опухоли высокой температурой. В то же время введение незрелых дендритных клеток (в группах 3-й и 4-й) стимулировало рост опухоли (по сравнению с контрольной группой).
Выводы. В связи с полученными результатами вопрос о степени функциональной зрелости дендритных клеток представляется чрезвычайно важным. Требуются дальнейшие исследования для разработки рациональных схем применения локальной гипертермии и противоопухолевых вакцин на основе ДК.
К. А. Парсункова1, И. Н. Михайлова2, Л. Б. Краснова1,
С. Г. Кузьмин1, Г. Н. Ворожцов1, А. Ю. Барышников2 ДИНАМИКА УРОВНЕЙ ИЛ-2 И ИФНу В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ПРИ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМЕ
}ГУП МНКЦ «Интермедбиофизхим», Москва 2ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина, Москва
Цель исследования. Изучение цитокинопосредованных механизмов развития противоопухолевого иммунитета, оценка уровня цито-кинов, их прогностическая ценность и мониторинг в ходе вакцинотерапии.
Материалы и методы. Обследованы 17 пациентов, получающих дендритную вакцину, и 12 онкобольных, получающих аллогенную вакцину.
Уровень сывороточных цитокинов ИЛ-2 и ИФНу определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа на спектрофотометре Stat Fax (США) с использованием коммерческих тест-систем Bender Med Systems (Австрия).
Результаты. Одной из задач вакцинотерапии является активация Т-лимфоцитов I типа (Т1) и формирование эффективного противоопухолевого иммунного ответа. Продуцируемый Т1-клетками ИФНу активирует макрофаги для уничтожения опухолевых клеток путем
освобождения посредников реактивного кислорода и ТОТ-а, индуцирует и увеличивает экспрессию антигенов ГКГ на макрофагах, Т- и В-клетках и некоторых опухолевых клеточных линиях.
ИФНу предпочтительно ингибирует пролиферацию Т2-клеток, индуцируя антипролиферативный ответ. В синергизме с ИЛ-2 повышает синтез легких цепей иммуноглобулинов. ИЛ-2 также является Т1 «противоопухолевым» цитокином, в задачи которого входит активация клональной пролиферации Т-лф, позволяющая мобилизовать цитотоксиче-ские лимфоциты и натуральные киллеры на борьбу с опухолью. Увеличивает продукцию эндогенных интерферонов, вызывающих прямой апоптоз опухолевых клеток. ИЛ-2 повышает экспрессию МНС I и II классов, увеличивая при этом вероятность распознавания опухолевой клетки как чужеродной, и подавляет экспрессию ростовых факторов опухоли. ИФНу совместно с ИЛ-2 корректирует субпопуляционный баланс Т1 и Т2 в сторону преобладания Т1.
Анализ полученных данных позволил установить, что исходный уровень ИФНу у 91,6 % больных, получающих аллогенную вакцину, соответствовал норме (0-25 пг/мл, по исследованию ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово, Новосибирская обл.) и составил в среднем 2,3 пг/мл, у 8,4 % - превысил норму и составил 27,9 пг/мл.
При вакцинации эта группа условно была разделена на 2: 1-я - у 50 % (6 человек) имелась тенденция к повышению данного показателя; 2-я - у 50 % (6 человек) отмечено снижение содержания ИФНу.
Содержание ИЛ-2 определялось в динамике у 8 пациентов. Следует отметить, что изначально содержание этого цитокина значительно превышало нормальные значения у 87,5 % - 29,25 пг/мл, а у 12,5 % достигало 109,9 пг/мл (норма 1,3±0,2 пг/мл). При мониторинге ИЛ-2 также выявились 2 группы пациентов:1-я у 3 человек (37,5 %) - повышение; 2-я у 5 человек (82,5 %) - снижение.
Онкобольные, получающие дендритную вакцину, по содержанию ИФНу также условно были поделены на 3 группы.
Концентрация ИФНу изначально не превышала нормального значения, а в ходе вакцинотерапии у 47 % имелась тенденция к повышению, у 41,2 % - к понижению и у 5,8 % осталась неизменной.
Уровень ИЛ-2 в среднем имел значение 30,8 пг/мл, значительно превышающее нормальное (1,3±0,2 пг/мл) в начале вакцинации, а при мониторинге у 41,2 % снижался, у 52,9 % - повышался и у 5,8 % не изменился.
Выводы. Таким образом, цитокиновый профиль сыворотки крови является информативным показателем состояния иммунореактивности пациентов с диссеминированной меланомой и может быть использован для динамического наблюдения в ходе вакцинотерапии.
С. М. Ситдикова, Б. С. Аманджолов, И. М. Лученко,
М. В. Киселевский, Ф. В. Доненко ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСА БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ С КАРЦИНОМОЙ ЭРЛИХА
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Эффект ускорения роста опухоли у животных, вакцинированных прогретыми клетками этой же опухоли, впервые описан в 1907 г. и в последующем неоднократно воспроизведен и исследован. В частности, было установлено, что этот феномен опосредован гуморальными факторами иммунизированных животных. Результаты изучения особенностей роста и метастазирования экспериментальных опухолей, в частности, карциномы Эрлиха, свидетельствуют о значительной роли в этом процессе белков сыворотки крови.
Цель исследования. Изучение особенностей влияния гемогло-бин-содержащего комплекса белков сыворотки крови (ГСК) на пролиферацию опухолевых клеток и продолжительность жизни животных с трансплантированной карциномой Эрлиха.
Результаты. В настоящем исследовании на мышах-самцах линии С57В1/6 с внутрибрюшинно и внутримышечно трансплантированной карциномой Эрлиха показано, что введение ГСК, выделенного у животных с опухолью, приводит к полному излечению опухоли с объемом асцитической жидкости 8-10 мл. Вылеченные животные были
устойчивы к повторной трансплантации опухоли даже при увеличении прививочной дозы до 4х107 клеток/мышь. Наблюдение за животными продолжалось в течение года, и после их умерщвления на вскрытии не было обнаружено никаких признаков опухолевого процесса. Введение ГСК, не влияя на лимфоциты, нарушает распределение клеток карциномы Эрлиха по циклу и вызывает гибель около 34,3 % опухолевых клеток при 2 % в контроле, а в системе in vitro ГСК не влиял на рост карциномы Эрлиха. При менее 5-кратном введении ГСК получено замедление роста асцитной карциномы Эрлиха. Продолжительность жизни животных с трансплантированной опухолью увеличивалась до 3 мес. При этом опухолевые клетки сохраняли свои свойства и при трансплантации интактным животным вызывали их гибель в течение 2-3 нед (как исходный штамм). В состав ГСК входят белки с более низкой молекулярной массой: 100; 68; 65; 15 кДа, идентифицированные MALDI-TOF-масс-спектрометрией как гаптоглобин, сывороточный альбумин, gi|26341396 неназванный белок [Mus musculus], гемоглобин альфа соответственно.
Выводы. Описанный феномен излечения трансплантированной карциномы Эрлиха нуждается в дальнейшем углубленном изучении, в том числе на других экспериментальных моделях.
Е. Г. Славина, А. И. Черткова, Т. Н. Заботина,
А. А. Борунова, З. Г. Кадагидзе ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА ОЛИПИФАТ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Иммуномодулирующие свойства олипифата изучали у больных раком почки и меланомой. Определяли влияние проводимой терапии на основные показатели иммунологической реактивности: субпопуляци-онный состав лимфоцитов периферической крови, цитотоксическую активность естественных киллеров (NK), концентрацию иммуноглобулинов IgG, IgA и IgM в сыворотке крови. Тестирование образцов крови больных проводили до начала терапии и далее до и после каждого курса лечения. Сравнение полученных результатов проводили между группой больных, лечение которых привело к стабилизации процесса (группа «Стабилизация»), и больных, у которых на фоне терапии отмечалось прогрессирование болезни (группа «Прогрессирование»). В исследование были включены 22 больных меланомой и 17 - раком почки. Популяционный состав лимфоцитов периферической крови больных определяли с помощью набора моноклональных антител к дифферен-цировочным антигенам лимфоцитов человека на проточном цитоф-люориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, USA) с использованием коммерческого пакета программ сбора и анализа данных CellQuest. Активность NK-клеток изучали в цитотоксическом тесте против линии клеток эритролейкемии К-562 в модификации с помощью полуавтоматического спектрофотометрического МТТ-теста. Концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли по методу Манчини. Проведенное исследование показало, что у больных раком почки и меланомой, получавших лечение олипифатом, наблюдаются различия в динамике изменений % -го содержания некоторых субпопуляций лимфоцитов между группами пациентов со стабилизацией и прогрессированием заболевания. Проводимая терапия у части больных приводила к нормализации как сниженного, так и повышенного %-го содержания CD4+ и CD8+ лимфоцитов, а при раке почки наблюдалось также повышение до нормы в процессе лечения такого важного показателя, как иммунорегуляторный индекс (CD4/CD8) у больных, у которых до лечения он был снижен. Именно у таких больных наблюдалась стабилизация процесса.
Выводы. 1. Олипифат обладает умеренно выраженной иммуномодулирующей активностью. 2. Иммуномодулирующие свойства препарата наиболее выражены у больных с исходно пониженной пропорцией CD4+ Т-лимфоцитов, и именно у этих больных отмечена стабилизация болезни. У больных, лечение которых вызвало стабилизацию заболевания, отмечалась также нормализация % CD8+-лимфоцитов, повышение % активированных лимфоцитов. 3. Возможно, с иммуномодулирующей активностью препарата частично связан клинический эффект у части больных раком почки и меланомой.
