CC BY
73
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ... 25
УДК 616-006.81-097:615.371/.372
Н.В. Голубцова, Е.В. Степанова, А.Е. Бармашов, О.С. Бурова, К.А. Барышников, И.Н. Григорьева,
МА. Барышникова, М.В. Огородникова, Г.З. Чкадуа, П.К. Иванов, И.Н. Михайлова, Л.В. Демидов, А.Ю. Барышников ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ АНТИТЕЛ У БОЛЬНЫХ ДИССЕМИНИРОВАННОЙ МЕЛАНОМОЙ В ПРОЦЕССЕ ВАКЦИНОТЕРАПИИ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация:
Голубцова Наталья Валерьевна, научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес:115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел: +7(499)612-96-16 e-mail: [email protected]
Статья поступила 11.07.2012, принята к печати 31.08.2012.
Резюме
В данной работе была проведено исследование образования противоопухолевых антител в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой, получавших аутологичную дендритную вакцину (n=26) и вакцину «Мелавак» (n=9). Определение наличия в сыворотке крови антител проводилось с использованием методов РИФ и ФИЦХ на клеточных линиях меланомы человека mel Kor и mel Ibr. Методом РИФ показано, что связывание IgM- и IgG-антител в сыворотке крови вакцинированных больных носит неспецифический характер. Обнаружено наличие специфических антител против меланомных антигенов методом ФИЦХ в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой, получавших вакцину «Мелавак». Окрашивание наблюдалось в цитоплазме клеток.
Ключевые слова: иммунная система, вакцина, дендритные клетки, иммуноглобулины, меланома.
N.V. Golubzsova, E.V. Stepanova, A.E. Barmachov, O.C. Burova, K.A. Baryshnikov, I.N. Grigorieva,
MA. Baryshnikova, M.V. Ogorodnikova, G.Z. Chkadua, P.K. Ivanov, I.N. Mikhailova, L.V. Demidov, A.Yu. Baryshnikov
DETERMINATION OF SPECIFIC ANTITUMOR ANTIBODIES
IN PATIENTS WITH DISSEMINATED MELANOMA DURING VACCINE THERAPY
FBSI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
The present work studied the formation of antitumor antibodies in the serum of patients with metastatic melanoma treated with autologous dendritic vaccine (n = 26) and «Melavak» vaccine (n = 9). Determination of the presence of serum antibodies was performed using methods RIF and FICA on human melanoma cell lines and mel Kor mel Ibr. RIF method shown that binding of IgM-and IgG-antibodies in the serum of vaccinated patients is nonspecific. Revealed the presence of specific antibodies against melanoma antigens by FICA in the serum of patients with metastatic melanoma, the vaccine «Melavak». Staining was observed in the cytoplasm of cells.
Key words: immune system, vaccine, dendritic cells, immunoglobulin, melanoma.
Введение
Благодаря развитию биотехнологии, активно разрабатываются новые методы, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета. Большое место в исследованиях этой области занимает вакцинотерапия. По мнению многих исследователей, активация естественных защитных иммунных механизмов может произойти при введении вакцин, содержащих опухолеассоциированные антигены [2-6]. Так, в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН на основе трансфицированных генами tag7 и ГМ-КСФ клеточных линий меланомы [9] и нагруженных опухолевым лизатом дендритных клеток больных меланомой созданы и охарактеризованы цельноклеточные вакцины: аутологичные (Аутологичная/tag-7, Дендритная) и аллогенные («Аллоген», «Мелавак»). Проведенные доклинические и клинические исследования этих вакцин [7; 8; 10-12] способствовали выработке стратегического направления противоопухолевой вакцинотерапии, тем самым повышая эффективность лечения онкологических больных [2-12].
Изучение гуморального иммунного ответа к ОАА привлекло внимание ученых еще в восьмиде-
сятых годах прошлого столетия [1; 13; 14]. Многочисленные антигены на клеточной поверхности индуцировали развитие гуморального иммунного ответа, в некоторых случаях появление циркулирующих иммунных комплексов. Появление методов анализа с применением количественных и полуколичествен-ных аналитических систем позволило идентифицировать специфические антитела ко многим внутриклеточным и поверхностным опухолевым белкам. Следует отметить, что роль специфичных гуморальных факторов в противоопухолевом иммунитете неоднозначна. Природа блокирующего фактора была доказана еще 30 лет назад и с учетом специфичности его действия была сформулирована концепция блокирующих антител. Согласно этой концепции, гуморальная и клеточная формы иммунного ответа на опухоль находятся в своеобразных антагонистических взаимоотношениях. Иммунные лимфоциты распознают антигенные детерминанты опухолевых клеток и уничтожают их. Гуморальные антитела, соединяясь с этими же детерминантами, не способны оказывать вредное влияние на опухолевые клетки, но экранируют их от цитопатогенного действия иммунных лимфоцитов [13]. В процессе опухолевой прогрессии, при угнетении или отсутствии киллер-
ного эффекта T-лимфоцитов, деструкция трансформированных клеток может осуществляться за счет цитотоксичности, опосредованной гуморальными антителами [1]. Роль гуморальных антител в противоопухолевой защите, по данным литературы, противоречива. В некоторых работах показано, что противоопухолевые антитела содействуют прогрессивному росту опухоли, в других - выявлено их защитное действие.
Так, по данным отечественной литературы показано, что тенденция к увеличению продукции противоопухолевых антител характерна для пациентов, у которых не удалось достичь клинического эффекта на фоне проведения вакцинотерапии [15], а по данным зарубежных авторов выявлено наличие прямой корреляции между величиной сывороточных IgM и IgG к ОАА и уровнем общей и безрецидивной выживаемости пациентов в ходе вакцинотерапии [18]. Ряд авторов показали, что у больных меланомой в процессе иммунотерапии обнаруживаются антитела против тиреоглобулина, ядерного белка [17], углеводных антигенов, белка TA 90 [18], которые имеют прогностическое значение.
В процессе противоопухолевой вакцинотерапии в сыворотке крови больных меланомой могут образовываться антитела против антигенов, которые экспрессируются в клетках, используемых для вакцины. Изучение гуморального иммунного ответа у больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии представляет несомненный интерес в исследовании механизмов «ухода» опухоли от иммунологического надзора при мониторинге больных меланомой с целью прогноза заболевания и иммунологической оценки эффективности проводимой противоопухолевой терапии.
Цель нашего исследования - выявление образования противоопухолевых антител в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками, нагруженными опухолевым лизатом, и вакциной «Мелавак» на основе аллогенных генно-модицифированных опухолевых клеток.
Материалы и методы
Материалом для исследования служили образцы сывороток крови 26 больных диссеминированной меланомой, которые после хирургического удаления опухоли получали вакцину на основе аутологичных дендритных клеток, образцы сывороток крови 9 больных диссеминированной меланомой, которые после хирургического удаления опухоли получали вакцину «Мелавак». В качестве контроля использовались образцы сывороток крови 9 больных меланомой без вакцинотерапии и образцы сывороток крови 6 здоровых доноров.
В качестве лечебного препарата применялась противоопухолевая вакцина на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом in vitro [16].
Также в качестве лечебного препарата применялась противоопухолевая вакцина «Мелавак» на основе аллогенных опухолевых клеток метастатической линии меланомы человека, трансфицированной геном ГМ КСФ.
Оценка связывания IgM и IgG антител проводилась методом РИФ и методом ФИЦХ с использованием поликлональных антител против человеческих иммуноглобулинов IgG, конъюгированных с FITC (Goat F(ab )2 ANTI HUMAN IgG:FITC) и поликлональных антител против человеческих иммуног-
лобулинов IgM, конъюгированных с PE (Goat F(ab)2 ANTI HUMAN IgM:PE) («Serotec», Германия).
Для проведения РИФ и ФИЦХ использовались клеточные линии меланомы человека mel Kor и mel Ibr, различающиеся экспрессией молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов. Результаты оценивали по уровню и частоте экспрессссии антиген-положительных клеток.
Реакция непрямой иммунофлуоресценции
Клеточные линии меланомы человека mel Kor и mel Ibr культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 2mM глутамина, антибиотики (100 МЕ/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
5*105 клеток mel Kor и mel Ibr инкубировали с 20 мкл образцами сыворотки крови пациентов и доноров в разведении 1:50 в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего 10 мин отмывали в 1 мл фосфатно-солевого буфера при 1500 об/мин. К осадку клеток добавляли 20 мкл вторичных поликлональных антител против человеческих IgG, конъюгированных с FITC, либо 10 мкл поликлональных антител против человеческих IgM, конъюгированных с PE, и инкубировали в течение 30 мин при 4 °С. После этого клетки дважды отмывали в 1 мл фосфатно-солевого буфера в тех же условиях, осадок клеток ресуспендировали в 200 мкл 1%-ного р-ра формалина и анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Beckton Dickinson, США).
Флуоресцентный иммуноцитохимический анализ
Подготовка опухолевых клеток к иммуноцитохимическому анализу Для экспериментов клетки меланомы линщ mel Kor и mel Ibr использовали при конфлюентно-сти 70-80 %. Клетки промывали 2 раза в холодном PBS и осаждали на стекла с помощью цитоцентрифуги. Полученные стекла с осажденными клетками хранили при -20 °С не более 2 нед.
Проведение флуоресцентного иммуноцитохимического анализа Клетки фиксировали в 96%-ном C2H5OH в течение 5 мин, затем в 100%-ном ацетоне - 3 мин. Препарат инкубировали в течение 10 мин в фосфатно-солевом буфере, содержащем 5% бычьего сывороточного альбумина для забивки неспецифического связывания. Затем клетки инкубировали с сыворотками крови больных в разведении 1:10 в течение 18 ч при температуре 4 °С.
В качестве вторичных антител использовали таковые против IgG и IgM человека, меченые FITC и PE, соответственно. Препарат докрашивали Hoechst-33258 (2 мкг/мл). Препарат анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon 80i (Япония) при увеличении 400*.
Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью пакета программ EXCEL 2003, STATISTICA 6.0.
Результаты и обсуждение
В ходе исследования выявлено неспецифическое связывание IgM- и IgG-антител в образцах сыворотки крови больных и здоровых доноров методом непрямой РИФ. Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1
Результаты определения специфических ^М в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии, (М ± т), %, РИФ_____________________________________________________
Группы пациентов п АГ+ к-к в mel Kor, (%) п АГ+ к-к в mel Ibr, (%)
Срок лечения
До В ходе До В ходе
1. Дендритная вакцина (п=26) 9,4±1,6 9,0±1,4 5,7±2,0 4,9±1,9
2. Вакцина «Мелавак» (п=9) 6,0±1,6 5,7±2,3 7,0±3,0 6,8±2,2
3. Контрольная группа 1* (п=9) 9,6±2,9 5,6±1,2
4. Контрольная группа 2** (п=6) 4,1±0,7 3,5±0,5
*больные меланомой без вакцинотерапии **здоровые доноры
Таблица 2
Результаты определения специфических в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой
в процессе вакцинотерапии, (М ± т), %, РИФ_________________________________________________________
Группы пациентов п АГ+ к-к в mel Kor, (%) п АГ+ к-к в mel Ibr, (%)
Срок лечения
До В ходе До В ходе
1. Дендритная вакцина (п=26) 3,6±2,2 3,5±2,5 4,5±2,3 4,8±3,1
2. Вакцина «Мелавак» (п=9) 1,1±0,6 1,8±0,9 1,1±0,9 1,2±0,7
3. Контрольная группа 1* (п=9) 2,8±0,5 6,1±1,4
4. Контрольная группа 2** (п=6) 0,8±0,5 0,9±0,6
*больные меланомой без вакцинотерапии **здоровые доноры
Таблица 3
Результаты определения специфических ^М в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии, (М ± т), %, ФИЦХ____________________________________________________
Группы пациентов п АГ+ к-к в mel &г, (%) п АГ + к-к в mel Ibr, (%)
Срок лечения
До В ходе До В ходе
1. Дендритная вакцина (п=20) Не обнаружено Не обнаружено
2.Вакцина «Мелавак» (п=9) (п=7) 2+, 40% 2+, 70% (п=7) 2+, 40% 2+, 60%
3. Контрольная группа 1* (п=9) Не обнаружено Не обнаружено
4. Контрольная группа 2** (п=6) Не обнаружено Не обнаружено
*больные меланомой без вакцинотерапии **здоровые доноры
Таблица 4
Результаты определения специфических ]£в в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой в процессе вакцинотерапии, (М ± т), %, ФИЦХ__________________________________________________________
Группы пациентов ***ИО, % АГ+ к-к в mel ^г, (%) ИО, % АГ+ к-к в mel Ibr, (%)
Срок лечения
До В ходе До В ходе
1. Дендритная вакцина (п=20) Не обнаружено Не обнаружено
2.Вакцина «Мелавак» (п=9) (п=4) 1+, 20% 1+, 40% Не обнаружено (п=1) 1+, 30%
3. Контрольная группа 1* (п=9) (п=2) 1+, 20% Не обнаружено
4. Контрольная группа 2** (п=6) Не обнаружено Не обнаружено
*больные меланомой без вакцинотерапии **здоровые доноры ***ИО - интенсивность окрашивания
28 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ...
Как следует из табл. 1, был выявлен небольшой процент антиген-положительных клеток, реагирующих с сывороткой крови доноров и больных. Однако эти результаты следует рассматривать как неспецифические, так как линии клеток являются мономорфными, и при специфической реакции нужно было ожидать 100%-ную экспрессию антигенов. Это заключение подчеркивают результаты определения ^О-антител (табл. 2), при которых специфическая реакция в сыворотке крови здоровых доноров и в образцах сыворотки крови больных до и в ходе лечения отсутствовала.
Таким образом, специфических ^М и ^О-антител против поверхностных антигенов меланомы в образцах сыворотки крови вакцинированных больных диссеминированной меланомой методом непрямой РИФ выявлено не было.
Было проведено исследование наличия антител против цитоплазматических антигенов в сыворотке крови больных методом ФИЦХ (табл. 3 и 4).
Как следует из табл. 3 в образцах сыворотки крови здоровых доноров, больных меланомой без вакцинотерапии и больных, получавших дендритную вакцину, реакция с клетками те1 Ког была отрицательной. Однако положительная реакция IgM-антител с этими клетками выявлена в образцах сыворотки крови у 7 из 9 больных меланомой, получавших вакцину «Мелавак». Антитела обнаруживались после первой вакцинации (рис. 1; см. вклейку). Обнаружена отрицательная реакция с клетками mel 1Ьг ^М-антител в образцах сыворотки крови доноров и больных меланомой, получавших дендритную вакцину и положительная реакция ^М-антител в образцах сыворотки крови у 7 из 9 больных меланомой, получавших вакцину «Мелавак» (рис. 2).
Как следует из табл. 4, была выявлена положительная реакция специфических ^О-антител с клетками mel Ког в образцах сыворотки крови у 4 из 9 больных меланомой, получавших вакцину «Мелавак» (рис. 3) и у 2 из 9 больных меланомой без вакцинотерапии.
Положительная реакция ^О-антител с клетками те1 1Ьг была обнаружена только в одном из 9 образцов сыворотки крови больных меланомой, получавших вакцину «Мелавак». Было выявлено 30% антиген-положительных клеток (рис. 4).
Таким образом, при флуоресцентном имму-ноцитохимическом исследовании было обнаружено появление специфических антител против мела-номных антигенов в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой, получавших вакцину «Мелавак». В процессе вакцинотерапии количество антиген-положительных клеток увеличилось.
Заключение
Было проведено исследование по изучению гуморального иммунного ответа у больных с диссеминированной меланомой, получавших вакцину на основе аутологичных дендритных клеток, нагруженных опухолевым лизатом и у больных с диссеминированной меланомой, получавших вакцину на основе аллогенных генномодицифированных опухолевых клеток - «Мелавак».
На основании полученных данных, в образцах сыворотки крови вакцинированных больных с меланомой методом непрямой РИФ не было обнаружено иммуноглобулинов, способных специфически распознавать поверхностные меланомные антигены. Однако выявлено наличие специфических противоопухолевых антител в сыворотке крови больных диссеминированной меланомой при вакцинации вакциной «Мелавак» методом ФИЦХ. Окрашивание наблюдалось в цитоплазме меланом-ных клеток.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы в рамках научно-
технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний»
Литература
1. Агеенко А.И., Гордиенко С.П., Саканделидзе О.Г. Иммунитет и терапия экспериментальных опухолей. - Кишенев: Штиница, 1982. - 310 с.
2. БалдуеваИ.А. Противоопухолевые вакцины // Практическая онкология. - 2003. - Т.4, №3. - С. 157-66.
3. Барышников А.Ю. Противоопухолевые вакцины // Материалы Всероссийской научно-практической конференции. РБЖ. - 2002. - Т. 1, № 2. - С. 12-4.
4. Барышников А.Ю. Принципы и практика вакцинотерапии рака // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. - 2004. - Т. 2. - С. 59-63.
5. Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник Московского онкологического общества. - 2008. - Т. 1. - С. 6-10.
6. Моисеенко В.М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи // Практическая онкология. - 2001. - Т. 8, № 4. - С. 58-64.
7. Манина И.В., Перетолчина Н.М., Сапрыкина Н.С. и др. Доклинические исследования иммунотерапии меланомы кожи с помощью цельноклеточных противоопухолевых вакцин, секретирующих GM-CSF // РБЖ. - 2010. - № 3. - С. 14-9.
8. Михайлова И.Н., Демидов Л.В., Барышников А.Ю. и др. Клинические испытания аутологичной вакцины на основе опухолевых клеток, модифицированных геном tag-7 // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - № 1 (13). - С. 23-7.
9. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы - основа для создания противоопухолевых вакцин // Вестник РАМН. - 2005. - № 7. - С. 37-40.
10. Михайлова И.Н., Петенко Н.Н., Чкадуа Г.З. и др. Вакцинотерапия метастатической меланомы с использованием дендритных клеток: клиническое исследование I/II фазы // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - № 2 - С. 39-43.
11. Михайлова И.Н., Иванов П.К., Петенко Н.Н. и др. Внутрикожная клеточная реакция на фоне вакцинотерапии меланомы кожи // Российский биотерапевтический журнал. - 2010. - Т. 9, № 1. - С. 63-7.
12. Михайлова И.Н., Парсункова К.А., Евсегнеева И.В. и др. Динамика цитокинов у больных с диссеминированной меланомой в ходе вакцинотерапии аллогенными опухолевыми клетками // РБЖ. - 2010. - Т. 8, № 4. - C. 13-6.
13. ПетровР.В. Иммунология. - М.: Медицина, 1987. - 415 с.
14. ПетровРВ., ХаитовР.М., МанькоВМ., МихайловаА.А. Контроль и регуляция иммунного ответа. - Л.: Медицина. - 1981. - 311 с.
15. Суровцева М.А., Шишков А.А., Селедцова Г.В., Козлов В.А. Клинико-иммунологическая эффективность вакцинотерапии при диссеминированной меланоме кожи // Сибирский онкологический журнал. - 2009. - № 6 (36). - С. 12-8.
16. Чкадуа Г.З., Заботина Т.Н. и др. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения // РБЖ. - 2002. - Т. 1, № 3. - С. 56-9.
17. BouwhuisM.G., ten Hagen T.L., Eggermont A.M. Immunologic function as... // Mol. Oncol. - 2011. - 5. - P. 183-9.
18. Chung, M.H., HsuehE. et al. Humoral immune response to. and sentinel lymphadenectomy//J. Clin Oncol. - 2003. - 21. - Р. 313-9.
