CC BY
13УДК 612.015.13: 616-056.3
ВЫЯВЛЕНИЕ ЛИТИЧЕСКОГО ФАКТОРА У ШТАММОВ МИКРОМИЦЕТОВ
- ПРОДУЦЕНТОВ АЛЛЕРГЕНОВ
Журавлева Н.П. (в.н.с.)*, Елинов Н.П. (проф. кафедры), Васильева Н.В. (директор института), Босак И.А.
(н.с. лабораторный миколог)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Приведены результаты собственных исследований и обзор специальной литературы по вирусам грибов - патогенов для растений и человека. Разработаны определенные условия для выявления литического эндофактора у штаммов микромицетов
- продуцентов аллергенов: Alternaria alternata, Aspergillus fumiga-tus, A. niger и A. clavatus.
Наряду с контрольными штаммами Fusarium javanicum var. radicicola, содержащими миковирус, нами симптоматически установлено наличие в них эндовируса.
Во избежание спонтанного освобождения от вирусных части, изучаемых грибов, входящих в банк производственных культур -продуцентов аллергенов, даны рекомендации по условиям их хранения.
Ключевые слова: аллергены, вирусы грибов - продуцентов аллергенов и патогенов для человека, миковирусы
REVEAL OF LYTIC FACTOR IN MICROMYCETES’ STRAINS - ALLERGENO-PRODUCENTS
Zhuravleva N.P. (leading research collaborator), Yelinov N.P. (professor of the chair), Vasilyeva N.V. (director of institute), Bosak I.A. (laboratory mycologist)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, North-Western State Medical University named after 1.1. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective authors, 2013
Own data of investigation and review of scientific literature over mycoviruses of fungi - pathogens for plants and man brought in this article. Worked out definite conditions for reveal of a lytic endofactor in strains ofmicromycetes - allergenoproducents: Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, A. niger and A. clavatus at the same time with
* Контактное лицо: Журавлева Нина Петровна,
Тел.: (812) 303-51-40
strains of Fusarium javanicum var. radicicola in the control containing mycovirus, we have established the presence endovirus in them symptomatically.
To avoid of spontaneous release of viral particles out of studied fungi included in bank of industrial cultures - allergenoproducents. We have recommended some conditions their keeping.
Key words: allergens, fungal viruses in micromycetes - allergenoproducents and human pathogens
ВВЕДЕНИЕ
Открытие фитопатогенных грибов с двунитевой РНК обеспечило возможность для широкого развертывания исследований на «невспаханном поле грибной вирусологии». На сегодняшний день список фитопатогенных микромицетов, содержащих миковирусы, значительно пополнился - он включает более 90 видов, а в 2008 году число их составляло лишь около 50. Работы по миковирусам патогенных грибов для человека немногочисленны. В Нидерландах в 1997 г. (Van Diepeningen A.D., Debets A.J.M., et.al.) был выделен миковирус из госпитального штамма Aspergillus niger, но генезис этих штаммов остается неизвестным. В 1999 г. нами выделен миковирус из патогенного для человека гриба Fusarium javanicum var. radicicola и исследован его геном с ds-PHK молекулярной массы 10 кЬ. Вирус имеет икосаэдрическую форму двух размеров: I тип - диаметром 20-25 нм и II тип - 53 нм, и в ультратонких срезах мицелия обнаружен в виде электронноплотных частичек, локализующихся в цитоплазме и вакуолях клеток гриба [1, 2].
Позже появились сообщения о других немногих изолятах микромицетов, патогенных для человека, содержащих миковирус, но на самом деле генезис их также неизвестен [3].
Жданов В.М. в 1999 г. привел классификацию вирусов с двунитевой РНК, содержащихся в грибах:
I группа - вирусы с линейной непрерывной РНК;
II группа - вирусы с двумя сегментами РНК (бипар-титные); III группа - трехсегментные вирусы (три-партитные); IV группа - монопартитные (бисегмент-ные). Также отмечены дрожжевые киллеры, представляющие собой двунитевую РНК без белковых оболочек. I и II группы выделены в самостоятельные семейства - Totiviridae и Partitiviridae.
В последние годы был обнаружен новый четырех-фрагментный вирус ds-PHK из фитопатогенных грибов Verticillium daliaeuRosillina necatrix [4,5]. Новые вирусы в классификации заняли особое место в сравнении с другими вирусами, их отнесли к семейству хризовирусов (Chryzoviridae). На IX совещании Интернационального комитета по таксономии вирусов (ICTV) San Diego, (СА) на сегодняшний день миковирусы с ds-PHK объединены в 7 семейств [6].
Известно, что вирусы фитопатогенных грибов имеют размер 20-50 нм и, как правило, икосаэдрическую форму [7]. Эти рибонуклеиновые частицы с сегментированным геномом и преимущественно с двунитевой РНК (ds-PHK), находящейся внутри белкового капсида. Это Fusarium
gmminearum, F. роае, Saccharomyces, Pleurotus ostreatus, Helicobasidium mompa [8, 9], а также Rhizopus stolonifer, R. microsporum, R. oryzae; Alternaria alternata, Aspergillus sp.; секции Circumdati и Fumigati; Mucor sp.; Aspergillus fumigatus, A.leporis, A. petrakii, A. primulines; Cryptonectria parasitica, Sclerotinia sclerotiorum, S.sol; Valsa ceratosperma [3, 10-12]. Однако известны фитопатогенные грибы, такие как Agaricus bisporus, Sclerophthora macrospora и Pleurotus ostreatus, чей геном миковируса состоит из единственной линейной нити РНК (ss-PHI<) [13]. При этом редко, но описывают грибы, геном вируса которых представлен двунитевой ДНК (ds-ДНК). К ним относят Rhizidiomyces и Rizoctonia solani. Пределы колебаний м.м. ds-PHK вирусов зависят от рода, вида и штамма гриба: с мелким сегментом - 0,6 кило баз (кЬ) - у Petromyces alliaceous, 1,4 кЬ - у Botrytis cinerea и с крупным - до 14,8 кЬ - у Rhizopus microsporus.
Миковирус (MB) может влиять на культуральноморфологические свойства гриба-хозяина: изменяются макро - и микроморфология колоний, что сопровождается изменением формы колоний, извилистым или ажурным краем, изменением пигментации воздушного мицелия с последующей утратой его, замедлением роста на агариозваных питательных средах и частичным или полным лизисом мицелия [2]. При оптимальных условиях, обеспечивающих выраженную репродукцию внутриклеточных вирусных частиц, наблюдали патоморфологические изменения в ультраструктуре клетки: возрастание количества вирусных частиц, снижение электронной плотности цитоплазмы, изменение структуры митохондрий, видоизменения оболочки ядра - ее выпячивание или инвагинацию; имелись разрывы и расширенные поры в клеточной стенке с выходом белкового материала на поверхность клетки [2, 14].
В связи с недостаточностью изучения взаимоотношений миковирусов и патогенных грибов, нет однозначного ответа на корреляцию между содержанием MB и метаболитов в клетке «гриба-хозяина», а также влияния MB на вирулентность штаммов грибов и высоких температур - на внутриклеточный MB [2, 8].
Возможности использования ds-PHK MB многообразны. Так, ds-PHK стимулирует образование антител и активирует другие механизмы иммунного ответа против опухолевых заболеваний, также она может быть использована в качестве иммуномодулятора. В середине XX века впервые из гриба Penicil-lium stoloniferum был получен статолон - вещество, обладающее антивирусной и интерферон-индуци-рующей активностью. В начале XXI века интерес к миковирусу возник вновь в связи с поиском новых природных иммуномодуляторов.
В медицинской практике применяют природный индуктор интерферона - ридостин - лекарственный препарат, содержащий ds-PHK в киллерных штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Ридостин характеризуется низкой токсичностью, высокой интерфе-
роногенностью и широким спектром антивирусной активности, перспективен в клинической практике: при гриппе, ОРВИ, бешенстве, энцефалитах, герпесе.
Мы неоднократно акцентировали внимание специалистов на том факте, что штаммы бактерий и грибов содержат внутриклеточные вирусные частицы, без заражения извне, и в неблагоприятных условиях выделяют вирус во внешнюю среду. Штаммы микроорганизмов обычно устойчивы к лизису собственным внутриклеточным вирусом. Но, при определенных условиях среды, внутриклеточный вирус накапливается в значительном количестве, проявляя склонность к изменчивости и вирулентности. Мутантные формы внутриклеточного вируса способны лизировать культуру - хозяина. Это проявление вируса опасно для микроорганизмов - продуцентов различных метаболитов у промышленно-важных культур, а также для таксономистов и для хранителей музейных коллекций бактерий и микромицетов, т.к. под влиянием вируса происходят изменения макро - и микроморфологии и ультраструктуры, которые являются критериями идентификации рода и вида используемых штаммов.
С учётом вышесказанного, изучение миковирусов и их взаимоотношений с «грибами - хозяевами» имеет большое значение для фундаментальных и прикладных исследований, включая медицинскую практику.
В отличие от известных на сегодняшний день фитопатогенных вирусов, нами изучен, неизвестный ранее, внутриклеточный вирус гриба йшггшга /д-уатсит уаг. radiciola (Е].\.г) патогенного для человека [2]. Этот микромицет включен в наш банк культур продуцентов - аллергенов. Для производственных штаммов этого гриба подобраны условия хранения, предохраняющие его от лизиса внутриклеточным вирусом.
Цель настоящего исследования - выявить наличие миковируса у ряда микромицетов, патогенных для человека, входящих в банк культур - продуцентов аллергенов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования послужили селекционированные штаммы микромицетов, включенные в банк культур - продуцентов аллергенов, созданных нами ранее. Для выявления миковируса (МВ) были отобраны 4 культуры из этих грибов. Название родов, видов и номера штаммов представлены в таблице 1.
Изначально генезис культур был различен: А. т-ger выделен из промывных вод бронхов больной аллергическим бронхолегочным аспергиллезом; А. /м-migatus - от больного эмпиемой плевры; А. с1сп’а1ин поступил из Ботанического института РАН им. В.Л. Комарова - происхождение неизвестно; А. акегпа1а выделен из мокроты больного бронхитом; контроль к опыту (Е )ауатсит уаг. radicicola) - с руки больной, пораженной этим грибом и с доказанным нами ра-
Таблица 1
Лизис мицелия при хранении селекционированных штаммов грибов - продуцентов аллергенов
№ п/п Наименование микромицета № штамма Срок хранения (мес.) Название среды
Сабуро с 4% глюкозы Сусло -агар
887/30/24 3 + -
887/30/24 7 +++ -
1 Mternaria 887/30/26 3 + -
1 alternate 7 +++ -
887/30/54 3 + -
7 +++ +
Чапек-Докса
967/10/7 3 + -
967/10/7 7 + _
2 Aspergillus 967/10/42 3 + -
niQBf 967/10/42 7 + -
967/10/72 3 + +
967/10/72 7 + +
275/72/31 3 + -
э Aspergillus 275/72/31 7 + -
j clavatus 275/72/75 3 + -
275/72/75 7 + -
157/30 3 - -
л Aspergillus. 157/30 7 + -
ч- fumigatus 157/87 3 - -
157/87 7 - -
Сабуро с 4%
глюкозы
69/9/6 1 + +
69/9/6 3 +++ +
69/9/33 1 ++ +
69/9/33 3 ++ +
Fusarium 69/9/37 1 + +
5 javanicum var. radicicola 3 +++ +
69/9/33/40 1 + +
3 ++ +
69-3-ВЧ 1 + +
3 ++ +
69 музейный 1 +++ ++
69 музейный 3 ++++ ++
Условные обозначения:
+ + + + - слившиеся негативные колонии миковируса (н.к.МВ)
+ + + много н.к.МВ
+ + единичные н.к.МВ по всей поверхности косяка + редкие н.к.МВ - н.к.МВ отсутствуют
нее содержанием внутриклеточного вируса [2]. Затем из популяций этих культур были селекционированы штаммы с маркерами типичности морфологии колоний и интенсивности прорастания спор [15-17].
Для выявления МВ использовали несколько этапов:
1-й этап - выявление зон лизиса на штаммах при хранении их на косяках с использованием агаризо-ванных сред: Чапека Докса с 2% глюкозы, вместо сахарозы (модифицировано нами), Сабуро с 4% глюкозы и сусло-агара в течение 1, 3, 7 месяцев.
2-й этап - выявление зон лизиса на гигантских колониях штаммов с использованием сусло-агара и пептонно-кукурузного агара с варьированием концентрации агара (к.а) и pH сред, а также способов засева грибов на питательные среды.
3-й этап - для провокации МВ использовали жидкие среды: Сабуро с дрожжевым экстрактом и без него, а также сусла. Для этого был избран штамм
А. акегпа1а №887/38/30/54, дававший большие зоны лизиса газона гриба, в сравнении с другими опытными культурами.
4-й этап - для перевиваемости МВ А. акетсПа использовали газон индикаторной к нему собственной культуры на агаризованном сусле с дрожжевым экстрактом и без него.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В связи с всё расширяющимся спектром открытий новых вирусов фитопатогенных микромицетов назревает интерес к миковирусам патогенных грибов для человека, а в нашем случае, и входящих в банк культур - продуцентов аллергенов.
На I этапе исследовали литическое действие (АД) внутриклеточного МВ при хранении штаммов микромицетов, которые приведены в таблице №1.
Как видно из этой таблицы, на стандартных средах для роста и хранения культур АД МВ проявились в виде негативных колоний (н.к.) в зависимости от срока хранения и от штамма. Так, на газоне штаммов А. акегпа1а через 3 месяца наблюдали редкие н.к., а через 7 месяцев - много н.к. На сусло-агаре у всех штаммов, кроме одного, н.к. отсутствуют. На газоне А. niger и А. с1ара1ия на всех штаммах отмечены редкие н.к., на сусло-агаре только на газоне одного штамма А. niger - редкие н.к. На газоне А. fumigatus как на агаре Чапека-Докса, так и на сусло-агаре н.к. отсутствовали, кроме одного штамма, в результате 7 месяцев хранения на среде Чапека-Докса.
У контрольной культуры Ешапит )ауатсит уаг. гас1тсо1а на среде Сабуро АД МВ проявлялось у всех штаммов также, в зависимости от срока хранения, но на много раньше: 1 месяц - редкие н.к., 3 месяца - много н.к.; все штаммы проявляли АД МВ по-разному. На сусло-агаре на газоне контрольной культуры у всех штаммов отмечали редкие или единичные н.к. (табл.1). На музейном штамме Е).у.г. ли-тические действия МВ проявлялись сильнее. Так, на агаре Сабуро через месяц - много н.к., через 3 месяца - слившиеся н.к. в виде зон лизиса; на сусло-агаре - единичные н.к. как через 1 месяц, так и через 3 месяца.
На II этапе выявления зон лизиса на гигантских колониях 5 культур микромицетов на сусло-агаре получены следующие результаты (Рис. 1: гигантские колонии селекционированных штаммов (с.ш.) некоторых микромицетов - продуцентов аллергенов на сусло-агаре (с.а.) и проявление литического действия (АД) вирусных частиц (ВЧ) в зависимости от концентрации агара (к.а.) и pH среды).
На рис. 1.1. представлены колонии гриба Е)л>.г. в контрольном и опытном вариантах.
Рис. 1.1.а - колония на среде с концентрацией агара (к.а.) 2,0% и pH 6,5 имеет полноценный рост, покрыта войлочным мицелием розовато-фиолетового цвета, н.к. отсутствуют или очень редкие (-; +)
- контроль.
Рис. 1.1.6 - колония с к.а. 1,4%, pH среды 4,5, име-
а б
Рис. 1.1. Колонии £ }татсит мах. тсИско1а: а-контроль: к.а. 2,0%, pH 6,5; 6 - опыт: к.а. 1,4%, pH 4,5 (фото уменьшено в 1,25 раза)
а б в
Рис. 1.2. Колонии А. сЬуЫиъ: а - контроль: к.а. 2,0%, pH 6,5; б - опыт: к.а. 1,4%, pH 8,5; в - опыт: к.а. 1,4%, pH 4,5
а
ется измененный рост, более плоская с беловато-розоватым воздушным мицелием (вМ), край звездчатый, ажурный — с лизированным мицелием, по всей поверхности - много н.к. (+++) — опыт.
На рис. 1.2. - колония гриба А. с1маШ$: контроль и опыт.
Рис. 1.2.а - колония на среде с к.а. 2,0%, pH 6,5, хорошо выражена с радиальной складчатостью по краю, мицелий войлочный беловато-сероватого цвета, мицелий плотно врастает в агар, н.к. отсутствуют (-) - контроль.
в
Рис. 1.2.6 - к.а. 1,4%, pH 8,0, рост колонии с некоторыми изменениями в сравнении с контролем: край колонии звездчатый, вМ в центре колонии — лизиро-ваннмй, из слившихся н.к. (++++) — опыт.
Рис 1.2.в — к.а. 1,4%, pH 4,5, диаметр колонии в 1,5 раза меньше, чем в контроле, край ажурный с множеством н.к. (+++) и единичными н.к. по всей поверхности (++) — опыт.
На рис. 1.3 - колонии микромицета А. fumigatus.
Рис.1.3.а - колония с к.а. 2,0%, pH 6,5 - ровная, войлочная, серовато-зеленого цвета. В центре колонии
б
Рис. 1.3. Колонии А. (ит!даШ: а - контроль: к.а. 2,0%, pH 6,5; б - опыт: к.а. 1,4%, pH 8,5; в - опыт: к.а. 1,4%, pH 4,5
Рис. 1.4. Колонии А. п1дег: а - контроль: к.а. 2,0%, pH 6,5; 6 - опыт: к.а. 1,4%, pH 8,5; в - опыт: к.а. 1,4%, pH 4,5
б
Е
а
вМ темно-зеленого цвета, н.к. отсутствуют (—) — контроль.
Рис.1.3.6 - колония с к.а. 1,4%, pH 8,5 - опушенная, со слабым лизисом вМ, в центре светло-зеленого цвета, н.к. очень мелкие, редкие по всей колонии (+) - опыт.
Рис. 1.3.в - колония с к.а. 1,4%, pH 4,5 - опушенная, но край неровный, ЛД ВЧ проявилось в центре колонии в виде слившихся н.к. и сплошного лизиса (++++) - опыт.
На рис. 1.4. - колонии гриба А. т£ег.
Рис. 1.4.а - к.а. 2,0%, pH 6,5, колония крупная 5 см в диаметре пушистая, обильно спороносящая, вМ черного цвета, н.к. отсутствуют (-) - контроль.
Рис. 1.4.6 - к.а. 1,4%, pH 8,5. Отличие от роста в контроле — наличие редких н.к. на поверхности ко-
6
лонии (+) — опыт.
Рис. 1.4.в - к.а. 1,4%, pH 4,5, колония белого цвета. ЛД ВЧ проявились ввиде изъеденного края ввиде ажурности и множестве .мелких н.к. по всей поверхности колонии (+++) - опыт.
На рис. 1.5. - колонии гриба Л. акетаЬа.
Рис. 1,5а - к.а. 2,0%, pH 6,5, колония войлочная оливково-черного цвета, н.к. отсутствуют (—) — контроль.
Рис. 1.56 - к.а. 1,4%, pH 4,5, в отличие от контроля - колония радиально-складчатая, вМ более светлого цвета, край изъеденный, вся колония ажурная, за счет множества мелких н.к. по всей поверхности колоний (+++), вокруг центра лизированная зона вМ (++++).
На II этапе выявления лизиса в гигантских ко-
Рис. 1.5. Колонии А. аИ&псЛа: а - контроль: к.а. 2,0%, pH 6,5; 6 - опыт. к.а. 1,4%, pH 4,5
а б в
Рис. 2.1. Колонии Яшалиту. V. г.: а - контроль: агар Сабуро с 4% глюкозы, к.а. 2,0%, pH 6,5; б - опыт: ПКА - к.а. 1,4%, pH 4,5; в - опыт: газон ПКА - к.а. 1,4%, pH 4,5 (фото уменьшено в 1,25 раза)
а б
Рис. 2.2. Колонии Alternaria alternate: а - контроль: а rap Сабуро с 4% глюкозы, к.а. 2,0%, pH 6,5; б - опыт: ПКА - к.а. 1,4%, pH 4,5
а б
Рис. 2.3. Колонии Aspergillus clavatus: а - контроль: агар Чапека-Докса с глюкозой, к.а. 2,0%, pH 6,5; б - опыт: ПКА - к.а. 1,4%, pH 4,5
а б
Рис. 2.4. Колонии А. niger-.г - контроль: агар Чапека-Докса с глюкозой, к.а. 2,0%, pH 6,5; б - опыт: ПКА - к.а. 1,4%, pH 4,5
а б
Рис. 2.5. Колонии Л. /ит/доГи5: а - контроль: к.а.
в - опыт; газон ПКА
лониях и газонах 5 культур грибов был также использован пептонно-кукурозный агар в сравнении с контрольными средами для каждой культуры (Рис.2: гигантские колонии и газоны селекционированных штаммов (с.ш.) некоторых микромицетов — продуцентов аллергенов на пептонно-кукурузном агаре (11КЛ) и проявление литического действия (ЛД) вирусных частиц (ВЧ) в зависимости от к.а. и pH среды в сравнении с употребляемыми контрольными средами для хранения культур).
Так, на рис. 2.1 представлены колонии микроми-цета Е/.у.г.в контроле и опыте.
Рис. 2.1.а - агар Сабуро, к.а. 2,0%, pH 6,5, колония
7 см в диаметре (с1), слегка выпуклая, опушенная, вМ розоватого цвета. Край слегка звездчатый. Реверзум желтого цвета, н.к. очень мелкие и редкие (+) - контроль.
Рис. 2.1.6 - к.а. 1,4%, pH 4,5, колония небольшого размера, 4,5 см в с!, н.к. крупные и много по всей колонии (+++), по краю слившиеся, образующие небольшие зоны лизиса (++++) — опыт.
Рис. 2.1.в - к.а. 1,4%, pH 4,5, газон ажурный, из слившихся н.к., образует пятна лизиса мицелия (++++) - опыт.
На рис. 2.2 - колония гриба А. акетаЬа.
Рис. 2.2.а - к.а. 2,0%, pH 6,5, колония до 7 см в с1, опушенная с вМ черного цвета. Край звездчатый, реверзум темно-коричневый, н.к. по краю колонии редкие (+), слегка заметные - контроль.
Рис.2.2.б - к.а. 1,4%, pH 4,5, колония 7 см в с1, опушенная, вМ черного цвета, по краю более светлый, край ажурный, из слившихся н.к., образует зоны лизиса мицелия (++++) - опыт.
Рис. 2.3 - колония гриба А. с1ауаШз.
Рис.2.3.а - к.а. 2,0%, pH 6,5, колония 4 см в 11, слегка выпуклая с бархатистым вМ белого цвета, край фестончатый. Реверзум желтого цвета, н.к. МВ отсутствуют (-) - контроль.
Рис. 2.3.6 - к.а. 1,4%, pH 4,5, колония 1,5 с.м в <1, бархатистая с белым вМ, край ажурный из слившихся н.к., образует зону лизиса (++++), по поверхности всей колонии - редкие н.к. (+) — опыт.
На рис.2.4 - колония А. niger.
Рис. 2.4.а - к.а. 2,0%, pH 6,5, колония 7 см в с1, ради-
2,0%, pH 6,5; б - опыт: ПКА - к.а. 1,4%, pH 4,5;
-к.а. 1,4%, pH 4,5
ально-складчатая, вМ черного цвета, по краю белого, реверзум темно-желтого цвета, н.к. редкие, слегка заметные (+) - контроль.
Рис. 2.4.6 - к.а. 1,4%, pH 4,5, колония 4 см в с1, радиально-складчатая, рыхлая, вМ белого цвета по краю и черного - в центре, обильно спороносящий, н.к. по всей поверхности колонии, мелкие, много, край слегка ажурный (+++) - опыт.
На рис. 2.5 - колонии и газон гриба A.fumigatus.
Рис 2.5.а - к.а. 2,0%, pH 6,5, колония 8 см в <1, плоская, центр слегка выпуклый, вМ пушистый, белый, центр зеленоватый. Реверзум светло-желтый, край слегка ажурный со слившимися мелкими н.к. (+++) - контроль.
Рис. 2.5.6 - к.а. 1,4%, pH 4,5, колония опушенная 4 см в с1, вМ беловато-зеленоватый, центр голубоватозеленоватый, край звездчатый, тонкий, н.к. по тонкому краю много (+++) - опыт.
Рис. 2.5.в - к.а. 1,4%, pH 4,5, газон темно-зеленого цвета, опушенный, по всей поверхности, много н.к. единичные и слившиеся (++) и (++++).
На III этапе выявления внутриклеточного вируса при культивировании А. а кет а [а в жидком сусле с дрожжами и без них МВ проявился очень слабо, только на сусле без дрожжей в центре газона тест -культуры выявили редкие н.к. (+).
На IV этапе провокации МВ перевиваемость зоны лизиса на газоне тест культуры А. акегпаШ выявить не удалось, т.к., очевидно, внутриклеточный вирус присутс твует в штамме в очень незначительном количестве.
ОБСУЖДЕНИЕ
Нами исследованы 4 селекционированные культуры микромицетов — продуцентов аллергенов на содержание внутриклеточного миковируса. Для выявления МВ разработаны несколько оптимальных условий и питательных сред как агаризованных, так и жидких.
В результате на I этапе можно отметить, что все испытанные культуры на среде Чапека - Докса и Сабуро проявили ЛД МВ в виде н.к., в большей или меньшей степени активности, в зависимости от штамма, сроков хранения и питательной среды (табл.1).
На II этапе (Рис.1) - наиболее оптимальные условия для провокации внутриклеточного вируса отмечали на сусло-агаре с к.а. 1,4%, pH среды 4,5 на всех испытанных культурах и на контрольном штамме F.j.v.r. На рис.2 на контрольных колониях всех 5 культур на средах Сабуро или Чапек - Докса с к.а.
2,0%, pH среды 6,5 наблюдали редкие н.к. MB. Опытные колонии на пептонно-кукурузном агаре с к.а.
1,4%, pH 4,5, имеют диаметр в 1,5-2,5 раза меньше в сравнении с контрольными колониями. Как правило, у всех опытных колоний АД MB проявляется в ажурном крае из слившихся н.к. (+++), (++++).
Газон контрольного штамма F.j.v.r. на опытной среде с к.а. 1,4%, pH 4,5, со слившимися н.к. образует ажурный газон, проявляя, таким образом, АД MB (++++). При этом, на газоне опытного штамма A. fu-migatus также проявляется литическое действие MB, но слабее, и состоит из большого количества н.к., есть слившиеся (+++).
На III и IV этапах при культивировании A. alternata в жидкой среде (сусло) без добавок дрожжевого экстракта MB проявился на газоне тест-культуры очень слабо. Очевидно, в связи с содержанием небольшого количества внутриклеточного вируса, перевивае-мость его со слабой зоны лизиса выявить не удается. Как отмечено в научной литературе, в плесневых грибах находится, как правило, незначительное количество внутриклеточных вирусных частиц с ds-РНК, и требуется наработка большого количества биомассы для его выделения. Такие частицы у плесневых грибов являются строго внутриклеточными симбиотами и очень редко вызывают инфекцию, т.к. их содержание контролируется хозяином и не превышает определенного низкого уровня.
На основании полученных результатов можно предположить, что изученные штаммы грибов, патогенных для человека, возможно, все содержат вирусные частицы в виде провируса. При создании в эксперименте оптимальных условий для провокации
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Журавлева Н.П., Блинов Н.П., Давыденко С.Г., Васильева Н.В. и др. Вирусный геном в клетках Fusarium javanicum var. radicicola, патогенного для человека//Проблемы медицинской микологии. - 2005. - Т.7, №1. - С. 33-40.
2. Журавлева Н.П., Блинов Н.П., Васильева Н.В. и др. Миковирус в клетках патогенного для человека гриба Fusarium javanicum var. radicicola WB.// Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т.10, №1. - С. 8-15.
3. Aoki N., Moriyama H., et al. A novel mycovirus associated with four double - stranded RNAS affects host fungal growth in Alternaria alternatal/ Virus Res. - 2009. - Vol. 140. - P. 179-187.
4. Yue-fen Cao, Xi-wu Zhu, et al. Genomic characterisation of A. Novel ds - RNA virus detected in the phytopatogenic fungus Verticillium dahliac Kleb //Virus Res. - 2011. - Vol. 159, issue 1. - P. 73-78.
5. Yu-Hsin Lin, Sotaro Chiba, et al. A novel quadropartite ds RNA Virus isolated from a phytopatogenic filamentous fungus, Rosellinia necatrix //Virology. - 2012. - Vol. 426, issue 1. - P. 42-50.
6. KingA.M.Q., Lefkowitz E.M., etal. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Commitee on Taxonomy of Viruses (ICTV). - San Diego, CA: Elsevier Academic, 2011.
7. Hajime Yaegashi. Molecular characterisation of A New hypovirus infection A phytopathogenic fungus, Valsa ceratosperma // Virus Res. - 2012. - Vol. 165, issue 2. - P. 143-150.
8. Yeon - Mee Chu, Jue - Jin Jeon et. al. Double - stranded RNA Mycovirus from Fusarium graminearum // Applied and Environmental Microbiology. - 2002. - P. 2529-2534.
9. Ikeda K., Nakamura H., et al. Dynamics of double - stranded RNA segments in a Helicobasidium mompa clone from a tulip tree plantation // FEMS, Microbiol., Ecology. In Press Corrected proof, Available online 11 November, 2004.
10. Park Seun-Moon, Kim Jung-Mi, et al. Occurrence of dierse ds - PNA in a Korean population of the chestnut bligt fungus, Cryptonectria parasitica // Mycological Research. - 2008. - Vol. 112, issue 10. - P. 1220-1226.
освобождения вируса, он проявляется в виде н.к. и лизированных зон на тест-культурах.
Выявление миковируса у патогенных грибов для человека имеет значение как для фундаментальной науки, так и для мало исследованной области грибной вирусологии, а также медицинской микологии, таксономии, в промышленном использовании продуцентов некоторых грибных метаболитов и для медицинской практики, например, при использовании ds-PHK миковируса как природного индуктора интерферона.
На сегодняшний день актуальна терапевтическая стратегия - «миковирус как агент биологического контроля здоровья макроорганизма».
ВЫВОДЫ
1. Разработаны начальные этапы симптоматического выявления внутриклеточных вирусов у грибов, патогенных для человека, являющихся также продуцентами аллергенов А. акегпМа, А. с1ауМш, А. jumigatus, А. niger. На газоне штаммов этих культур спровоцировано литическое действие мицелия грибов миковирусом в виде негативных колоний и зон лизиса, в сравнении с контролем, ранее открытого нами миковируса гриба У. ]ауатсит уаг. гас1тсо1а.
2. В целях сохранения банка мицелиальных культур - продуцентов аллергенов, содержащих внутриклеточный вирус, необходимо придерживаться, разработанных нами, рекомендаций: 1) применение стандартной питательной среды для каждой культуры с концентрацией агара (к.а.) 2,0%; 2) pH среды 6,0-6,5 и период хранения штаммов не более Зх месяцев при +4 °С; 3) для подстраховки использовать сусло-агар со стандартными условиями (к.а. и pH).
3. Для изучения генома вирусов названных ми-кромицетов - патогенов для человека необходимо проведение молекулярно-биологических исследований.
11. Xie Jiatao. Molecular characterizations of two micoviruses со - infecting A unovirulent isolate of the plant pathogenic fungus Sclerotonia sclerotiorum// Virology. - 2012. - Vol. 428, issue 2. - P. 77-85.
12. Hajime Yaegashi. Molecular characterisation of A New hypovirus infection A phytopathogenic fungus,Valsa ceratosper-ma// Virus Research. - 2012. - Vol. 165, issue 2. - P. 143-150.
13. Hyun. Jue Vn., Dongbin L., Hyun-SookL. Characterization of a novel single - stranded RNA mycovirus in Pleurotus ostrea-tus// Virology. - 2003. - Vol. 314, № 1. - P. 9-15.
14. Журавлева Н.П., Блинов Н.П.и др. Некоторые свойства вирусных частиц Fusarium javanicum var. radicicola WR // Проблемы медицинской микологии. - 2002. - Т.4, №2. - С 56-57.
15. Журавлева Н.П., Васильева Н.В. и др. Спонтанная изменчивость популяций селекционированных штаммов Alter-naria alternata (Fries) Keissler - продуцентов аллергенов// Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т.8, №3.
- С. 17-21.
16. Журавлева Н.П., Чилина Г.А. и др. Спонтанная изменчивость популяций селекционированных штаммов Aspergillus fumigatus Frezenius - продуцентов аллергенов //Проблемы медицинской микологии. - 2009. - Т.11, №2. - С. 36-41.
17. Журавлева Н.П., Васильева Н.В. и др. Спонтанная изменчивость популяций селекционированных штаммов Aspergillus nigerv. Tiegh при многоступенчатой селекции штаммов - продуцентов аллергенов //Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т.13, №4. - С. 32-34.
Поступила в редакцию журнала 15.02.2013
Рецензент: К.Н. Козелецкая
